从含有亚油酸或其酯的混合物制备富 羟基十八碳二烯脂肪酸或其酯的油的方法 本发明涉及一种制备羟基十八碳二烯酸的方法，更具体地说是9-羟基-10，12-十八碳二烯酸和13-羟基-9，11-十八碳二烯酸及其混合物，以及其异构体例如9((R/S))-羟基-10E，12Z-十八碳二烯酸，视情况可以其酯的形式存在，更具体地以其乙酯形式存在。
在以下描述中，羟基十八碳二烯酸称为HODE。
本发明涉及一种通过亚油酸和/或亚麻酸受控氧化并随后进行还原的方法来制备HODE。
本发明还涉及一种从富亚油酸和/或亚麻酸中的三甘油酯或者从以游离脂肪酸形式或以酯或盐形式如乙酯形式存在的亚油酸和/或亚麻酸来制备HODE的方法。
本发明还涉及一种药物，特别是治疗肥胖的一种药物，该药物含有作为活性组分的HODE和在药理上可接受的载体。
本发明还涉及一种含有HODE的食物补充剂，特别是用来治疗肥胖的。
本发明进一步涉及一种含有HODE和化妆美容方面可接受的载体的化妆品，更具体地用来治疗局部超重及其在皮肤表面上造成的后果，例如“桔子皮”皮肤、脂肪瘤和大腿脂肪(steatomery)。
对于在发达国家日益增多的超重和肥胖现象，通常可以接受的解释是由于饮食不当，两者都是由于过量的热量摄入以及在这些摄入地热量中过多的脂肪含量。在其中脂肪大幅度降低的低热量饮食的情况下，这种在饮食中很高的脂肪含量(据估计平均接近于摄入热量的50％)可以降低。
但脂肪不能被减少至低于摄入能量的30％，这不仅因为它们在食物的结构和味感上起着重要的作用，而且因为在饮食中最低的脂肪量是必须的，特别是对于必要脂肪酸和激素的生物合成、以及用于细胞膜更新的磷脂。
因此，几十年来有关治疗肥胖的研究的关键在于选择“好的脂肪”，即不在体内贮存的脂肪，而是用作一种能源。在这种情况下，已经确定的是合成脂肪的脂肪酸的性质在其新陈代谢中起着基本作用。作为例子，短链脂肪酸会比长链脂肪酸产生更多的热。
已经可以检测脂肪酸的链长对能量消耗以及因此对其在体内贮存的直接影响。
本发明的一个目的是发现一种用于调节脂肪细胞的脂肪分解活性的分子，即一种能使贮存在脂肪细胞中的三甘油酯水解成游离脂肪酸和甘油的分子。
已知肾上腺素和咖啡因是两种已知的有脂肪分解作用的分子。具体地说，这些分子能够增高循环的腺苷单磷酸酯(cAMP)的水平，而这是激活脂肪分解的第一步。
因此本发明的一个目的是发现一种分子，该分子刺激脂肪细胞产生cAMP，激活脂肪分解达到超过咖啡因或肾上腺素所能达到的程度。
本发明的另一个目的是由自然界中常见的产品简单有效地合成一种能分解脂肪的分子。
另外，令人惊讶的是，本发明人已经发现羟基十八碳二烯(HODE)脂肪酸的衍生物具有优越的产热特性，不会产生毒性，具体为以游离酸形式或以酯或盐形式存在的9-羟基十八碳二烯酸。
因此本发明涉及一种从含有亚油酸和/或亚麻酸或其酯或盐的油类混合物中获得一种油的方法，这种油富含羟基十八碳二烯(HODE)脂肪酸、具体为9-羟基十八碳二烯酸(9-HODE)或其酯或盐，该方法特征在于，在一种氧化催化剂存在时，进行亚油酸和/或亚麻酸或其酯的受控氧化，当HODE或其酯的总含量至少超过5％和/或9-羟基-10，12-十八碳二烯酸(9-HODE)的异构体或其酯的含量至少超过1.5％时，终止氧化过程，该方法的特征还在于利用一种还原剂还原氧化反应过程中形成的过氧化氢。
起始油类混合物为一种植物油，该植物油含有高于40％重量的、以三甘油酯形式存在的亚油酸和/或亚麻酸，例如玉米油、紫草油、红花油、大豆油、月见草油、葵花油、黑醋粟仁油、麦芽油、大麻油、葫芦籽油或亚麻油。
起始油类混合物是一种油类混合物，该油类混合物含有高于40％重量的亚油酸和/或亚麻酸，优选含有75％的亚油酸乙酯。
在富集后的油中HODE或9-HODE总的最终含量至少分别为5％或1.5％。
优选地，在富集后的油中HODE或9-HODE总的最终含量分别为10-12％和2.2-2.5％重量。
氧化催化剂为铁或铜的卤化物，优选为FeCl3。
还原剂优选为NaBH4。
本发明还涉及由上述方法得到的富羟基十八碳二烯(HODE)脂肪酸或其酯或盐的油。
另外，本发明涉及一种治疗肥胖的药，该药以9-羟基十八碳二烯(9-HODE)脂肪酸或其在药理上可接受的酯或盐作为活性组分，优选以上述所获得的富油的形式存在。
本发明还涉及一种用来治疗肥胖的食物补充剂，该补充剂以9-羟基十八碳二烯(9-HODE)脂肪酸或其在药理上可接受的酯或盐作为活性组分，该活性组分优选以按上述方法获得的富集油的形式存在。
本发明进一步涉及一种治疗肥胖的化妆品，该化妆品以9-羟基十八碳二烯(9-HODE)脂肪酸或其在化妆美容方面可接受的酯或盐作为活性组分，该活性组分优选以按上述方法获得的富集油的形式存在。
按照本发明，羟基十八碳二烯酸(HODE)是通过控制亚油酸和/或亚麻酸的氧化获得的。这些脂酸酸存在于多种植物油中。
例如下述植物油中含有高于40％的、以三甘油酯形式存在的亚油酸：紫草油、红花油、大豆油、月见草油、葵花油、黑醋粟仁油、麦芽油、大麻油、葫芦籽油或亚麻油。
按照本发明的第一种实施方案，HODE可以由富亚油酸和/或亚麻酸的三甘油酯获得。由于使用的是天然的、因而完全适合于口服的植物油，因此这种方法是优越的，但其缺点是明显限制了9-HODE异构体的最终含量。具体地说，亚油酸和/或亚麻酸以三甘油酯形式存在的这一事实限制了氧化作用，这是制备9-HODE的第一步，但最重要的是在天然油内的脂肪酸混合物中大约为40-50％的亚油酸含量限制了9-HODE的最终含量。
起始物质的结构为亚油酸三甘油酯或为下面通式(I)的亚油酸酯：
其中X为三甘油基或Et基(乙基)或其它C1-C6的低级烷基。
这类化合物在9，10位上有一个双键，在12-13位上有一个双键。按照本发明，控制氧化过程产生如下列通式(II)和(III)的化合物：这是9-羟基-10，12-十八碳二烯酸的甘油酯或烷基酯，或这是13-羟基-9，11-十八碳二烯酸甘油酯或烷基酯。
(I)的受控氧化得到异构体(II)和(III)的混合物。
亚麻酸以两种形式存在：α-亚麻酸(或(Z，Z，Z)-9，12，15-十八碳三烯酸)和γ-亚麻酸(或(Z，Z，Z)-6，9，12-十八碳三烯酸)。
氧化反应是在氧化催化剂如铁或铜的卤化物、优选为FeCl3的存在下进行的。反应的持续时间范围为12-78个小时，温度为-20℃到40℃，在大气压下和/或在减压下进行。氧化程度由不同的标准来监测：
-用气相色谱分析所形成的氢氧化物；
-在235±5nm处紫外吸收的变化；
-折射系数的变化。
当化合物(II)(9-HODE)的重量百分数或化合物(II)和(III)的混合物的重量百分数达到1-20％时，则对混合物进行还原，即还原在氧化过程中形成的过氧化氢。用NaBH4的乙醇溶液或其它还原剂的乙醇溶液，该溶液被分成几份逐渐加入到反应混合物中。将混合物的温度保持在4和25℃之间。当温度恒定时，停止还原。加入酸溶液，优选为药理上和/或化妆美容方面可以接受的酸，如柠檬酸，将反应介质中和到pH值6-7。
用己烷或其它能溶解化合物(II)和(III)有机溶剂来萃取化合物(II)和(III)。用水洗涤有机相，直到其为中性。
然后用无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥有机相。
然后在真空状态下蒸发滤液。
得到的产品是一种淡黄色的油状液体，并带有轻微的香味。该油状液体中化合物(II)和(III)的总含量(由气相色谱得到)大于5％重量，并且化合物(II)[9(R/S)-羟基-10E，12Z-十八碳二烯酸或9(R/S)-羟基-10E，12Z-十八碳二烯酸酯]的含量大于1.5％重量。
按照本发明的第二种实施方案，即优选的实施方案，起始物质是含有75％重量的亚油酸乙酯的油状混合物。
原理与所描述的本发明第一种实施方案的相同。进行亚油酸乙酯的选择性氧化，然后还原所形成的过氧化氢，以及后续的洗涤纯化。得到一种淡黄色、带有特定香味的油，该油含有2.5％重量的9-羟基-10E，12Z-十八碳二烯酸(以乙酯形式存在)和12％的化合物(II)和(III)的混合物(以乙酯形式存在)。羟基官能团可以在9或13位上，而双键以共轭形式处于10，12位(反，反和顺，反)以及9，11位(反，反和顺，反)。
富HODE的油的制备实施例，起始混合物含有75％亚油酸乙酯
1.氧化
将500g 75％的亚油酸乙酯加入一个控制恒温的反应器中。加入0.500g无水FeCl3(氧化催化剂)，使混合物达到25-27℃的温度范围内，并保持均匀搅拌。
利用带有2-4μm孔的不锈钢或青铜过滤器(如HPLC过滤器或用于气体的颗粒过滤器)使氧(工业级)鼓泡进入反应介质中。使小气泡的流量1升/分钟保持48至72小时。
任选下列一种方法监测氧化程度：
-在20℃时，测量反应介质中粗产物的折射系数；
-测量234nm处的紫外吸收值(检测共轭双烯)；或
-在加到反应器内的试样还原后，利用气相色谱进行测定。
当9-HODE和/或总的HODE含量分别为2.2-2.5％和10-12％时，停止氧化。
2.还原
将0.16g抗氧化剂如Coviox T70加入含有过氧化氢的混合物中。制备浓度为2％(重量/体积)的NaBH4乙醇溶液，并将该溶液冷却到4℃左右。将该还原溶液分成几份缓慢加入到含有过氧化氢的混合物中，同时保持反应介质的温度低于25℃(20℃左右)。
在室温下搅拌(1小时左右)时，当温度为常数时，终止还原阶段。
还原反应放出氢。
3.中和到pH值6-7
在搅拌条件下，将100ml 25％的柠檬酸乙醇溶液缓慢加入到反应混合物中。可能会放出氢并且有时会产生柠檬酸钠沉淀。
4.萃取、沉淀分离、洗涤和干燥
将500ml正己烷加入反应介质中，然后加入500ml水，同时快速搅拌，沉淀分离混合物。在两相分离之后，回收有机相。
洗涤有机相，直到洗涤水为中性为止，然后在大约140g无水硫酸钠
上过滤干燥。
5.蒸发
0.16g抗氧化剂(Coviox T70)加入有机相中，然后在真空中，在50-60℃的温度范围内蒸发出正己烷。
6.包装和贮存
在氮气中并且在低于10℃的温度下，将得到的油贮存于棕色玻璃溶器或桶中。
药理性质
本发明的目的是发现一种对脂肪分解有活性的分子，即该分子能够促进贮存于脂肪细胞中的三甘油酯的水解，因此释放出能被代谢的游离脂肪酸。
在人体脂肪细胞上的药理研究
本研究的目的是研究在人体脂肪细胞中，9-HODE对cAMP(循环的腺肝单磷酸酯)制备的作用，其中cAMP为脂肪分解的活化剂。相对肾上腺素和咖啡因，研究9-HODE的作用，而这两种分子对脂肪分解的刺激作用是已知的。
已经发现的是9-HODE的浓度为10-4M时，即导致cAMP增加，这一增加等效于咖啡因为10-3M时的效果，并且大于利用肾上腺素所得到的值，且该值与浓度无关。
在9-HODE为10-3M时，cAMP的浓度要比利用咖啡因得到的大十倍(7.940femtomol cAMP/每百万个脂肪细胞对应799)。
这些结果有可能得出结论，即实际上9-HODE是一种强有力的脂肪分解活化剂，它刺激脂肪细胞产生比咖啡因和肾上腺素分子所能产生的更多的cAMP。
在老鼠上的研究
该研究是在十二只老鼠上进行的，首先对这些老鼠限制食物摄入(饮食类似物)两周，然后再接受正常的食物摄入(重新增加体重)，并且视情况而定与药用葵花油结合，其中药用葵花油用本发明的方法处理过，含有2％重量的9-HODE。而对照组接受的葵花油没有9-HODE，在治疗11天后，测量两组的脂肪量。
结果表明，在接受含有2％重量9-HODE的葵花油的组中，其脂肪量明显(p＜0.001)要比在无效试剂组中测得的量低25％(21.8g与对照组中的29.5g相比)。
因此含有2％重量9-HODE的葵花油的口服药剂，使统计上大大减少利用该植物油治疗的老鼠的脂肪量成为可能。
对皮肤渗透性的研究
对皮肤渗透性的研究是利用Franz细胞在试管中在人体皮肤上进行的。这些细胞组成一块表面积为1.76cm2的人体皮肤，上面放置了800μg的9-HODE。接触6小时后，利用气相色谱在人体皮肤试样的表面、在表皮中、在真皮中以及在接受相中，对9-HODE进行检测。
9-HODE的分布如下：
-皮肤表面：33％
-表皮： 11％
-真皮： 32％
-接受相： 24％
因此9-HODE具有高的皮肤渗透能力，因此它可以直接作用在脂肪细胞上。
对9-HODE的临床研究
评价含有0.5％9-HODE的化妆用凝胶效用的临床研究
在20位大腿上脂肪(“steatmory”)过量的妇女上进行临床研究。这些志愿者们在1个月内在每条大腿上每天涂用两次含有0.5％9-HODE的凝胶。效果的标准是在两个位置测量大腿的腿围。
由于观测到大腿上部的腿围减少了6mm，而大腿下部的腿围减少了5.4mm，而这两个减少值从统计上说是相当大的，因此这些结果证明该产品是有效的。
评价含有1.5％9-HODE的化妆用凝胶效果的临床研究
在21位脂肪过量的妇女的大腿上进行了另一种研究。所研究的这种产品是含有1.5％9-HODE的化妆品溶液，涂用12天后腿围减少7mm、涂用24天后减少10mm，这从统计上证明使腿围的大幅度减少是可能的。另外，80％的妇女观察到皮肤韧性的明显改善以及“桔子皮”状皮肤表面和脂肪瘤的减少。
评价在单纯口服9-HODE后产热量增加的临床研究
针对10位健康的志愿者进行研究，这些志愿者随机服用下列产品：
-葵花油：20g
-葵花油：20g，含有2％9-HODE。
在1周的间隔内，每个人按随机顺序(按照一定的方案进行)接受每种产品。这些志愿者在量热室(基本能量消耗)中花费两个小时，然后在一顿标准化的800kcal的饭食中吸收两种产品中的一种，在量热室中保持6小时(治疗后的能量消耗)。
利用两种产品的平均能量消耗(kj/min)为；
基本能量消耗 治疗后的能量消耗
葵花油 5.76 6.35
葵花油+2％9-HODE 5.68 6.82
治疗后能量消耗的差异从统计上说是很大的(p＜0.01)。该产热量增加接近8％，这对于治疗肥胖是特别有利的。
因此本发明使口服途径治疗肥胖以及局部途径治疗局部超重成为可能。经由口服途径，9-HODE可以按照酸的形式或按照三甘油酯的形式进行用药。经由局部途径，9-HODE优选按照游离酸的形式进行用药。
9-HODE可以作为胶囊、片剂、可饮用的溶液、糖块、口香糖等和/或食物形式的饮食添加剂进行用药。9-HODE可以用作纯物质或者稀释于奶油、凝胶、粘性物质、药膏等物质中使用。
当涂于超重表面时，该物质使对脂肪细胞的直接作用成为可能。9-HODE可以作为药物系统地或局部地用于治疗肥胖。例如，口服途径的用药剂量为50-5000mg/天，而局部途径为0.1-100％。