聚合酶链式反应基因芯片制作方法 本发明涉及基因芯片和聚合酶链式反应(PCR)。用于生物医学中基因的鉴定和分析。可以同时检测人类，动物和植物等各种生物的多种基因，一次反应就可获知该标本数百种以上基因的突变，缺失和基因重排等基因变异情况。
基因芯片(gene chips)又称为DNA微列阵(microarray)，通常是在体积较小的固相支持物表面点上成百上千个基因片段作为探针，用于了解生物体内各种基因的基因表达情况。美国专利申请公开说明书US 5,837,832披露了这种基因芯片技术。根据这项技术，已经出现了检测微生物和病毒的基因和显示细胞系基因表达的一些基因芯片设计。目前已经出现的这些基因芯片都是依据分子杂交的方法，中国专利申请公开说明书99114460和98120104均基于这种方法。
但是这种方法的基本原理主要用于检测基因的表达，不易检测基因组DNA的基因的重排，突变和缺失。而生物体的遗传变异和表型改变大多数与其基因组DNA的基因的重排，突变和缺失等基因变异有关。尤其是医学领域，肿瘤和白血病检测的主要基因变异是基因的重排，缺失和突变，而非基因表达的强弱。现存问题在于如何识别这些基因变异。
聚合酶链反应(PCR)是体外大量合成某种特异DNA的方法，已经广泛用于生物医学领域。设计适当的PCR引物，就可以敏感地直接从单个细胞或者基因组DNA中扩增出单拷贝的变异基因。通过分析PCR后扩增地基因产物存在与否，可以确定是否有基因重排形成的融合基因；观察PCR产物的大小，可以确定基因内部的缺失或插入；用突变位点修饰引物3’端进行PCR，根据PCR阳性情况，可以推测有无突变存在。观察PCR产物变化是鉴定生物体细胞基因组DNA的基因的重排，突变和缺失特征很好的方式。但是，由于生物体内基因的种类很多，估计人类的基因就达到3万-5万个。生物发生遗传变异时，这些基因变异各不相同，即便同一种生物表型，不同生命阶段会出现不同的基因变异。以本发明人近年所进行的白血病的基因变异研究为例：白血病涉及至少90多种典型的，具有分类特异性的染色体易位，易位后基因重排形成融合基因。PCR检测融合基因是鉴别不同类型白血病敏感和有效的方法。但是选择进行有关的PCR实验时，需要事先得知该病例是否有某种融合基因存在。在无法得知该病例有某种融合基因之前，只能选择对每个病例均分别进行多次不同的PCR反应，这样会浪费大量时间和工作量和资金也未必获得确切结果，实际临床应用困难很大。为了解决这个问题，本发明人最近2年也曾建立了一种RT-多重巢式PCR方法(中华儿科杂志，2001)，利用涉及29种白血病染色体易位断裂点(包括80多种mRNA的断裂点或剪接变异株)的基因序列作引物，设立了一份标本加入8个反应管，每管均可以分析几个基因，同时进行PCR的反应，一次可以筛选29种常见的融合基因。这种方法初步提高了实验成功率，即便如此，仍然无法同时一次分析一个病例的与白血病有关的大量基因。
本发明的目的是创造一种基因芯片，可以一次同时分析生物体大量的可能发生变异的基因。这种基因芯片采用的基本检测方式以PCR为基础，而不是象其他基因芯片以分子杂交为基础，可以大大增强敏感性。在基因芯片内设立大量微反应器，PCR反应在芯片内数百个或者更多的这种“超微实验室”中进行，每个微反应器均可以将其内部的基因扩增数百万倍，解决常规PCR一次仅仅可以分析一种或者少数几种基因的不足。
应用该基因芯片的步骤是，取一份生命体内的少量细胞加入反应液变性，或者直接用反应液将基因组DNA标本稀释，注入基因芯片上预留的加样孔，PCR基因芯片在相应设备内反应约1小时，用计算机显示该标本基因组DNA中数百种基因的检测结果。
本发明的技术方案包括：
PCR基因芯片的体积通常不超过3×2×0.2cm，芯片内制备了100-20,000个处在同一平面上的微反应器，每个微反应器内有管道相互连通，供一次加入的含基因组DNA的样品可以流入所有微反应器。微反应器各自含有一套供PCR反应的反应介质，包括扩增不同基因和基因变异所需要的引物，荧光探针以及反应共同使用的dNTP,DNA聚合酶，镁离子，KCl等。PCR基因芯片可同时进行100-20,000个PCR反应，一次可以获知该标本100种以上基因的突变，缺失和基因重排情况。
为了保证PCR基因芯片内大量PCR反应顺利进行，同时降低芯片成本，一次性使用，制备PCR基因芯片的材料硅或者塑料等其他材料能耐受加热制冷系统控制的PCR反应温度和时间，温度为0℃-99℃，时间24小时。由于所有反应在密封的芯片上一次性使用，可以避免由于实验室长期进行PCR，其反应产物溢出后污染造成的假阳性。
由于基因芯片内每个微反应器体积通常小于1微升。微反应器内的反应介质的量极微。为了充分实现PCR反应，并且适于批量生产和运输，微反应器中的反应介质采用固化反应介质，配制适当的反应缓冲液，用纳米级磁珠吸附缓冲液成分，采用机械手装置定量加入微反应器，冷冻干燥后呈固相介质。加样时用专用检测设备在芯片外用磁力吸附在微反应器底部，防止被加样时的液体冲走。反应过程中可以应用磁力搅拌系统搅拌，加速反应。为了简化PCR过程，反应介质中采用高温加热后才释放活性的聚合酶，所有反应一次进行，提高反应效率。
反应介质中的PCR引物分别由不同的特异性基因的引物组成，可达数百种。PCR基因芯片可供加入大量不同的PCR引物，分析大量变异基因。通过分析PCR后扩增的基因产物存在与否，可以确定是否有基因重排形成的融合基因；观察PCR产物的大小，可以确定基因内部的缺失或插入；用突变位点修饰引物3’端进行PCR，根据PCR阳性情况，可以推测有无突变存在。即利用不同的引物，观察PCR产物变化，可以鉴定生物体细胞基因组DNA的基因的重排，突变和缺失特征。
PCR反应的最大难题是基因定量问题。要想通过基因分析鉴别出混杂在生物体内大量正常细胞中的少数变异细胞，尤其是肿瘤和白血病患者体内的极少量癌细胞，对PCR产物进行定量分析十分重要。通常采用的定量分析方法是用PCR反应结束时获得的DNA含量来推测变异(癌)细胞DNA的量，用稳定表达的基因如β-actin同时反应做内参标。此种方法的主要缺陷是无法克服PCR的平台效应。荧光定量PCR具有DNA定量的优势，最常用的方法是用荧光标记基因序列作探针，在反应的过程中荧光素会整合到PCR产物DNA中，采集荧光作图像分析，可以通过DNA含量获知标本中变异(癌)细胞的数量。分析可以在反应进行中而不必等到反应完成后进行，称为实时(realtime)定量监测，这种方法克服了PCR后期DNA造成不再成倍扩增的平台效应。PCR基因芯片内的微反应器制备成端面透明，透过端面可以测定各个微反应器PCR反应的强度。
反应介质中加入一种荧光探针，探针用一对可以相互抑制的荧光染料标记，探针上两个荧光染料可因荧光激发能量转换(FRET)而不发荧光。如果生物基因组中有相应的基因成分，微反应器内的就出现PCR产物，特异性探针结合到PCR产物上后，聚合酶可以消化一端的荧光抑制物，使PCR产物出现荧光。因此荧光阳性表明有相应的特异性基因存在。由于PCR基因芯片的端面透明，可供激发和采集荧光信号。激光激发基因芯片内微反应器内的荧光，每分钟定时采集荧光亮度数据，激光激发后出现荧光的时间表明PCR产物出现的时间，图像分析系统将荧光数据采集入计算机，处理数据。图像采集系统随时分别采集各个微反应器中的荧光亮度数据，随着反应进行随时确定阳性反应和定量分析。事先设置的一组约20个微反应器作对照系统，在这些微反应器中加入已知含量的基因，计算机根据对照微反应器中的DNA含量设定定量曲线，作为标准，对其他各个微反应器内的PCR产物作定量分析。本发明也包括应用除荧光探针以外的其他显色物质。
本发明的优点是，PCR基因芯片结合了其他基因芯片体积小却可以检测大量基因，以及PCR容易发现各种基因变异的特点，采用以PCR为基础，而非其他基因芯片以分子杂交为基础的检测方式，克服了这些技术所存在的内在缺陷，大大增强了敏感性。PCR基因芯片明显扩展了基因芯片在生物医学领域中应用的范围，适用于人类，动物和植物等各种生物的多种基因的基因重排，基因突变和基因缺失的鉴定，只需一次加入少量变性的细胞或者基因组DNA标本，就可获知该标本数百种以上基因的变异。PCR基因芯片的PCR在体积很小的基因芯片内大量的“超微实验室”-微反应器中进行，可以将极少细胞中发生变异的基因扩增数百万倍。其PCR反应采用纳米级磁珠吸附缓冲液的固相成分，荧光探针；采用高温加热后才释放活性的聚合酶。在临床肿瘤和白血病的诊断，人类基因组分析，基因多态性和疾病易感性鉴定，遗传性疾病的基因诊断；动物和植物基因变异筛选，各种病原微生物鉴定会有广泛应用前景。