一种真鲷胚胎冷冻保存方法 【技术领域】
本发明涉及鱼类胚胎冷冻保存，具体地说是一种海洋鱼类真鲷胚胎冷冻保存方法，把真鲷胚胎通过降温、液氮保存及解冻洗脱，获取复活胚胎的过程。
背景技术
鱼类胚胎冷冻保存研究约有20年历史，由于鱼类胚胎体积较大、含水量多、卵黄含量高、卵膜通透性差，冷冻保存较哺乳类胚胎困难得多。国内外学者对鱼类胚胎冷冻保存的损伤机理、冷冻降温速率、解冻复温、抗冻剂种类和毒性等方面进行了大量研究，并取得很大进展。目前鲤科鱼类胚胎在-100℃以上温度的冷冻保存已获得较稳定的复活率[张克俭，楼允东，张饮江等。三种淡水鱼类胚胎低温保存及其降温和复温速率的研究。水产学报1997，21(4)：366-372]；鲑鳟鱼类胚胎亦突破-25℃的界限(Erdahl，D.A.，Preservation of spermatozoa and ova from freshwaterfish.Thesis of the University of Minnesota，U.S.A 1986)；鲤鱼和泥鳅胚胎的冷冻保存已突破了液氮温区，Zhang等于1989年将16个鲤胚胎冷冻到-196℃，解冻后有4个复活，并有3尾孵出鱼苗(Zhang，X.S.，Zhao，L.，Hua，T.C.，et al.A study on thecryopreservation of common carp embryos.CryoLetters，1989，10：271-278)；张克俭等在1997年将心跳期泥鳅胚胎冷冻到-196℃，在16个胚胎中，有1个完全复活并孵出鱼苗[张克俭，楼允东，张饮江等。三种淡水鱼类胚胎低温保存及其降温和复温速率的研究。水产学报1997，21(4)：366-372]。虽然以上结果尽管还难以重复，但可以说是目前比较好的结果。以上鱼类胚胎的冷冻保存方法并不适用于海洋鱼类真鲷胚胎的保存。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种适用于海洋鱼类的真鲷胚胎冷冻保存方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
选择真鲷心跳期胚胎，放入抗冻液中在0～4℃，预冷90分钟；分段降温，降温期间在-12℃时置核，降温至-30℃直接投入液氮中保存。
所述真鲷心跳期胚胎的心跳次数大于60次/分钟；抗冻液是以平衡盐溶液Cortland为基液(pH＝8.28)，其中含有体积含量5％的二甲基亚砜(DMSO)和5％的丙二醇(PG)二种抗冻剂；分段降温是指0～-15.5℃降温速度为3.5℃/分钟，-15.5～-30℃降温速度为3℃/分钟。
所述保存后的真鲷胚胎解冻时在-80℃平衡10分钟，放入43℃水浴解冻至冰核全部融化，用洗脱溶液洗脱，最后放入海水中培育，获取复活胚胎；洗脱溶液是0.5mol/L蔗糖溶液；在洗脱时，在0.5mol/L蔗糖中浸泡10分钟。
本发明具有如下优点：
(1)真鲷心跳期胚胎与其它早期阶段的胚胎相比，对冷冻降温的耐受力最强；
(2)DMSO和PG二种抗冻剂混合使用，减轻毒性作用；
(3)-12℃置核大大降低溶液的过冷度；
(4)-30℃直接投入液氮中，使胚胎快速通过-30℃以下“危险温度区”，降低胞内冰晶的冷冻损伤；
(5)从-80℃至43℃的水浴解冻，快速渡过重结晶区，减少重结晶对胚胎的损伤；
本发明地真鲷胚胎冷冻保存对于真鲷这种海水名贵鱼类的种质保存、遗传多样性和育种及可持续养殖等方面有着重要意义。
【具体实施方式】
实施例
1)捞取同批自然产真鲷受精卵，放置海水温度18±1℃、微充气的孵化桶内培育，至心跳期胚胎，心跳次数60次/分钟以上；
2)用80目筛绢网捞取胚胎，用滤纸轻蘸吸去表面海水，放入DMSO5％+PG5％的以平衡盐溶液Cortland为基液的抗冻液中，在0～4℃冰箱中浸泡90分钟(预冷)；从冰箱中取2个2ml的冻存管，各吸取1.2ml的抗冻剂，其中一支含有61粒胚胎，另一只含有62粒胚胎；快速放入降温仪，开始降温；
3)降温程序为：0～-15.5℃，降温速度为3.5℃/min；-15.5～-30℃，降温速度为3℃/min；其中在-12℃时，迅速从降温仪中取出冻存管，将事先浸入液氮中解剖针取出，轻轻触在溶液表面，冻存管快速放回降温仪中，完成置核，降温达到-30℃时，迅速将冻存管投入液氮罐中保存；
4)保存2小时后取出冻存管，放入保持在-80℃的降温仪中平衡10分钟，然后迅速放在43℃水浴锅中解冻，至冰核全部融化；
5)立即用80目筛绢网过滤胚胎，与抗冻剂分离，放入0.5mol/L蔗糖溶液中浸泡10分钟，然后再过滤，放入18±1℃的过滤海水中静水培育；
6)解冻后复活胚胎共为13粒，复活率为10.57％，复活胚胎全部发育至仔鱼。