编码鹿角车前草花粉主要 过敏原-PLA L 1的重组DNA及其应用 【发明领域】
本发明涉及含有鹿角车前草(Plantago lanceolata)主要过敏原Pla l 1的至少一个抗原表位的核酸分子。
【发明背景】
近几年，I型过敏原影响着世界上成千上万的人，它在发达国家中的发病率有上升的趋势，导致了死亡人数上升和经济损失(1)。花粉过敏原是一些能够引起IgE介导的过敏性疾病的蛋白质或糖蛋白，这些疾病如花粉热和哮喘，大约有17％的人口在遗传上易患过敏性疾病。
目前治疗这些疾病的方法主要体现在减轻症状。患者经常服用一些抗组胺类以及类固醇药物以减轻症状，然而这些药物并不能抑制IgE抗体的形成并经常会带来一些副作用。正如WHO Position Paper(2)所述，免疫治疗是唯一能够影响过敏性疾病的自然发生过程的治疗方法，而且它也有可能防止过敏性鼻粘膜炎患者患上哮喘病(2)。免疫治疗能够调节患者在给药(即施加大量适合的过敏反应提取物)过程中的免疫应答。但是，用于治疗的过敏反应提取物是从天然来源分离得到的蛋白质和非蛋白质成分的粗混合物，这些资源或者含有大量与过敏原无关地成分，或者几乎不含有造成患者高敏感性的过敏原。在最近几年，随着杂交瘤技术的发展，可以利用基于单克隆抗体的免疫试验对主要的过敏原含量进行鉴定，由此导致了在过敏反应提取物的标准化方面取得了重要进展(3)，所有对一种特定的过敏反应提取物敏感的患者都继续接受含全部提取物成分的相同的复杂混合物的治疗。但是这有可能导致副作用的产生，这个副作用主要由于对提取物中所有蛋白质成分(包括除主要过敏原PLA L 1外的其它过敏原)具有抗性的另外的IgE抗体所引起。
就过敏诊断而言，这种使用整个过敏反应提取物来进行皮肤测试的方法妨碍了导致患者敏感的特殊过敏原的检测。
针对这些缺点，许多研究人员采用生物化学分离和纯化技术的方法分离得到单独的过敏原。然而，尽管这个方法对于过敏原的鉴定可能有效，但却不足以制备工业规模上的过敏原，因为这个过程极其耗费人力，并且从昂贵的自然资源中纯化出的过敏原产量通常情况下都很低。基于这些原因，用于合成过敏原蛋白质的重组DNA技术引起了人们的注意。利用可生长在大发酵罐中的微生物表达系统可以大规模获得重组过敏原。因此，这些技术使得重组过敏原以一致纯度大量生产。除此之外，使用rDNA技术可能表达抗原表位片段或修饰的过敏原以方便应用于过敏性疾病的诊断或处理。目前，很多研究人员都采用rDNA技术来研究过敏原，例如，最近一些来自螨类、草、树、土壤等的过敏原也都已经被克隆并表达了(4)。
车前草属(Plantago)的植物花粉是空气过敏原的主要来源，并且可能是世界上许多国家花粉病的发生的部分原因。车前草属属于车前科(Plantaginaceae)，包括250个种。最常见的一个种就是鹿角车前草(英文名为plantain或ribwort)，主要分布在欧洲、澳大利亚以及北美洲的温带地区(5-8)。从本世纪初开始，鹿角车前草花粉就同花粉热联系在了一起(9-11)，而这些杂草则被认为是引起过敏性疾病的一种最重要的双子叶植物(12)。
在过去的几年内，不同国家所开展的几项研究均显示出了这该物种的重要临床意义。受鹿角车前草过敏原影响最大的地区为澳大利亚(13)和地中海地区(14)。例如，Bousquet等人(15)在对患花粉热的患者检查时所发现的，其中36％的患者对蒙彼利埃(法国)的英国车前草(plantain)敏感。在英国，两项不同的研究均表明超过20％的季节性呼吸过敏患者对车前草呈现出皮肤阳性反应(16，17)。同样，在西班牙的不同城市也相继出现对这种花粉的过敏症状的流行(18-20)。然而，鹿角车前草在花粉病病原学上的真正作用还不清楚，因为只对车前草敏感的患者是罕见的。对车前草过敏的患者通常也会对在同一季节授粉的其它的植物过敏，尤其是草类花粉(17-21)。
尽管上文中提到了一些报道，但是目前还没有表征车前草的主要过敏原的数据的报道，目前仅有的一些关于鹿角车前草过敏原鉴定方面的研究发表(17，21，22)。
WO 98/59051公开了从橄榄树中获得的Ole e 1过敏原的克隆。众所周知，这个序列和来自于Pla l 1的一段8个氨基酸的序列同源。
来自于桦树(疣皮桦Betula verrucosa)的一段序列在数据库中对应的登记号为Y14038。此序列编码的蛋白质同Ole e 1过敏原有着很高的同源性。
鹿角车前草花粉的主要过敏原最近已经被鉴定、纯化并且其物理化学和免疫化学方面的特性(23)也已被部分表征了。Pla l 1是一种微不均一性的糖蛋白，其表观分子量在16-20KDa范围内。它的N端16个氨基酸残基已经被测得。在对车前草敏感的患者中，针对纯Pla l 1的特异性IgE流行程度为86％，它占IgE与车前草花粉提取物的总结合能力的大约80％。这个数据表明：Pla l 1是鹿角车前草花粉中在临床上最相关的过敏原。
发明概述
本发明的目的是提供Pla l 1的核苷酸和氨基酸序列。
本发明涉及编码包含鹿角车前草的主要过敏原-Pla l 1中至少一个抗原表位的蛋白质或肽段的核酸分子，其中此核酸分子a)具有序列SEQ ID NO：3，b)是序列SEQ ID NO：3的一个片段，c)含有编码SEQ ID NO：4氨基酸序列或其部分的一段序列，d)具有一段在严紧条件下与SEQ ID NO：3杂交的序列，e)具有通过SEQ ID NO：3简并可衍生的一段序列，f)一条与a)-e)中任一序列互补的序列。
采用分子克隆技术，分离编码Pla l 1过敏原的cDNA克隆并测定该克隆的核苷酸顺序，然后从上述核苷酸顺序中推导出氨基酸序列从而获得该蛋白质的完整化学结构。这个过程涉及到从鹿角车前草花粉中分离RNA并利用逆转录酶合成cDNA。利用PCR去特异性扩增编码Plal 1的cDNA，其特异性引物来源于天然过敏原的N末端序列。使用内部特异性引物对编码Pla l 1的cDNA进行5’端延伸能够测定编码Plal 1的信号肽和N末端的核苷酸序列。最后，使用对成熟蛋白的N末端和C末端专一的引物PCR扩增Pla l 1 cDNA，然后将编码Pla l 1的全长克隆插入到载体中，并在转化宿主细胞中表达该重组过敏原。
花粉颗粒有一个坚硬的外壳，其内含有几个细胞，而蛋白质过敏原则存在于这些细胞内，因此，若要从花粉中分离mRNA，必须首先破碎其坚硬的外壳，然后再裂解细胞并从产生的混合物中提取mRNA。由于mRNA的不稳定性，通常其在活细胞中只存活几分钟，因此这种分离是很困难的。
在本发明之前，曾经有人尝试分离鹿角车前草花粉Pla l 1的mRNA，但都没有成功。特别是，他们使用了大量不同的破碎花粉粒细胞壁、细胞裂解以及mRNA提取的方法，都没有成功。由本发明选择的方法组合分离得到了Pla l 1的mRNA。具体来说，使用一种改进的超声波处理步骤来破碎花粉粒细胞壁，同以前的超声波处理技术比较，本发明中的这个处理过程要延长许多。这种改进的超声波处理同含有硫氰酸胍的裂解缓冲液联合使用，并同基于苯酚-氯仿的提取试剂联合使用。
本发明提供分离的编码鹿角车前草主要过敏原抗原表位的核酸分子，这种技术是过敏性疾病诊断和治疗上的一大进步，正如上面所述，它提供的方法克服了纯过敏原或其中对应于过敏原性部分的肽段的缺乏。尽管这种过敏原是车前草植物花粉中主要的过敏原性成分，但在本发明前它仍是未被克隆的分子。
已经获得的材料和信息使得我们可以对该核酸分子进行修饰，引起该蛋白中特异氨基酸残基的改变，进而能够确定特异的IgE结合抗原表位。对IgE结合的抗原表位的鉴定允许生产IgE结合能力减弱的修饰的重组过敏原。这种经修饰导致IgE结合能力减弱的重组过敏原可用于有效地治疗过敏症患者。以大剂量服用时，不利的副反应比较低，例如，过敏反应。同样，可以设计源自Pla l 1序列的短肽，其可能作为一种疫苗在过敏性患者中调节T细胞反应，该T细胞反应控制IgE抗体的产量。另外，这个重组过敏原也可被化学修饰。本发明的另外一个方面是该重组过敏原诊断针对鹿角车前草和交叉反应物种的花粉的过敏性反应。这种诊断方法基于抗原-抗体反应并能够被设计用于体内和体外检验。
本发明与下列情况进一步相关：
重组蛋白质或肽，其包含鹿角车前草的主要过敏原-Pla l 1的至少一个抗原表位，其具有根据本发明的核苷酸序列相对应的氨基酸序列。本发明放弃由SEQ ID NO：4上1-16氨基酸构成的氨基酸序列及其片段。
根据本发明的蛋白质或肽用作药物。
本发明的蛋白质在生产用于在某一被试者中预防、减轻或治疗过敏性反应的药物中的用途。
适于转化宿主的一种表达载体，其包含根据本发明的核苷酸。
宿主细胞，其含有根据本发明的表达载体。
生产重组蛋白质或肽的方法，该蛋白质或肽包含鹿角车前草的主要过敏原-Pla l 1的至少一个抗原表位，该方法包含：在所述Pla l1核酸序列表达、生产所述蛋白质或肽的条件下培养根据本发明的宿主细胞，并且分离所述蛋白质或肽。
一种药物组合物，其包含根据本发明的重组蛋白质或肽作为活性物质。
一种能够在某一被试者中预防、减轻或治疗过敏性反应的方法，其包括对受试者施用根据本发明的重组蛋白质或肽，或者药物组合物。
一种体外诊断或预测受试者针对Pla l 1过敏原的过敏反应的方法，其中包括：从受试者收集样品并确定其针对根据本发明的蛋白质或肽的IgE抗体的水平。
一种体内诊断或预测受试者针对Pla l 1过敏原的过敏反应的方法，其中包括：将本发明的蛋白质或肽施与受试者并且监测其反应。
一种用于体内或体外诊断或预测受试者针对Pla l 1过敏原的过敏反应的试剂，其中该试剂含有根据本发明的蛋白质或肽。
使用根据本发明的蛋白质或肽预测过敏反应接种效应的一种方法。
【序列表】
SEQ ID NO.：1.利用5’RACE系统获得的3个cDNA克隆的核苷酸序列。星号(*)表明三个序列之间的同一性。在翻译起始密码子处加了下划线，前导肽序列用斜体字表示，并且编码该成熟蛋白(引物为Pla4，表1)N末端的寡核苷酸用黑体字表示。在每个克隆的序列末端可以观察到与在5’RACE中所用引物Pla3相互补的核苷酸序列(用不连续划线表示)。
SEQ ID NO.：2.Pla l 1前导肽的氨基酸序列，衍生自3个cDNA克隆的核苷酸序列。虚线表示与其上一行氨基酸残基的同一性。
SEQ ID NO.：3.编码Pla l 1 cDNA克隆的核苷酸序列，起始于该成熟蛋白的N末端。星号(*)表明这些克隆之间的同一性。与该成熟蛋白相对应的序列用大写字母表示，而其3’非翻译区用小写字母表示。终止密码子用黑体字表示。根据IUIS命名规则，每个克隆的名称在该序列末端用黑体字表示。
SEQ ID NO.：4.从Pla l 1 cDNA克隆的核苷酸序列翻译过来的氨基酸序列。虚线表示与其上一行氨基酸残基的同一性。方框内是潜在的N-糖基化位点。根据IUIS命名规则，每个克隆的名称在该序列末端用黑体字表示。
附图简述
图1是SDS-PAGE。纯化的nPla l 1(泳道1)和rPla l 1.0101(泳道b)。泳道c：用PNGase F处理后的rPla l 1.0101。上样量为8μg蛋白质/每个泳道。用考马斯亮蓝染色。
图2是天然的和重组的Pla l 1在远紫外区的圆二色谱图。 以Pla l 1中平均残基重量113为基础数值表达为平均残基椭圆率(θmrw)。
图3是对特异性IgE同nPla l 1结合的抑制。将96孔ELISA平板涂上纯化的天然Pla l 1，通过添加rPla l 1.0101抑制从车前草过敏性疾病患者免疫血清中获得的特异性IgE的结合。天然过敏原抑制曲线用作参照。用辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgE抗体以及orto-苯二胺(OPD)检测结合态的IgE。使用650nm的参考滤光器测量490nm处的吸收值。
发明详述
编码鹿角车前草花粉(英国车前草)的主要过敏原的3个等位过敏原变体的核苷酸序列，Pla l 1.0101，Pla l 1.0102和Pla l 1.0103均列于SEQ ID NO.：3，而它们相应的氨基酸序列列于SEQ ID NO.：4。等位过敏原变体Pla l 1.0101已被表达、纯化并鉴定。Pla l 1变体的核苷酸序列编码一个131残基的成熟加工过的蛋白质。重组Plal 1.0101显示出与天然Pla l 1过敏原相似的抗原性。此过敏原诱导合成在敏感个体内能够产生过敏性反应的IgE抗体。作为样品中的活性成分，重组Pla l 1蛋白质可被用作诊断和治疗车前草属花粉诱导的过敏性疾病的制剂中的活性成分。
核酸分子
本发明的核酸分子可以是起源于选自车前草科(Plantaginaceae)的一种植物，该车前草科的植物包括Plantaginaceae Arnoglossum S.F.Gray，Plantaginaceae Asterogeum S.F.Gray，PlantaginaceaeBougueria Decne，Plantaginaceae CoronopusMiller，Plantaginaceae Coronopus Reichb.，Plantaginaceaelagopus Fourr.，Plantaginaceae Litorella Aschers.，Plantaginaceae Littanella Roth，Plantaginaceae LittanellaBerg.，Plantaginaceae Plantaginella Fourr.，PlantaginaceaePlantago L.，和Plantaginaceae Plantago Linn.，参见The PlantNames Project(1999)，the International Plant Name Index(IPNI)它们都已在互联网上被公布了；http://www.ipni.org(2001年5月21日接收)。优选地，本发明的核酸分子可以是源自于一种植物的分子，这种植物是选自于车前草属，其包含1759个亚种，参见theInternational Plant Name Index(IPNI；www.ipni.org)。
本发明核酸分子可以是在严紧条件下与SEQ ID NO.：3杂交的序列，优选的核酸分子为在高严紧条件下与SEQ ID NO.：3杂交的序列。
优选的序列与SEQ ID NO.：3的序列同一性超过50％，更优选超过70％，再优选超过85％，进一步优选超过90％，最优选超过95％。
蛋白质或肽
同SEQ ID NO.：4相比较，上述的蛋白质或肽的氨基酸序列可以被修饰，从而部分或完全减弱与IgE结合的亲和力。不具备与IgE结合亲和力的过敏原并不能引起抗体介导的B细胞反应。但是，人们认为不具备与IgE结合的亲和力的过敏原仍然可以作为疫苗，因为这种过敏原能够引起T细胞反应。即使它没有血清学反应活性，仍然可以进行不引起过敏危险的预防免疫。
根据本发明的重组蛋白质或肽，可以高纯度生产。因此，采用重组技术生产蛋白质或肽与从花粉提取物中获得过敏原样品不同，前者所产生的产品能够完全避免该过敏原的其它同工型。并且，这种产物纯度可高达总蛋白的95％。因此，在本发明优选的实施方案中，该蛋白质或肽的纯度超过总蛋白的75％，更优选超过85％，更优选超过90％，最优选超过95％。就此而言，本发明的蛋白质或肽包括它可能存在的所有形式，包括单体、二聚体、糖基化以及非糖基化形式。
氨基酸序列的修饰可以包括一或更多个氨基酸的置换和/或缺失和/或增加。
优选，同SEQ ID NO.：3相比较，经过修饰的氨基酸序列具有超过50％同一性，更优选超过67％，更优选超过85％，更优选超过90％，最优选超过95％。
一旦确定了一个过敏原的氨基酸序列，本领域技术人员就可以利用传统技术来确定该过敏原抗原表位的位置、结构和序列。在实施例7中详细描述了确定该过敏原抗原表位的位置、结构和序列的该实验过程。
优选地，根据本发明的重组修饰的过敏原必须具有与上述天然存在的过敏原相同的α碳骨架三维结构。
在同来自对来源特异性的IgE反应的过敏患者的血清或其集合的血清进行免疫试验后发现，同天然存在的同种过敏原(isoallergen)或相似的重组蛋白质相比较，修饰的过敏原同特异的IgE的结合优选降低至少5％，更优选降低超过25％，更优选降低超过50％，更优选降低超过75％，最优选降低超过90％。
评价降低的IgE结合的另外一个方法是修饰的过敏原引起组胺释放(HR)的能力。可以通过几种组胺释放试验测量组胺释放量。修饰的过敏原减少的组胺释放源自于与细胞表面结合的特异性IgE的亲和性的降低以及它们促交联能力的降低。同天然存在的过敏原相比较，本发明中修饰过敏原的HR优选减少5-100％，更优选25-100％，更优选50-100％，最优选75-100％。
本发明优选的实施方案的特征在于利用定点突变来实现一或更多个取代。
本发明优选的实施方案的特征在于利用随机突变来实现或更多个取代。
核酸序列的修饰可以例如根据WO99/47680和DK专利申请PA200001718中提出的原则得以实现。
在本发明的一个优选实施方案中蛋白质或肽至少含有一个同非Pla l 1的过敏原的抗原表位具有相同结合特异性的抗原表位。
这样一个杂合的过敏原展现了Pla l 1和正被讨论的其它过敏原的抗原性，它的优点是可用于治疗或诊断对Pla l 1和其它过敏原同时过敏的过敏性疾病。
比较从蛋白数据库中获得的序列，发现在与Pla l 1最相似的蛋白质中，来自于油橄榄(Olea europaea)花粉的Ole e 1(同一性：约39％，同源性：68％)在临床上最重要，参见实施例8。参考实施例8来了解Pla l 1与其最相关的过敏原的序列相似性的更详细说明。
在本发明的一个优选实施方案中蛋白质或肽含有与来自油橄榄的过敏原Ole e 1具有相同结合特异性的至少一个抗原表位。
由于根据本发明优选的蛋白质或肽显示出了对Pla l 1和Ole e 1两者的抗原性，因此它可用于治疗或诊断对Pla l 1和Ole e 1同时过敏的症状。
文献30已经表明Pla l 1和Ole e 1有交叉反应活性。因此，本发明提供的重组Pla l 1过敏原具有优势在于其可被用于实现对Pla l1和Ole e 1过敏的同时治疗或诊断。
使用通过对编码Pla l 1的核酸分子进行DNA改组(分子增殖)获得的DNA序列，可生产根据本发明的重组修饰的过敏原。参照在Punnonen J的文章“过敏疫苗和抗过敏细胞因子的分子增殖”(IntArch Allergy Immunol 2000；121：173-182)中公开的操作步骤，以及在该文所提到的文献中所公开的操作步骤(均在此引为文献)，可以对编码Pla l 1的核酸分子进行DNA改组。
DNA改组可在编码Plal1的核酸分子和任何其它编码具有潜在的相关抗原性的过敏原的DNA分子之间进行，以产生编码引起过敏原性分子的DNA杂合体，其含有来自于两个或更多不同过敏原的抗原表位，例如来自Pla l 1。
在本发明的一个优选实施方案中蛋白质或肽是它的衍生物，这种衍生物可能具有一个未改变的或减弱的IgE结合亲和力。
这种衍生物包括化学修饰的蛋白质和肽，例如，戊二醛交联修饰的蛋白质和肽。这种化学修饰的蛋白质和肽可以通过标准的蛋白质化学方法获得。
对过敏性疾病有潜在治疗作用的其它化学修饰蛋白质包括含有上述CpG基序的过敏原-DNA缀合物(J.Allergy Clin.Immunol.2001；107；339-350)。其组成成分可以混合物的形式给出。
药物组合物和治疗方法
除了活性成分之外，本发明的药物组合物可以含有大量的赋形剂和佐剂。所使用的赋形剂可以是常规应用于蛋白质和肽制剂的任何一种赋形剂。而佐剂则可以是常规应用于过敏原制剂的任何一种佐剂。
本发明的药物组合物优先为疫苗。疫苗制剂在本领域内所普遍熟知。疫苗通常制备成可注射的液体溶液或悬液。这样的疫苗也可乳化或制成用于鼻、口给药的形式，后者包括口腔和舌下给药。正在讨论的具有免疫原性的成分(在这里被定义成重组过敏原)可同赋形剂适当混合，该赋形剂为药学可接受的并且与活性成分相容。水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及其组合为适合的赋形剂的实例。另外，该疫苗还可以含有其它的物质，例如：湿润剂、乳化剂、缓冲剂或提高疫苗效力的佐剂。
疫苗最常见以肠胃外方式通过皮下或肌内注射给药。在这样的疫苗内，活性物质可被吸附到固体载体上或是以水溶液形式存在。另一种适合的给药方式包括口服制剂和栓剂。口服给药的疫苗所使用的赋形剂都是这类制剂常用的，例如：药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁盐、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。该组合物可被制成固体、悬液、乳化剂、片剂、丸剂、胶囊、微粒，脂质体制剂，缓释制剂，气雾剂，粉末或颗粒制剂。例如，根据本发明的疫苗可根据WO00/45847和丹麦专利申请PA200001194中所描述的原理来配制。
该疫苗的给药方式需符合剂量剂型，并且给药量也应为治疗有效的和免疫原性的。疫苗内含有的活性成分的量视治疗对象而定，包括对象的免疫系统对该治疗的应答能力、给药方式以及对象的年龄和体重。适合的剂量范围在0.0001μg-1000μg之内变动。
如上所述，通过向制剂内加入佐剂可增加药效。例如，氢氧化铝和磷酸缓冲溶液中的0.05％-0.1％的磷酸盐(铝)或磷酸钙、以0.25％溶液使用的糖合成聚合物或聚交酯乙交酯(polyactid glycolid)(PLG)。细菌细胞混合物如C.parvum、革兰氏阴性细菌的内毒素或脂多糖成分，生理上可接受的油载体中如二缩甘露醇monoaleate(Aracel A)的乳化剂或用作封闭替代物的含20％培氟卡波如培氟卡波-DA溶液的乳化剂也可使用。油剂乳化剂如MF-59也可使用。还可使用其它的佐剂如弗氏完全和不完全佐剂，以及皂甙如QuilA、Qs-21、ISCOM和RIBI。
在更多情况下，疫苗需要多次给药以确保其效力。通常，疫苗以初次给药方式给药，接下来采用接种或其它给药方式。接种次数一般将在1-50次范围内，通常不会超过35次接种。正常情况下，接种以从两周一次到两个月一次进行两个月到五年，预计能达到预防或治疗的期望水平。
重组过敏原可用作药物制剂，其适于在症状发生当年的一定时期内对过敏性反应提供一定的保护作用(预防)。在某些情况下，每年必须重复这种处理以维持其预防作用。用于鼻、口和舌下的制剂尤其适用于此种目的。
最后，本发明的重组过敏原可同靶向分子的联合提供以传递到免疫系统的特异细胞或粘膜表面上。
载体和宿主
根据本发明的表达载体可以是包括质粒和噬菌体在内的任何能够表达Pla l 1的表达载体。根据本发明的表达载体优选是质粒，例如pPIC9、pROEX HT(生产厂商：Life Technologies)，pGAPZ(生产厂商：Invitrogen)，pSFV1(生产厂商：Life Technologies)。
根据本发明的宿主可以是任何能够容纳所使用的载体的宿主，包括细菌细胞、哺乳动物细胞和酵母细胞。在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的宿主细胞为巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和细菌大肠杆菌(E.coli)。
诊断的方法
本发明的体外诊断和预后方法可以是任何能够测量专一针对过敏原性底物的IgE的水平的免疫学实验方法。
优选，体外实验是选自WO94/11734、WO99/67642、WO00/37941中描述的实验，而它们在此被引用为参考文献。
本发明的体内诊断和预后方法可以是任何能够评价受试者对过敏原性底物敏感性的实验方法，如皮肤测，例如表皮剌穿试验、皮内试验和支气管刺激试验。
预测过敏原疫苗疗效的方法可以是任何能够预计的已知方法，如在WO99/67642中描述的方法。
定义
在本发明中，表达“表位”意指抗体结合结构，形式为一级氨基酸序列中至少5个氨基酸长的片段，或者是成熟折叠的蛋白质(三维，三级结构)中至少5个氨基酸构成的表面暴露区域。术语“表位”既包括B细胞也包括T细胞的表位。该抗体可以是任何免疫球蛋白，包括分属于IgA、IgD、IgE、IgG、IgM的各种免疫球蛋白。
表达“SEQ ID NO.：3序列的片段”意指含有至少15碱基对的片段。
表达“核酸分子具有编码…氨基酸序列的序列”意指编码特定氨基酸序列的任何核苷酸分子序列。
表达“严紧条件”指的是下述条件：
氯化钠浓度范围为0.15M-0.9M；温度范围为20℃-55℃。
表达“高严紧条件”指的是下述条件：
氯化钠浓度范围为0.02M-0.15M；温度范围为50℃-70℃。
表达“简并”意指在核酸序列中所发生的一个或更多的碱基置换，其结果并不会改变由此核酸编码的氨基酸序列。
表达“SEQ ID NO.：3的序列”意指在SEQ ID NO.：3中显示的三个序列突变体中的任意一个。同样的，‘SEQ ID NO.：4的序列”意指在SEQ ID NO.：4中显示的三个序列突变体中的任意一个。
表达“重组蛋白质或肽”包括合成的蛋白质/肽(也就是化学合成制备的分子)以及利用重组技术制备的蛋白质/肽。
表达“降低的IgE结合亲合力”意指IgE结合亲和力在部分或整体上减弱。
实施例
参考下述具体实施例，可以对本发明有更深入的理解。下文这些实施例仅为阐清楚，且非意在限定本发明的范围。这里尽管使用了专业术语，但其并不是为了增加限制，而是为了提高理解性。
如果没有特别指明，重组DNA技术都按照参考文献(24)的标准步骤进行。
实施例1：
这个实施例是用来描述从P.lanceolata花粉中分离RNA、合成cDNA第一链以及扩增Pla l 1-特异cDNA的3’片段。
总RNA是通过在变性溶液中对花粉颗粒进行延长的超声裂解，之后对上悬浮液进行苯酚-氯仿抽提，从鹿角车前草花粉中提取出来的。将花粉(0.6g)悬浮于7mL变性溶液中(含4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠pH7.0，0.5％(w/v)肌氨酸月桂酯，100mM β-巯基乙醇)(25)，然后将该悬浮液在Vibracell超声波仪VC300中超声处理30min，工作循环50％超声波暴露，于设置9。然后将0.7mL 2mM pH4.0的乙酸钠溶液、7mL水饱和的苯酚及1.4mL的氯仿∶异戊醇溶液(49∶1，v/v)添加到超声处理后的悬液中，4℃温育15分钟，偶尔震荡。在10,000g，4℃，离心20分钟以分离两相。转移水相到一个干净的管中，在-20℃下添加相同体积异丙醇以沉淀RNA，并在此温度下温育1小时。将沉淀溶解在0.3mL的变性溶液中，并采用相同的方法，再次以异丙醇沉淀RNA。用75％乙醇清洗沉淀并将其晾干。最后，此RNA沉淀溶解在DEPC处理过的水中，等份冻存于-70℃，待用。
按照厂家推荐的使用说明，使用由3’-RACE系统试剂盒(Gibico-BRL公司)提供的Superscript逆转录酶和AP引物，从10μgRNA合成出cDNA第一链。AP引物由在5’端连续的17个dT残基和适合于方向性克隆的限制性酶切位点组成(5’GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT3’)。
在RNA酶H处理之后，将Pla l 1-特异cDNA(3’片段)从2μl cDNA第一链的合成反应混合物扩增出来。该扩增以自Pla l l N-末端5-10的氨基酸序列(23)推导出的简并的寡核苷酸链(Pla 1，表1)作为正义引物；以由3’-RACE 系统试剂盒提供的UAP(5’CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC3’)作为反义引物。通常，DNA扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行，引物的浓度为10μM，Taq DNA聚合酶(Gibico-BRL公司)的量为2.5个单位，反应混合物终体积为50μl。 DNA扩增的条件就是厂商推荐使用的酶的条件，以各反应中所用的特异引物的函数来调节退火温度。对于这一特定反应，退火温度为51℃。在PCR反应中使用的仪器为Gene ATAQ(Pharmacia)程控热控制仪。
通过1.2％琼脂糖/TAE凝胶电泳分析，同分子量标准(100bp梯，MBI Fermentas公司)相比，PCR产物显示出分子大小约为700bp的片段，这同由该蛋白质的分子量大小推知的相应DNA片段大小相一致。
表1为克隆、测序和表达Pla l 1设计的引物序列。引物 5’←3’序列 用途Pla 1 CAYCCNGCNAARTTYCAYGT 3’RACEPla 2 CGGAATTTCACTACAATCGGGCCTGCCGC 5’RACEPla 3 CCAATTGCACTTGTGCCCCTGCCATGCGTTCGC 5’RACEPla 4 ACACAAACATCTCATCCCGC 3’RACEPla 5 CTCGAGAAAAGAGAGACACAAACATCTCATCCCGC 表达Pla 6 GGGAATTCTTAACACCCAGGGGC 表达
N表示A，T，G，C中任何一个均可出现在该位置
Y表示C或T中任何一个均可出现在该位置
R表示A或G中任何一个均可出现在该位置
实施例2：
这个实施例描述了Pla l 1-cDNA 3’片段的克隆与测序。
将通过3’-RACE PCR扩增出的Pla l 1-cDNA 3’片段从琼脂糖凝胶中纯化出来，然后将之克隆入携带有T核苷悬挂末端的pGEM Easy载体中(Promega公司)[26]，该质粒携带有可用于筛选转化株的氨苄青霉素抗性基因以及位于克隆位点两侧的多个限制性酶切位点。在T4DNA连接酶的作用下，4℃孵育16小时进行连接反应。之后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中。利用Wizard Plus Minipreps(Promega公司)的方法将质粒DNA从重组转化株中制备出来。为了证实筛选出的转化株含有目的插入序列，将质粒DNA的样品用EcoR I(Boehringer公司)消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析。利用双脱氧核苷酸链末端终止法[27]测定几个克隆的完全双链核苷酸序列。DNA测序工作是利用ABI PRISM Dye Terminator系统和ABI377自动测序仪(AppliedBiosystem公司)进行。
编码Pla l 1的cDNA序列含有3’非翻译区序列和多聚腺苷酸尾(Poly A)。不同克隆之间编码区和非编码区都存在一些差异。当提到编码完整的Pla l 1过敏原克隆序列时，这些差异将被公开和广泛的讨论(实施例4)。上文所得到的序列允许我们从无多态性位置的序列延伸部分去设计特异性的引物。如下述实施例中所描述的，为了清晰的阐明蛋白质N-末端和信号肽相对应的核苷酸序列(Pla 2和Pla3，表1)，将这些引物用于5’-RACE。
实施例3：
这个实施例描述了Pla l 1的5’片段的合成、扩增、克隆和测序过程，该5’部分包括编码该蛋白质的前导肽和N-末端片段的核酸序列。
cDNA第一链的合成和Pla 1-cDNA的5’片段扩增利用5’-RACE系统试剂盒(Gibico-BRL公司)进行，特异引物来自于在实施例2描述中得到的Pla l 1的cDNA的3’部分核酸序列(Pla 2和Pla 3，表1)。简单的说，cDNA第一链从10μgRNA合成，以基因特异的反义引物(Pla2，表1)，在Superscript逆转录酶(Gibico-BRL公司)作用下合成出来的。在cDNA第一链合成之后，用RNase Mix(RNase H和RNase T1，Gibico-BRL公司)处理以去除原始的mRNA模板。用试剂盒中的GlassMax Spin Cartridge将未参入的dNTPs、Pla 2以及蛋白同cDNA分离。使用末端脱氧核苷酸转移酶和dCTP向cDNA的3’末端加上多聚尾巴。该加尾反应在冰上孵育1个小时得以完成。由于该反应在PCR兼容缓冲液中进行，所以等份该反应液可不经过任何中间纯化步骤直接用于PCR扩增。dC-cDNA的扩增利用Taq DNA聚合酶、一个嵌套的Pla l 1特异引物(Pla 3，表1)和一个由试剂盒提供的含脱氧次黄苷的锚引物(AP2，5’GGCCACGCGTCGACTAGTACGG GIIGGGIIGGGIIG3’)来进行。该反应的退火温度为65℃。通过1.2％琼脂糖/TAE凝胶电泳分析，同分子量标准对比，PCR产物显示出一个分子大小约为300bp的片段，这同预计的DNA片段大小相一致。将通过PCR的方法扩增出的Pla l 1-cDNA的5’片段从琼脂糖凝胶中纯化出来，之后将之克隆入pGEM T Easy载体中(Promega公司)。然后采用实施例2所述方法进行测序。利用双脱氧核苷酸链末端终止法测定三个克隆的双链完全核苷酸序列，这些序列示于SEQ ID.：1中。在所有的测序克隆中，编码前导肽的核苷酸序列具有相同的长度(相应于25个氨基酸残基的75碱基)。仅仅在克隆14的前导肽的核苷酸序列中发现了一个碱基置换情况，这暗示了一个氨基酸改变(SEQ ID.：2)。关于相应于成熟蛋白质的延伸序列，前86个碱基没有发生突变。在克隆14中第87个碱基发生了变化。该变化将在实施例4中深入讨论。根据成熟蛋白质N-末端建立的确定序列，设计出非简并的20个核苷酸长的引物(Pla 4，表1)。该引物被用于3’扩增以获得编码成熟蛋白质的全长克隆，该基因在实施例4和5的描述中将被用于测序和Pla l 1的表达。
实施例4：
这个实施例描述了以成熟蛋白质N-末端起始的Pla l 1-特异cDNA的克隆和序列。
以花粉RNA进行cDNA第一链的合成和Pla l 1-特异cDNA的3’RACE扩增，除了扩增的退火温度为55℃和使用的引物为相应于成熟的Pla l 1过敏原氨基酸序列上1-7位的Pla 4(表1)，其它步骤均按照实施例1中的描述操作进行。采用实施例2描述的方法，将PCR产物从琼脂糖凝胶中纯化出来，克隆入pGEM T Easy载体，然后对其进行测序。利用双脱氧核苷酸链末端终止法测定这几个克隆的双链完全核苷酸序列。核苷酸序列的长度从674-704bp不等。这些差异可能是由于每个克隆中的Poly A长度的不同以及3’非翻译区中存在的一些差异造成的。根据核酸序列的分析，可将这些cDNA克隆分为三组，每一组均编码Pla l 1同种过敏原性(isoallergenic)变体。在SEQID.：3中，给出了各组代表克隆的核苷酸序列。这些克隆序列显示，它们都编码了一个131个氨基酸残基的成熟蛋白质。在编码区，序列的多态性在四个位置(87，173，244，297)被观察到。在利用5’RACE扩增所得到的克隆中可以观察到87位置处的序列多态性(实施例3)。在87和297位置发生的核苷酸替换均未导致相应氨基酸(由核苷酸序列推导出的)的突变。然而，在173和244位置处发生的多态性分别导致了在氨基酸序列上58和82位置处的氨基酸的变化。SEQ ID.：4描述了由这三组已测过序列的克隆中的典型克隆编码的成熟蛋白质氨基酸序列的比较结果。克隆1.2编码的是一个在58位置上为谷氨酸、在82位置上为丝氨酸的氨基酸序列。克隆1.6编码的是一个在58位置上为甘氨酸、在82位置上为丝氨酸的氨基酸序列。克隆1.4编码的是一个在58位置上和在82位置上均为甘氨酸的氨基酸序列。根据IUIS对过敏原命名的规则，由这些基因编码的蛋白质均应被认为是变体。因此，它们被命名如下：Pla l 1.0101是指由Pla l 1.2代表的那组克隆编码的过敏原。Pla l 1.0102是指由Pla l 1.6代表的那组克隆编码的过敏原。Pla l 1.0103是指由Pla l 1.4代表的那组克隆编码的过敏原。所有突变体在序列中都含有6个半胱氨酸残基，并且在107位置处还含有一个潜在的N-糖基化位点。成熟的Pla l 1过敏原突变体0101、0102、0103肽骨架分子量分别为14521、14463、14433。由Pla l 1过敏原突变体的氨基酸序列推导出的亲水性的比较结果显示：氨基酸序列的改变并没有显著改变它们的表面性质，因而它们也可能并没有改变该蛋白的抗原特征。
实施例5：
这个实施例描述的是重组Pla l 1过敏原变体0101在巴斯德毕赤氏酵母中的表达。
巴斯德毕赤氏酵母是一种甲基营养酵母，只要环境中没有其他可利用的碳源，它就可以利用甲醇作为碳源。编码具有醇氧化酶活性的蛋白质的两个基因AOX1和AOX2存在于巴斯德毕赤氏酵母基因组中。当甲醇为唯一可利用的碳源时，AOX1产物占总表达蛋白的80％。利用这一优点，巴斯德毕赤氏酵母表达系统基本上以目的基因替代AOX1，另一方面，所使用的酵母菌株GS115his4的生长要依赖于培养基中的组氨酸。
表达载体pPIC9(invitrogen公司)被用于在巴斯德毕赤氏酵母菌株中的表达。该载体携带有编码啤酒糖醇母(Saccharomycescerevisiae)α-交配因子信号肽的DNA序列，该序列位于插入基因的多克隆位点的上游。这个信号肽可被酵母有效识别，从而导致异源蛋白质在酵母菌中的大量分泌表达。编码这一信号肽的DNA和多克隆位点均位于AOX1位点的3’端和5’端之间，从而引发DNA重组。不仅如此，该载体还含有一个细菌复制起点、一个氨苄青霉素抗性基因(用于筛选细菌中的转化株)、一个组氨脱氢酶基因HIS4，使细胞可生长在不含组氨酸的培养基中，用于筛选酵母中的转化株。
为了表达，首先利用PCR(使用Gibico-BRL公司生产的商品3’RACE系统试剂盒)扩增Pla l 1基因编码区。以来自花粉mRNA的cDNA第一链作为模板、两个非简并引物为：正义引物CTCGAGAAAAGAGAGACACAAACATCTCATCCCGC(Pla 5)，反义引物GGGAATTCTTAACACCCAGGGGC(Pla 6)。它们各自同蛋白质编码区3’末端和5’末端相杂交，与编码α-交配因子前原序列(preprosequence)的DNA序列同框，存在于质粒pPIC9中。Pla 5还含有一个Xho I限制性酶切位点(下划线的部分)和一个谷氨酸的密码子，该谷氨酸能够使酵母对信号肽进行加工。反义引物含有一个终止密码子和一个EcoR I限制性酶切位点(下划线的部分)。扩增的退火温度设置为65℃。
如实施例2所述那样，将PCR产物从琼脂糖凝胶中纯化出来，直接将之克隆入带有兼容的T核苷悬挂末端的pGEM T Easy载体中。之后将这个构建体转化入大肠杆菌DH5α细胞中。然后利用氨苄青霉素抗性筛选转化株。利用双脱氧核苷酸链末端终止法[27]测定几个克隆的完全双链核苷酸序列，从而确定了前导序列和Pla l 1基因符合同一阅读框的安排，并且证明了从起始序列没有发生任何改变。
分离上述质粒DNA并将之用Xho I-EcoR I限制性酶消化，消化后的DNA片段被亚克隆入质粒pPIC9的相同限制性酶切位点而构成pPIC9/Pla l 1.0101。
用限制性酶BgI II将质粒pPIC9/Pla l 1.0101线性化，利用电穿孔法将纯化的大片段转化入GS115细胞中。在30℃时，将转化后的细胞在最低限度的右旋糖平板上培养4-6天直到克隆的出现。筛选通过在AOX1座位处同源重组发生基因置换的构建物，其具有(His+Muts)表型，将His+克隆补(patch)在最低限度葡萄糖对最低限度甲醇的复制平板上。选择生长受阻的转化株用于rPla l 1的生产。
将所选的(His+Muts)转化株在30℃时在缓冲甘油复合培养基中培养4天。通过离心收集细胞，为了诱导AOX1启动子的表达，细胞被重悬于十五分之一原始体积的缓冲甲醇复合培养基中培养4天，并且每天要向每升培养物中补充5mL甲醇。然后在4℃、3000g条件下离心除去培养基中GS115诱导的的酵母细胞。用SDS-PAGE和ELISA反应(使用专门为Pla l 1特异设计的单克隆抗体)分析不同时间培养基上清中的rPla l 1的生产(29)。重组Pla l 1在培养4天后可达到最大表达水平。
使用在小规模实验产生最高产量的克隆在相似条件下进行大规模的rPla l 1的生产。重组过敏原的产量最后可达到20mg/L培养基。
实施例6：
这个实施例描述重组Pla l 1过敏原-突变体0101从培养基中的纯化以及纯化蛋白质的表征。
将如实施例5所述获得的培养基经水透析，剩余的物质作为纯化rPla l 1的原始材料。首先使用DEAE-5PW柱(Waters Chromatography公司)和溶于Tris缓冲液的乙酸钠梯度进行阴离子交换色谱层析。离子交换纯化后的重组过敏原经广泛的水透析。文献报道，其它应用于天然过敏原纯化的方法：如凝胶过滤色谱法(23)和使用单克隆抗体的亲和层析色谱法(29)，也用于重组过敏原的高纯度的生产。纯化的重组Pla l 1过敏原的SDS-PAGE分析显示，它同天然Pla l 1过敏原具有类似的电泳图案：胶上有两条明显的分子量为17和22KDa的主带，分别对应的是过敏原单体的糖基化和非糖基化形式(图1)，这也被使用PNGase F(Boehringer Mannheim公司)进行的过敏原去糖基化实验所证实。用PNGase F处理可使22KDa带转变为17KDa(非糖基化)的条带(图1)。同时，这些结果也被MALDI-TOF质谱所证实。质谱也证实了在SDS-PAGE胶上32-36KDa之间较宽的弥散的条带为过敏原单体形成的二聚体。纯化的重组Pla l 1过敏原的N-末端氨基酸测序结果和氨基酸组成分析结果也证实了在巴斯德毕赤氏酵母中表达的蛋白质为Pla l 1。在蛋白质N-末端处产生的额外谷氨酸是为了让重组DNA构建体在酵母中表达对重组DNA进行修饰的结果。
表征已表达的重组过敏原的技术也能够提供关于它的纯度的一些信息。考马斯亮兰染色的SDS-PAGE胶的密度计量显示：rPla l 1的纯度大于95％。HPLC色谱和MALDI-TOF质谱也给出了类似的结果。另外，通过埃德曼降解该蛋白质得到了一个没有污染的唯一序列。这事实上证明了该蛋白质的纯度已经达到了99％以上。
另外，也可通过单克隆抗体和来自车前草过敏的患者的血清对重组Pla l 1过敏原进行免疫化学表征。重组蛋白质可被由天然过敏原产生的单克隆抗体2A10(29)所识别，表明了其含有相同抗原决定簇。这也暗示了重组蛋白质的折叠同天然过敏原是非常相似的。圆二色谱的测定结果反过来又证实这个推测。在圆二色谱的远紫外区，重组过敏原和天然过敏原的谱图几乎是相同的(图2)。另一方面，对重组Plal 1进行的一组抗来自车前草过敏的患者的血清的实验结果显示，大部分患者的血清都显示出了阳性反应。不仅如此，在一个来自于患者血清的特异IgE同天然Pla l 1结合的抑制实验中，重组过敏原给出了一个同天然过敏原平行的抑制曲线，可以达到80％的IgE-结合抑制率(图3)。所有这些结果都表明了大多数存在于天然过敏原中引起过敏的抗原决定部位也都存在于重组过敏原中，因此它是诊断车前草过敏的患者的一个足够的工具。
实施例7：
这个实施例描述了过敏原Pla l 1抗原决定部位的序列、结构和位置的鉴定方法。
过敏原Pla l 1序列抗原决定部位的序列和位置的鉴定是通过部分重叠肽段的方法得到整个氨基酸序列。这些肽段的氨基酸序列是由SEQ ID.：4中显示出的序列中推导出来的。这些肽段由化学法合成或作为重组蛋白而合成，具体讲就是通过在合适载体中插入相应的核酸序列并在宿主细胞表达。利用免疫实验或其它免疫化学技术来检测有能力同特异抗体(取自于过敏性患者血清的IgE或单克隆抗体等)结合的肽，从而鉴定B细胞抗原表位。不仅如此，还可利用T细胞增殖实验来检测上述肽段中哪些能够形成T细胞抗原表位部分。
能得到Pla l 1核酸序列及表达出的重组过敏原有助于对过敏原上构象表位进行鉴定。使用X射线晶体衍射法和核磁共振技术对重组过敏原结构进行分析，我们已经得到了抗原表位的三维结构的数据。或者，使用计算机预测算法分析氨基酸序列去寻找潜在的可形成抗原表位的表面残基。另外，利用定点突变来产生Pla l 1变体，置换可能参与形成B细胞抗原表位的氨基酸残基。分析这些变体对抗体的结合能力来确定组成抗原表位的那些残基。
对于治疗车前草过敏症来说，具有减弱的IgE结合能力的肽和重组Pla l 1变体是一种安全有效的备选药物。
实施例8：
利用蛋白质的序列数据库，比较了Pla l 1的三个变体同已知蛋白质的序列，结果在表2中给出。
表2 P la l 1.0101 P la l 1.0102 P la l 1.0103 过敏原 Mm PI N°R ％I ％S ％I ％S ％I ％S 推测的Ole e 1 (疣皮桦) 18384 8.12 166 42.2 72.7 41.4 71.9 40.6 71.8 Lig v 1 16400 5.91 145 39.5 69.0 39.5 69.0 38.8 69.0 Ole e 1 16330 6.18 145 38.8 68.2 38.8 68.2 39.5 68.2 Lol p 11 14876 5.10 134 28.8 50.8 28.0 50.0 49.2 27.3
表2：Pla l 1过敏原同源物的分子特征。序列同一性(％I)和相似性(％S)的百分比。PI，等电点；Mm，分子量；N°R，残基数量。前三个过敏原的氨基酸序列在Swiss-Prot Data Bank中列出。登记号：049813代表桦树推测的Ole e 1，082016代表Lig v l，P19963代表Ole e 1。Lol p 11序列在NCBI Data Bank中列出，登记号为A54002。
参考文献
1.Jarvis D，Burney P(1997)Epidemiology of atopy and atopic disease.InAllergy and Allergic Diseases，1st edn，pp 1208-24.Blackwell Science，Oxford.
2.Bousquet J，Lockey RF，Malling H-J.WHO Position Paper.AllergenImmunotherapy：therapeutic vaccines for allergic diseases.Allergy1998；53 Suppl：1-42.
3.Carreira J，Lombardero M，Ventas P.New developments in in vitromethods.Quantification of clinically relevant allergens in mass units.Arb Paul Ehrlich Inst Bundesant Sera Impstoffe Frank AM 1994；87：155-64.
4.Valenta R，Vrtala S，Laffer S，Spitzauer S，Kraft D.Recombinantallergens.Allergy 1998；53：552-61.
5.Spieksma FThM，Charpin H，Nolard N，Stix E.City spore concentrationin the European Economic Community(EEC).Clin Allergy 1980；10：319-29.
6.Negrini AC，Arobba D.Allergenic pollens and pollinosis in ltaly：recentadvances.Allergy 1992；47：371-9.
7.Peat JK，Woolcock AJ.Sensitivity to common allergens：relation torespiratory symptoms and bronchial hyper-responsiveness in chlldrenfrom three different climatic areas of Australia.Clin Exp Allergy1991；21：573-81.
8.Lewis WH，lmber WE.Allergy epidemiology in the St.Louis Missouriarea.IV.Weeds.Ann Allergy 1975；35：180-7.
9.Bernton HS.Plantain hay fever and asthma.JAMA 1925；84：944-6.
10.Blumstein GI，Tuft L.Plantain hay fever.Its incidence and importance.JAMA 1937；108：1500-2.
11.Derrick E.Relative importance of various plants in causation of hayfever and asthma in Australia.Med J Aus 1962；1：972-7.
12.Bryant DH，Burns MW.Skin-prick test reactions to inhalant allergens inasthmatic patients.Med J Aust 1976；1：918-24.
13.Krilis S，Baldo BA，Basten A.Detailed analysis of allergen specific IgEresponses in 341 allergic patients.Associatiohs betwaen allergens andbetween allergen groups and clinical diagnoses. Aust NZJ Med1985；15：421-6，
14.D’Amato G，Lobefalo G.Allergenic pollens in the southernMediterranean area.J Allergy Clin Immunol 1989；83：116-22.
15.Bousquet J，Cour P，Guerin B，Michel FB.Allergy in the Mediterraneanarea I. Pollens counts and pollinosis of Montpellier.Clin Allergy1984；14：249-58.
16.Merrett TG，Pantin CFA，Dimond AH，Merrett J.Screening for IgE-mediated allergy.Allergy 1980；35：491-501.
17.Mehta V，Wheeler AW.IgE-mediated sensitization to English Plantainpollen in seasonal respiratory allergy：identification and partialcharacterization of its allergenic components.Int Arch Allergy ApplImmunol 1991；96：211-7.
18.Subiza J，Jerez M，Jiménez JA，Narganes MJ，Cabrera M，Varela S，Subiza E.Clinical aspects of allergic disease.Allergenic pollen andpollinosis in Madrid.J Allergy Clin Immunol 1995；96：15-23.
19.González FJ，Herrero B，Candau P.Latitudinal study of allergic pollen intwo Spanish cities.J Invest Allergol Clin Immunol 1993；3：304-10.
20.García-González JJ，Vega-Chicote JM，Rico P，Moscoso del Prado J，Carmona MJ，Miranda A et al.Prevalence of atopy in students fromMalága，Spain.Ann Allergy Asthma lmmunol 1998；80：237-44.
21.Baldo BA，Chense QJ，Howden MEH，Sharp PJ.Allergens fromPlantain(Plantago lanceolata).Studies with pollen and plant extracts.Int Archs Allergy Appl Immun 1982；68：295-304.
22.Dreborg S，si_grenl，Erikson EN，Eirarsson R.Selection of patients forbiological standardization as exemplified by standardization of mugwort，goosefoot and English Plantain pollen allergen extracts/preparations.Allergy 1987；42：485-95.
23.Calabozo B，Barber D，Polo F.Purification and characterization of themain allergen of Plantago lanceolata pollen，Pla l 1.Clin Exp Allergy2001；31：322-30.
24.Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T(1989)Molecular Cloning：aLaboratory Manual，2nd edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY.
25.Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Analyt Biochem1987；162，156-9.
26.Marchuk D，Drumm M，Saulino A，Collins FS.Construction of T-vectors，a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCRproducts.Nucleic Acids Res 1991；19，1154.
27.Sanger F，Nicklen S，Coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc Natl Acad Sci USA 1977；74，5463-7.
28.King TP，Hoffman D，Lowenstein H，Marsh DG，et al.Allergennomenclature.Clin Exp Allergy 1995；25：27-37.
29.Calabozo B，Duffort O，Carpizo JA，Barber D，Polo F.″Monoclonalantibodies against the major allergen of Plantago lanceolata pollen，Plal 1.Affinity chromatography purification of the allergen and developmentof an ELISA method for Pla l 1 measurement” Allergy 2001；56：429-35.
30.Calabozo B，Diaz-Perales A.，Salcedo G.Barber D.，Polo F.″Structuraland antigenic similarity between Pla l 1 and Ole e 1，the major allergensof English Plantain and Olive pollens”.Abstract No.51，Journal ofAllergy and Clinical Immunology(2001)，Vol.107，No.2，page S15.
序列表
SEQ ID NO.：1
Clon 12
GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGCATAA
ACAAATAAATAAAG 60
Clon 3 GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGGG--
ATAAACAAATGAATAAAG 55
Clon 14 GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGA----
----AAAAAAAG 43
********************* ** *****
Clon 12
ACAACTATAAAAGAAAAAAAAGGAATAAATTAAAAAAATGGTAAAGCTCA
CACAAGTTGC 119
Clon 3
ACAACTAAAAAAGAAAAAAAAGGAATAAATTAAAAAAATGGTAAAGCTCA
CACAAGTTGC 115
Clon 14 A-----AAAAAAGAAAAAAAGAA--
AAAAATATGGTAAAGCTCACACAAGTTGC 90
* **** * ****** *** ***** *******
Clon 12
AGCAATACTCTTAATCGGGGCCTTCTTCTTGATAGCCTCCCCTTCCATAG
CTACACAAAC 179
Clon 3
AGCAATACTCTTAATCGGGGCCTTCTTCTTGATAGCCTCCCCTTCCATAG
CTACACAAAC 175
Clon 14
AGCAATACTCTTAATCGGGGCCTTCTTCTTGATAGCCTCCACTTCCATAG
CTACACAAAC 150
********************* ************
Clon 12
ATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGAGGTATACTGCAATGTT
TGTCACAGCAG 239
Clon 3
ATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGAGGTATACTGCAATGTT
TGTCACAGCAG 235
Clon 14
ATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGAGGTATACTGCAATGTT
TGTCACAGCAG 210
*********************************
Clon 12
AAATTTAATCAATGAACTCA
292
Clon 3
AAATTTAATCAATGAACTCA
288
Clon 14
AAATTTAATCAATGAACTTA
263
****************** *****************************
SEQ ID NO.：2
-20 -10
Clon12 M V K L T Q V A A I L L I G A F F L I A S P S I A
Clon3 ----------------------------------
Clon14 -----------------------------T--
SEQ ID NO.：3
Pla | 1.2
ACACAAACATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGA
GGTATACTGCAATGTTTGT 60
Pla | 1.6
ACACAAACATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGA
GGTATACTGCAATGTTTGT
Pla | 1.4
ACACAAACATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGA
GGTATACTGCAATGTTTGT
**********************************
Pla | 1.2
CACAGCAGAAATTTAATCAATGAACTCAGCGAACGCATGGC
AGGGGCACAAGTGCAATTG 120
Pla | 1.6
CACAGCAGAAATTTAATCAATGAACTTAGCGAACGCATGGC
AGGGGCACAAGTGCAATTG
Pla | 1.4
CACAGCAGAAATTTAATCAATGAACTTAGCGAACGCATGGC
AGGGGCACAAGTGCAATTG
****************** **************
Pla | 1.2
GATTGCAAAGATGATTCTAAAAAAGTCATATACTCTATAGGG
GGTGAGACTGATCAAGAT 180
Pla | 1.6
GATTGCAAAGATGATTCTAAAAAAGTCATATACTCTATAGGG
GGTGAGACTGGTCAAGAT
Pla | 1.4
GATTGCAAAGATGATTCTAAAAAAGTCATATACTCTATAGGG
GGTGAGACTGGTCAAGAT
***************************** ******
Pla | 1.2
GGTGTTTACCGCCTGCCTGTTGTAGGCTATCACGAAGATTG
TGAAATCAAACTAGTGAAG 240
Pla | 1.6
GGTGTTTACCGCCTGCCTGTTGTAGGCTATCACGAAGATTG
TGAAATCAAACTAGTGAAG
Pla | 1.4
GGTGTTTACCGCCTGCCTGTTGTAGGCTATCACGAAGATTG
TGAAATCAAACTAGTGAAG
**********************************
Pla | 1.2
AGCAGCAGGCCCGATTGTAGTGAAATTCCGAAACTTGCAAA
GGGAACAATTCAAACCTCG 300
Pla | 1.6
AGCAGCAGGCCCGATTGTAGTGAAATTCCGAAACTTGCAAA
GGGAACAATTCAAACCTCG
Pla | 1.4
AGCGGCAGGCCCGATTGTAGTGAAATTCCGAAACTTGCAAA
GGGAACAATTCAAACATCG
*** ************************** ***
Pla | 1.2
AAAGTGGACCTTTCAAAAAACACAACCATCACCGAAAAAACA
CGTCATGTCAAGCCACTG 360
Pla | 1.6
AAAGTGGACCTTTCAAAAAACACAACCATCACCGAAAAAACA
CGTCATGTCAAGCCACTG
Pla | 1.4
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CGTCATGTCAAGCCACTG
**********************************
Pla | 1.2
AGCTTTCGCGCAAAGACGGATGCCCCTGGGTGTTAAaggatg
ctgcagagggcgattaat 420
Pla | 1.6
AGCTTTCGCGCAAAGACGGATGCCCCTGGGTGTTAAaggatg
ctgcagagggcgattaat
Pla | 1.4
AGCTTTCGCGCAAAGACGGATGCCCCTGGGTGTTAAaggatg
ctgcagagggcgattaat
********************************
Pla l 1.2 tgtacaagtccaattttcataataacaagcgttcaatgtgattcctttttcttgttttct 480
Pla l 1.6 tgtacaagtccaattttcttaataacaagcgttcaatgtgattcctttttcttgttttct
Pla l 1.4 tgtacaagtccaattttcttaataacaagcgttcaatgtgattcctttttcttgttttct
*************** ************************************
Pla l 1.2 tgttttctttttgttcccccagttttgtagtagtattcaaagttcaataaggtgtttcc 540
Pla l 1.6 tgttttcttttttgttcccccagttttgtagtagtattcaaagttcaataaggtgtttcc
Pla l 1.4 tgttttcttttttgttcccccagttttgtagaagtattcaaagttcaataaggtgtttcc
******************************* *********************
Pla l 1.2 agaccctggttgaggttggtttctcaggatactgatgaacctttttattatctatgagta 600
Pla l 1.6 agaccctggttgaggttggtttctcaggatactgatgaacctttttattatctatgagta
Pla l 1.4 agaccctggttgaggttggtttctcaggatactgatgaacctttttattatctatgagta
******************************** ******************
Pla l 1.2 gttatacgcaaaagtttggatagt-------------gtttatatttaaatggaat 643
Pla l 1.6 gttatacgcaaaagttttgcaagcagtgagaaatcactgtagtttatatttaaatggaat
660
Pla l 1.4 gttatacgcaaaagtttggatagt-----------gtttatatttaaatggaat 643
************* * ** ****************
Pla l 1.2 ttgatgttcttacaattcg(a)42 704 Pla l 1.0101
Pla l 1.6 ttgatgttcttac(a)19 692 Pla l 1.0102
Pla l 1.4 ttgatgttcttac(a)23 679 Pla l 1.0103
*************
SEQ ID NO.：4
10 20 30 40 50 60
Pla l 1.2 TQTSHPAKFH VEGEVYCNVC HSRNLINELS ERMAGAQVQL
DCKDDSKKVI YSIGGETDQD
Pla l 1.6 ----- ----- ----- ----- ----- -----G--
Pla l 1.4 ----- ----- ----- ----- ----- -----G--
70 80 90 100 110 120
Pla l 1.2 GVYRLPVVGY HEDCEIKLVK SSRPDCSEIP KLAKGTIQTS
KVDLSK TEKTRHVKPL
Pla l 1.6 ----- ----- -S----- ----- ----- -----
Pla l 1.4 ----- ----- -G----- ----- ----- -----
130
Pla l 1.2 SFRAKTDAPG C Pla l 1.0101
Pla l 1.6 ----- - Pla l 1.0102
Pla l 1.4 ----- - Pla l 1.0103