编码表位结合型β2m且感染哺乳动物细胞 的病毒载体及其应用 【技术领域】
本发明涉及编码表位结合β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体及其利用。
背景技术
MHC(主要组织相容性复合体)I类分子是由重链(HC)和β2微球蛋白(β2m)组成的异二聚体，存在于体内几乎全部细胞的细胞膜表面。I类MHC分子中由重链构成的肽容纳沟能容纳约10个氨基酸的肽。该I类MHC/肽复合体被起细胞免疫作用的细胞毒性T细胞(CTL)上的T细胞受体(TCR)识别，因此在I类MHC分子上呈递的肽称为“表位”(抗原决定簇)。
来自细胞质内产生的自身抗原、或病毒抗原、肿瘤抗原等的肽片段通过粗面内质网上的TAP(与抗原加工相关的转运体)运到粗面内质网，在那与I类MHC重链和β2m形成稳定的I类MHC/肽复合体。β2-微球蛋白分子起维持I类MHC立体结构的稳定性和将H链转运到细胞表面的作用(TasukuHonjo和Takeshi Watanabe(ed.)，“Immune System：Recognition，differentiation，and proliferation”，The Molecular Biology Society of Japan(ed.)，Maruzen Co.，Ltd.，Tokyo：p117-118)。已知没有结合肽的I类MHC分子在37℃地培养条件下非常不稳定。
表位是被I类MHC分子呈递的肽，它是诱导对某些抗原的特异性细胞免疫的非常重要的分子。目前正在尝试开发针对以HIV为代表的病毒感染或癌症的免疫治疗的肽疫苗。但是来自大多数病毒抗原或肿瘤抗原的主要表位的肽与I类MHC分子的结合很弱，当仅用肽作为疫苗时，因其稳定性低，也不能期待有一般的效果。1998年采用了进行过氨基酸取代以在不损害抗原性的条件下提高与I类MHC分子结合的活性的人工表位。但这种稳定性、抗原性优良的表位的鉴定和开发非常烦杂和困难。
另一方面，已知β2m增加I类MHC分子上肽的稳定性的现象，目前正在开发能利用该β2m的辅助效果的系统。
近年来，正在尝试表达I类MHC/肽复合体，其中已将表位肽与MHC I和II类分子或β2m融合(Uger，R.A.和Barber，B.H.，J.Immunol.160：1598-1605(1998)；White，J.等，J.Immunol.162：2671-2676(1999)；Kang，X.等，Cancer Res.57：202-205(1997)；Uger，R.A.等，J.Immunol.162：6024-6028(1999)；USP No.5,869,270)。有报告指出，那些利用接头使表位肽序列融合到β2m的N末端(表位结合β2m，也表示为“e/β2m”)而形成的复合体，与单独的肽相比，稳定性以及CTL识别都增加，特别是用与I类MHC分子结合力弱的表位构建的那些复合体。但是，这些报告中主要使用大肠杆菌表达载体，尚不知道采用感染哺乳动物细胞的病毒载体的例子。如果使外源蛋白在大肠杆菌中大量表达，则经常发现形成包涵体(inclusion body)而不溶的情况。不溶性蛋白可以用尿素等变性剂溶解，然后进行蛋白质的重折叠，但并不是所有的蛋白质都可溶解，操作也烦杂。另外，还担心混入来自大肠杆菌的杂质。
另外，利用哺乳动物表达质粒进行基因导入的效果差，不能期望有充分的表达。使用哺乳动物表达质粒的另一缺点是，这种质粒必须转移到核中进行表达，因此它们只能在核膜已消失的分裂期细胞中表达。
I类MHC/肽复合体也可以用于抗原特异性CTL的分析。个体内抗原特异性CTL的频率定量以往可以采用所谓有限稀释分析的方法，但必需长期进行体外培养，并且灵敏度差，因此1996年开发了简便并且灵敏度好的“I类MHC/肽四聚复合体(四聚体)(Altman，J.D等，Science 274：94-96(1996))。它是利用生物素-抗生物素蛋白的结合将I类MHC/肽复合体四聚体化，然后添加荧光标记所得的物质，它用于FACS分析。该方法可以直接利用从个体分离的外周血单核细胞进行测定，因此简便并且直接反映个体内的频率，并且具有很高的灵敏度和特异性(Wilson，J.D.K.等，J.Exp.Med.188：785-790(1998)；Kuroda，M.J.等，J.Exp.Med.187：1373-1381(1998))。现在正如下制备包含人I类MHC分子的I类MHC/肽复合体：在大肠杆菌中使重链(HC)和β2m蛋白分别表达，纯化，然后将它们与合成肽进行体外折叠。
相反，对于小鼠I类MHC分子，有报告指出，采用杆状病毒载体制备来自昆虫细胞的I类MHC/肽复合体(White，J.等，J.Immunol.162：2671-2676(1999))。在该系统中，通过用分别表达I类MHC重链和表位结合β2m的杆状病毒共感染，在细胞内制备I类MHC/肽复合体。但是，尚不知采用感染哺乳动物细胞的病毒载体的例子。杆状病毒载体是表达昆虫细胞(例如Sf9细胞)中位于有效启动子下游的外源基因的系统(特表平6-502990)，因此不能利用来自哺乳类的细胞。另外，虽然Punnonen等已经公开了用于DNA改组的基因疫苗载体(Punnonen，J.等，Genetic Vaccine Vector Engineering，USP专利申请No.20010006950)，但尚不知道编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体。
【发明内容】
本发明提供编码表位结合β2m的哺乳动物细胞感染性细胞病毒载体及其应用。
为了建立在哺乳动物细胞中大量表达表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体的系统，本发明人尝试构建采用感染哺乳动物细胞的病毒载体的表达系统。为了实现此目的，本发明人用可以感染众多哺乳动物种类并且可以极高水平地表达导入基因的重组仙台病毒(rSeV)，构建了I类MHC/肽复合体和表位结合型β2m的SeV表达系统。
本发明人以来自HIV-1Nef和Env蛋白的表位为例，构建了表达表位结合型β2m的SeV载体，并将其导入哺乳动物，以分泌型蛋白质的形式成功地回收了大量表位结合型β2m。发现回收得到的表位结合型β2m与细胞表面上的I类MHC重链结合，形成I类MHC/肽复合体，可以高效地将抗原呈递给CTL。由此表明，用动物感染性病毒载体制备的表位结合型β2m可以用作蛋白制剂。如果回收、纯化由载体导入细胞产生的表位结合型β2m，则可以得到临床上有用的抗原特异性细胞免疫诱导剂。
另外，本发明人构建了表达I类MHC重链的SeV载体，将其与表达表位结合型β2m的SeV载体一起共感染哺乳动物细胞，回收并纯化I类MHC/肽复合体。进一步地，用SeV载体表达在缺失I类MHC重链膜结合区域的分泌型I类MHC重链上添加生物素化基质肽的分子，将所得的I类MHC/肽复合体生物素化后，使RPE标记的抗生物素蛋白结合上述复合体，由此制备I类MHC/肽四聚体。该I类MHC/肽四聚体适合用于CTL的检测和定量。该四聚体由于来自动物细胞，因此添加了糖链，其灵敏度有望高于来自大肠杆菌的四聚体。
我们发现，用表达HLA-A*2402的SeV载体和表达β2m(其与HIV-1 Nef蛋白的表位结合)的SeV载体进行共感染，与脉冲给与来自HIV-1Nef蛋白的合成表位肽相比，能使细胞被抗原特异性CTL等效或更高效地识别。另外，检测从SeV载体导入细胞回收的表位结合型β2m的效果，结果发现，通过将表位结合型β2m添加到靶细胞的培养液中，成功诱导了对靶细胞的抗原特异性CTL反应。这些结果表明编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体可以用于在体内或回体基因治疗中诱导抗原特异性免疫反应。通过在体内产生所需I类MHC/肽复合体，则可以实现比单独的肽疫苗更有效的免疫治疗。
如上所述，本发明人确立了在哺乳动物细胞内高效地产生表位结合型β2m的方法，并制备了包含该表位结合型β2m的分泌型和膜结合型I类MHC/肽复合体。进一步地，本发明人开发了制备I类MHC/肽四聚体的新系统，该四聚体可以用于个体内抗原特异型细胞毒性T细胞(CTL)的检测和定量。本发明人还通过使上述生成系统制备的表位结合型β2m蛋白质与细胞表面的I类MHC分子结合，将抗原呈递给抗原特异性CTL。另外，本发明人用表达表位结合型β2m的病毒载体和表达I类MHC重链的病毒载体共感染靶细胞，建立了诱导抗原特异性CTL识别的系统。
用本发明提供的载体可以在哺乳动物细胞中使所需的表位结合型β2m大量表达，所得的表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体对抗原特异性CTL的检测和定量、使用纯化的表位结合型β2m蛋白质在I类MHC上呈递抗原、以及通过体内和回体导入载体来诱导抗原特异性细胞性免疫极其有用。特别是本发明的载体适合用于诱导对病毒或细菌等感染的防御性免疫以及对癌症的免疫疗法等。
本发明涉及编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体及其利用，更具体地，本发明涉及：
(1)以可表达的方式编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体；
(2)(1)所述的病毒载体，其中所述感染哺乳动物细胞的病毒载体为副粘病毒载体；
(3)(2)所述的病毒载体，其中所述副粘病毒为仙台病毒；
(4)(1)～(3)之一的病毒载体，其中所述表位包含通过抗原呈递细胞呈递的表位肽的氨基酸序列或其一部分；
(5)(1)～(4)之一的病毒载体，其中所述表位是HIV-1病毒蛋白质的部分肽；
(6)(5)所述的病毒载体，其中所述表位包含SEQ ID NO：24或26记载的氨基酸序列或其一部分；
(7)(1)～(4)之一的病毒载体，其中所述表位是癌抗原的部分肽；
(8)(1)～(7)之一的病毒载体，其中表位和β2m之间包含饱和SEQ IDNO：13的氨基酸序列或其一部分；
(9)表位结合型β2m的生产方法，其包括以下步骤：
(a)将(1)～(8)之一的病毒载体导入哺乳动物细胞的步骤，
(b)从导入了所述载体的哺乳动物细胞或其培养上清中回收表位结合型β2m的步骤；
(10)通过(9)所述的方法生产的表位结合型β2m；
(11)包含表位结合型β2m的异二聚体的生产方法，其包括以下步骤：
(a)将(1)～(8)之一的病毒载体导入哺乳动物细胞的步骤，
(b)从导入了所述载体的哺乳动物细胞或其培养上清中回收生成的异二聚体的步骤；
(12)包含I类MHC重链和表位结合型β2m的I类MHC/肽复合体的生产方法，其包括以下步骤：
(a)将(1)～(8)之一的病毒载体导入哺乳动物细胞的步骤，
(b)从导入了所述载体的哺乳动物细胞或其培养上清中回收生成的I类MHC/肽复合体的步骤；
(13)(12)所述的方法，其进一步包括往所述哺乳动物细胞中导入表达I类MHC重链的病毒载体的步骤；
(14)(13)所述的方法，其中所述I类MHC重链为分泌型；
(15)(14)所述的方法，其中所述I类MHC重链包含生物素化基质肽；
(16)(13)～(15)之一的方法，其中所述I类MHC重链为A24限制性I类HLA重链；
(17)(16)所述的方法，其中所述A24限制性I类HLA重链来自A*2402；
(18)(15)所述的方法，其进一步包括将包含生物素化基质肽的I类MHC重链生物素化的步骤，和在抗生物素蛋白的存在下装配生物素化I类MHC重链的步骤；
(19)通过(12)～(18)之一的方法生产的I类MHC/肽复合体；
(20)(19)所述的I类MHC/肽复合体，其为四聚体；
(21)抗原特异性细胞免疫诱导剂，其包含(1)～(8)之一的病毒载体、(10)所述的表位结合型β2m或者(19)或(20)所述的I类MHC/肽复合体；
(22)一种药物组合物，其包(1)～(8)之一的病毒载体、(10)所述的表位结合型β2m或者(19)或(20)所述的I类MHC/肽复合体；
(23)哺乳动物细胞，其导入了(1)～(8)之一的病毒载体；
(24)一种细胞，其细胞表面具有(10)所述的表位结合型β2m；
(25)(23)或(24)所述的细胞，其外源性地导入了编码I类MHC重链的基因；
(26)(25)所述的细胞，其中所述I类MHC重链为膜结合型；
(27)(25)所述的细胞，其中所述I类MHC重链为分泌型；
(28)(23)～(27)之一的细胞，该细胞为树突细胞；
(29)抗原特异性细胞免疫诱导剂，其包含(23)～(28)之一的细胞；
(30)一种药物组合物，其包含(23)～(28)之一的细胞；和
(31)抗原特异性T淋巴细胞检测剂，其包含(19)或(20)所述的I类MHC/肽复合体。
本发明中，术语“表位”是指可以被免疫细胞识别的肽。免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞等。本发明优选的表位是被T细胞识别的肽。表位不仅是被抗原呈递细胞呈递的肽，也可以是被免疫细胞识别的所需的肽。例如，也可以用包含人工制备的氨基酸序列的肽作为表位。更优选表位包含被抗原呈递细胞(APC)呈递的肽或其一部分。本发明中作为表位的蛋白质或肽的“一部分”通常是包含8或8个以上连续氨基酸的部分，优选包含9个或9个以上，更优选10或10个以上、12个或12个以上、或15个或15个以上的连续氨基酸的部分。
本发明提供编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体。对感染哺乳动物细胞的病毒载体没有特别限制，可以用所需的任何病毒载体。本发明的感染哺乳动物细胞的病毒载体可以具有感染哺乳动物细胞以外的细胞的能力。作为载体，优选对宿主毒性小、导入基因的表达水平高的载体。可以用作本发明载体的病毒载体包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、塞姆利基(Semliki)森林病毒载体、新培斯病毒载体、痘苗病毒载体、禽痘病毒载体和仙台病毒载体等，但不限于这些。用这些载体系统可以构建表达表位结合型β2m的重组病毒载体。在本说明书中，“重组病毒载体”是指通过重组多核苷酸生成的病毒载体。重组多核苷酸是指并非在自然状态那样被结合的多核苷酸。更具体地，是指人为地将多核苷酸链重组或新生成的多核苷酸。“重组”病毒载体包括例如通过基因操作构建的病毒载体或将构建的载体进行基因扩增而得到的病毒载体。重组病毒载体可以通过例如使重组cDNA在宿主细胞中表达并重建病毒粒子而生成。
重组病毒载体可以通过本领域技术人员公知的方法制备。例如，基因治疗中最常用的腺病毒载体可以按照Saito等的方法(Miyake等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-24(1996)；Kanegae等，“Biomanual Series 4-GeneTransfer and Expression，Methods of Analysis”(in Japanese)，43-58(1994)，Yodosha)制备。例如，将包含31kb Ad DNA的42kb粘粒pAdexlcw(Kanegae等，Saiboukougaku，13(8)：757-763(1994))用适当的限制酶例如SwaI等切割，所述31kb Ad DNA包含腺病毒(Ad)5型基因组除E1和E3区域外的几乎全部长度，然后通过凝胶过滤等适当脱盐纯化。将经过切割的粘粒用外源基因表达单元以及T4 DNA连接酶进行连接反应后，进行热处理使酶失活，所得裂解物通过凝胶过滤脱盐，然后用SwaI切割。切割产物用苯酚进行酶失活处理后脱盐，再用SwaI切割。一部分产物用Gigapack XL试剂盒(Stratagene，美国)进行体外包装。将连接产物导入大肠杆菌，从所得的数个氨苄青霉素抗性转化体制备粘粒，通过限制酶消化分析其结构，以便分离已将外源基因表达单元插入目的方向(与E1A和E1B转录相反的方向)的重组粘粒。另一方面，按照Saito等的方法(Kanegae等，“Biomanual Series 4-Gene Transfer and Expression，Methods of Analysis”(in Japanese)，43-58(1994)，Yodosha)制备缺失E1和E3区域的腺病毒5型(Ad5 d1X株)的DNA-末端蛋白质复合体(DNA-TPC)。将该复合体用例如限制酶EcoT22I消化，然后通过凝胶过滤等脱盐纯化。将上述重组粘粒与EcoT22I消化片段混合，用Cellphect试剂盒(Pharmacia，瑞典)等导入293细胞。次日，将转染的293细胞悬浮，将所得混悬液及其10倍～100倍的稀释液(用293细胞混悬液稀释)接种到96孔平皿上。约两周后，从观察到重组腺病毒(由293细胞中的重组产生)增殖的孔中取出包含死亡细胞的培养液。将其冻融数次，以便从细胞中释放腺病毒粒子。离心后将上清液(初级病毒液)感染已接种在24孔平皿上的293细胞。3天后取出包含死亡细胞的培养液，一部分按照制备初级病毒液的方法冻融并离心得到上清液(二级病毒液)。将剩余的培养液离心，得到细胞。由这些细胞制备DNA，通过限制酶消化分析重组腺病毒DNA的结构，选择确认具有目的结构的克隆。用所述二级病毒液感染更多量的293细胞，同法将其培养液冻融并离心，得到3级病毒液。通过Saito等的方法(Kanegae等，“Biomanual Series 4-Gene Transfer and Expression，Methods ofAnalysis”(in Japanese)，43-58(1994)，Yodosha)测定其滴度后，可以用作载体(Miyake等，supra；Kanegae等，Acta Paediatr.Jpn，38：182-188(1996))。
另外，也可以用例如逆转录病毒载体(Wakimoto等，Protein NucleicAcid and Enzyme 40：2508-2513(1995))和腺伴随病毒载体(Tamaki等，Protein Nucleic Acid and Enzyme 40：2532-2538(1995))等。高效地生产这些载体的方法在本领域是公知的。
可以用于将基因导入哺乳动物的其它载体的制备方法如下：特表平6-502069、特公平6-95937和特公平6-71429公开了重组痘苗病毒的制备方法，特公平6-34727和特表平6-505626公开了重组乳头瘤病毒的制备方法，特开平5-308975公开了重组腺伴随病毒的制备方法，特表平6-508039公开了重组腺病毒的制备方法。
通过将所得的病毒载体导入哺乳动物细胞，可以表达表位结合型β2m，并可以从这些细胞或其培养上清得到所需表位结合型β2m。回收的表位结合型β2m可以用于诱导抗原特异性细胞免疫。例如，将表位结合型β2m添加到抗原呈递细胞，由此可以呈递该表位。另外，如果将表达表位结合型β2m的病毒载体导入抗原呈递细胞，则可以高效地呈递所需的表位。表位可以结合到β2m的所需部位，但优选结合到例如分泌型β2m分子的N末端。为此，可以将表位连接到β2m的分泌信号序列的下游，需要时可以借助间隔序列，来制备与β2m蛋白连接的融合蛋白。对所用的β2m没有特殊限制，可以使用所需哺乳动物的β2m。用于人时优选人β2m。人β2m基因可以根据后述实施例中记载的方法分离。
另外，如果将编码表位结合型β2m和分泌型(也称为可溶型)I类MHC重链的基因导入同一哺乳动物细胞，则可以将I类MHC/肽复合体分泌到培养上清中并可以容易地回收。分泌型I类MHC重链也可以通过病毒载体导入哺乳动物细胞，也可以将其基因整合到细胞染色体DNA后使其表达。当在分泌型I类MHC重链添加生物素化基质肽时，可以用抗生物素蛋白将生物素化的I类MHC/肽复合体四聚体化。该四聚体特别是可以用于CTL的检测和定量。
导入编码表位结合型β2m和膜结合型I类MHC重链的基因，可以在细胞表面表达大量I类MHC/肽复合体。这种细胞对表位特异性CTL具有优良的抗原呈递能力。
用病毒载体表达I类MHC重链时，所用载体与表达上述表位结合型β2m的病毒载体一样，没有特殊限制，可以使用所需的病毒载体。另外，也可以在表达表位结合型β2m的病毒载体中插入编码I类MHC重链的基因，以便从同一载体共表达表位结合型β2m和I类MHC重链。本发明的载体也包括表达表位结合型β2m和其它外源基因的共表达载体。对I类MHC重链没有特殊限制，但用于人时优选人I类MHC分子(HLA)。在实施例中，本发明人用A24限制性I类HLA重链作为I类MHC分子，用被A24限制性I类HLA分子呈递的来自HIV-1的表位作为表位。人I类MHC分子称为人白血球抗原(HLA)，种类非常丰富。其中约70％的日本人具有所谓HLA-A*2402基因型。本发明中，用于日本人时，优选A24限制性I类HLA重链，特别是HLA-A*2402作为I类MHC重链。通过选择与患者MHC型匹配的融合到β2m的表位和/或I类MHC分子，有望获得定做的医疗。
本发明人还发现，用感染哺乳动物细胞的病毒载体可以极高效地在细胞中制备所需的分泌型多聚体蛋白质复合体。特别是用本发明的感染哺乳动物细胞的病毒载体可以极高效地制备分泌型同二聚体或异二聚体以及同三聚体或异三聚体。例如，即使是外源性地存在于细胞膜上的异型蛋白(heteromer protein)，也可以按照实施例中所述方法，通过用所述病毒载体表达缺失跨膜区域的蛋白质，而将其分泌到细胞外。按照本发明制备二聚体或三聚体等分泌型多聚体时，作为多聚体组分的蛋白质可以用感染哺乳动物细胞的病毒载体表达。可以将这些组分蛋白质全部用感染哺乳动物细胞的病毒载体表达，当细胞中数个组分的内源性表达水平足够高等情况下，可以仅将一部分组分蛋白例如内源表达量少的组分等用感染哺乳动物细胞的病毒载体表达。作为用上述方法制备的分泌型多聚体，最优选的多聚体之一是II类MHC复合体。该复合体是由α和β两条重链组成的异二聚体，可以与上述表位结合型β2m或表位结合I类MHC重链中的方法同法将α链或β链之一与表位融合，与上述表位结合型β2m或表位结合I类MHC重链中的方法同法制备复合体。用本发明方法制备的分泌型多聚体也优选T细胞受体等。另外还可以列举异二聚体或同二聚体或者异三聚体或同三聚体形态的细胞因子或趋化因子等。具体地，可以列举IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-3、IL-5和GM-CSF等的异二聚体或异三聚体以及NK受体的同二聚体等，但不限于这些。即，本发明也提供下述发明：
(1)以可表达的方式编码分泌性多聚体组分的感染哺乳动物细胞的病毒载体；
(2)(1)所述的病毒载体，其中所述感染哺乳动物细胞的病毒载体为副粘病毒载体；
(3)(2)所述的病毒载体，其中所述副粘病毒为仙台病毒；
(4)(1)～(3)之一的病毒载体，其中所述分泌性多聚体为分泌性同二聚体或异二聚体、或者分泌性同三聚体或异三聚体；
(5)(4)所述的病毒载体，其中所述分泌性多聚体选自II类MHC复合体、T细胞受体、NK受体、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-3、IL-5和GM-CSF；
(6)(5)所述的病毒载体，其中所述分泌性多聚体为与表位相边的II类MHC复合体；
(7)分泌性多聚体的生产方法，包括以下步骤：
(a)将(1)～(6)之一的病毒载体导入哺乳动物细胞，和
(b)从导入了所述载体的哺乳动物细胞或其培养上清回收分泌性多聚体；
(8)用(7)所述的方法生产的分泌性多聚体；和
(9)导入了(1)～(6)之一的病毒载体的哺乳动物细胞。
本发明中特别优选的感染哺乳动物细胞的病毒载体包括副粘病毒载体。“副粘病毒载体”是指来自副粘病毒的将基因导入宿主细胞的载体。最近正在开发属于副粘病毒科的仙台病毒(SeV)作为基因导入载体(Kato，A.等，EMBO J.16：578-589(1997)；WO 97/16538；WO 97/16539)。SeV载体毒性低，从导入基因表达的蛋白质量极高。另外，插入载体内的基因不会导入宿主染色体中，因此安全性很好。SeV载体基因组的稳定性高，异种基因表达的结果中发现，即使将病毒连续多代传代，也几乎没有发现碱基的变异，并能长期稳定地表达插入的异种基因(Yu，D.等，Genes Cells 2，457-466(1997))。另外，由于没有衣壳结构蛋白，因此在导入基因的大小或装配的柔软性等方面具有优势。具有复制能力的SeV载体可以导入至少4kbp的外源DNA。通过添加转录单位可以同时表达两种或两种以上的基因。以SeV复制子为基础的载体复制出病毒载体，它们再感染周围的细胞，在感染细胞的细胞质中复制出的多拷贝RNP随着细胞的分裂分配到子代细胞中，因此该载体有望持续表达。另外，SeV载体具有非常广的组织适用范围。
另外，在安全性方面，由于副粘病毒载体没有人体致病性，这意味着其适用于人体基因治疗的临床试验。首先，质粒DNA等介导的外源基因的表达中，大多数情况下，导入的DNA必须转运到核内或其核膜必须消失，这成了提高基因表达成功率的主要障碍。但在仙台病毒等情况中，外源基因的表达由细胞质中的细胞微管蛋白及其本身所具有的RNA聚合酶(L蛋白)随着病毒基因组的复制而驱动。这表明仙台病毒不与宿主染色体相互作用，一般认为不会出现由染色体异常引起细胞癌化或不死化等安全性方面的问题。其次，已知仙台病毒对啮齿动物具有致病性，能引发肺炎，但它对人体没有致病性。证据之一是，将野生型仙台病毒鼻内给予非人灵长类不造成严重伤害(Hurwitz J.L.等，Vaccine，1997，15，533-540)。这些特征提示仙台病毒载体可以应用于人类治疗中，它还有望成为以表位结合型β2m体内或回体表达为目的的基因治疗的一种选择。
本发明的副粘病毒载体可以是核糖核蛋白(RNP)或具有感染力的病毒颗粒。术语“感染力”是指重组副粘病毒载体通过保持其细胞粘附和膜融合能力，将载体内部的基因导入该载体所粘附的细胞的能力。本发明的副粘病毒载体可以具有复制能力，也可以是不具有复制能力的缺陷载体。本文中，“复制能力”是指病毒在感染了该病毒载体的宿主细胞中复制并产生感染性病毒颗粒的能力。宿主细胞包括LLC-MK2或CV-1等。以下以副粘病毒载体为例详细说明本发明，但本发明不限于以副粘病毒载体作为病毒载体，可以以下的记载为基础同法制备其它病毒载体。
本发明中，“副粘病毒”是指属于副粘病毒科的病毒或其衍生物。适用于本发明的副粘病毒包括：副粘病毒科(Paramyxoviridae)的仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、牛瘟病毒、温热病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)和人副流感病毒的I、II和III型等。本发明的病毒优选副粘病毒属(包括呼吸道病毒属、风疹病毒属和麻疹病毒属)的病毒或其衍生物。更优选属于呼吸道病毒属(也称为副粘病毒属)的病毒或其衍生物。适用于本发明的呼吸道病毒属病毒包括例如人副流感病毒I型(HPIV-1)、人副流感病毒III型(HPIV-3)、牛副流感病毒III型(BPIV-3)、仙台病毒(也称作小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒X型(SPIV-10)等，本发明的副粘病毒最优选仙台病毒。这些病毒可以是天然株、野生株、突变株、实验室传代株和人工构建株等。DI颗粒(J.Virol.，1994，68，8413-8417)等不完整病毒、合成的寡核苷酸等也可以作为制备本发明病毒载体的材料。
编码副粘病毒蛋白的基因包括NP、P、M、F、HN和L基因。“NP、P、M、F、HN和L基因”分别指编码核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸酶蛋白和大分子蛋白的基因。副粘病毒亚科中每种病毒的基因通常表示如下，NP基因通常也描述为“N基因”。
呼吸道病毒属(Respirovirus)NP P/C/V M F HN - L
风疹病毒属(Rublavirus) NP P/V M F HN (SH) L
麻疹病毒属(Morbillivirus) NP P/C/V M F H - L
例如，核苷酸序列数据库中，归类为副粘病毒科呼吸道病毒属的仙台病毒，其NP基因的录入号是M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218，P基因的是M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007和X17008，M基因的是D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584和X53056，F基因的是D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152和X02131；HN基因的是D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808和X56131，L基因的是D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587和X58886。本发明中，术语“基因”是指遗传物质，包括RNA和DNA等核酸。对基因的来源没有特别限制，可以是天然序列或人工设计的序列。此外，本发明中，术语“DNA”包括单链DNA和双链DNA。
对本发明所用的副粘病毒载体没有特殊限制，例如，合适的副粘病毒载体包括能复制和自我繁殖的载体。通常，天然型副粘病毒的基因组包含短的3′前导区，后随6个基因，分别编码N(核衣壳)、P(磷)、M(基质)、F(融合)、HN(血凝素-神经氨酸酶)和L(大)蛋白，另一端有一段短的5′尾部区域。本发明能自我复制的载体可通过设计具有与上述相同结构的基因组而获得。另外，表达外源基因的载体可通过将外源基因插入上述载体的基因组而获得。通过在基因组内插入表位结合型β2m和/或I类MHC重链的基因，可以制备表达这些蛋白质的载体。本发明副粘病毒载体中，载体上的病毒基因的排列可以不同于野生型病毒。
本发明所用的副粘病毒载体可以缺失野生型副粘病毒中含有的某些基因。例如，重建仙台病毒载体时，一般认为由NP、P/C和L基因编码的蛋白本身是必需的，但本发明的病毒载体不一定必须包含编码上述蛋白的基因作为其组成。例如，携带编码上述蛋白的基因的表达载体可以与编码该载体基因组的表达载体共转染至宿主细胞中，由此重建病毒载体。或者，将编码载体基因组的表达载体导入携带有编码上述蛋白的基因的宿主细胞中，由该宿主细胞提供给上述蛋白，由此重建病毒载体。这些蛋白的氨基酸序列可以与来自起始病毒的序列不同，只要它们在核酸导入过程中具有与天然株相比等效或更强的活性，它们可以突变或者被另一种病毒的同源基因取代。
一般认为，由M、F和HN基因编码的蛋白是副粘病毒载体的细胞-细胞繁殖所必需的。但是，当副粘病毒载体为RNP形式时，不需要这些蛋白。如果RNP中的基因组包含M、F和HN基因，当其导入宿主细胞时，产生这些基因的产物，并产生具有感染性的病毒颗粒。产生感染性病毒的RNP载体可以列举含有编码N、P、M、F、HN和L基因的病毒基因组RNA和N蛋白、P蛋白和L蛋白的RNP。将上述RNP导入细胞后，在N蛋白、P蛋白和L蛋白的作用下，病毒基因组被表达、复制，感染性病毒载体扩增。如此，可以通过将副粘病毒载体重建过程等形成的RNP导入LLC-MK2细胞等宿主细胞中并进行培养，由此可以扩增副粘病毒载体。该过程包括(a)将来自副粘病毒的负链单链RNA和由NP、P/C以及L蛋白质构成的复合体导入细胞中的步骤，和(b)培养该细胞，从其培养上清中回收病毒粒子的步骤。
可将RNP与转染试剂如脂转染胺(lipofectamine)和聚阳离子脂质体一起形成复合体再导入细胞中。具体地，可使用各种转染试剂，例如，DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer #1811169)等。可加入氯喹以防止在核内体中的降解(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。如果是复制型病毒，所产生的病毒可以通过再感染培养细胞、鸡卵或动物(例如小鼠等哺乳动物)等而扩增或传代。
缺乏M、F和/或HN基因的副粘病毒载体也可以作为本发明的副粘病毒载体。这些载体可以通过例如外源提供缺失的基因产物而重建。这样制备的病毒载体仍然可以像野生型病毒一样粘附于宿主细胞并诱导细胞融合，但子代病毒颗粒不具有与起始病毒相同的感染力，因为导入细胞的载体基因组缺乏上述基因中的一种。因此，这些载体可用作仅能进行一次基因导入的安全病毒载体。基因组缺失的基因包括F基因和/或HN基因等。例如制备F基因缺失型载体时，可以将表达F基因缺失型重组副粘病毒载体基因组的质粒与F蛋白的表达载体以及NP、P/C和L蛋白的表达载体一起共转染至宿主细胞，由此重建病毒载体(WO00/70055和WO00/70070)。另外，例如也可以用将F基因整合到染色体的宿主细胞来制备。外源提供这些蛋白质时，其氨基酸序列可以与来自起始病毒的序列不同，只要它们在核酸导入过程中具有与天然型相比等效或更强的活性，它们可以突变或者被另一种病毒的同源基因取代。
另外，作为本发明的病毒载体，可以制备下述载体：其在包膜蛋白中，包含与载体基因组编码的病毒包膜蛋白不同的蛋白。例如，在重建病毒时，通过使作为载体基础的病毒基因组编码的包膜蛋白以外的包膜蛋白在细胞中表达，由此可以构建具有所需包膜蛋白的病毒载体。对这种蛋白没有限制，可以包括其它病毒的包膜蛋白，如水疱性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。本发明的副粘病毒载体包括VSV-G等假型病毒载体，所述假型病毒载体带有源自基因组编码病毒以外的病毒的包膜蛋白。
本发明的副粘病毒载体在病毒包膜表面还包含下述蛋白，例如：能粘附于特定细胞的粘附因子、配体和受体等蛋白，或者嵌合蛋白(其在病毒外表面包含上述蛋白质，在病毒的内侧包含病毒包膜衍生的多肽)，这样就能产生靶向特定组织的载体。这些蛋白质可以由病毒基因组自身编码，也可以在重建病毒载体时由病毒基因组以外的基因(例如其它表达载体或宿主细胞染色体的基因)表达来提供。
可以改变本发明病毒载体中所含的病毒基因，例如，为了降低来自载体的病毒蛋白导致的抗原性或提高RNA转录效率或复制效率。具体地，例如在副粘病毒载体中，可以改变复制因子NP、P/C和L基因中的至少一种，以增强转录或复制功能。结构蛋白之一的HN蛋白具有血凝素活性和神经氨酸酶活性，如果能减弱前一种的活性，则可能提高病毒在血液中的稳定性；改变后一种活性则可能调节感染力。通过改变F蛋白(它参与膜融合)可以调节膜融合脂质体的融合能力。例如，对可能成为细胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的抗原呈递表位进行分析，由此可以制备抗原呈递能力减弱的副粘病毒。
本发明的副粘病毒载体还可以缺失辅助基因。例如：剔除SeV的辅助基因之一V基因后，培养细胞中的基因表达或复制不受影响，但SeV对小鼠等宿主的致病性显著降低(Kato，A.等，1997.J.Virol.71：7266-7272；Kato，A.等，1997.EMBO J.16：578-587；Curran，J.等，WO0I/04272，EP1067179)。这样的减毒载体特别适合用作体内或回体基因导入用的病毒载体。
包含表位结合型β2m或I类MHC重链等外源基因的重组副粘病毒载体可以通过将这些基因插入上述副粘病毒载体基因组而获得。作为β2m和I类MHC重链，可以使用编码天然蛋白质的基因，也可以使用通过缺失、取代或插入等将天然型蛋白质进行修饰所得的蛋白质，只要该蛋白质具有与天然蛋白质同等的功能，即具有形成I类MHC/肽复合体的活性，或该复合体被细胞毒性T细胞识别，或该复合体活化CTL等的功能。当将外源基因导入病毒载体DNA中时，例如在仙台病毒载体DNA中，希望将具有6的倍数个碱基的序列插入转录终止序列(E)和转录起始序列(S)之间(J.Virol.，67(8)：4822-4830(1993))。外源基因可以插到病毒各基因(NP、P、M、F、HN和L基因)的上游和/或下游。为了不妨碍上下游基因的表达，在外源基因的上游或下游适当插入E-I-S序列(转录终止序列-间插序列-转录起始序列)或其一部分，使得E-I-S序列位于各基因之间，或者，可借助IRES插入外源基因。
所插入的外源基因的表达水平可通过连接在所述基因上游的转录起始序列的类型来调节(WO01/18223)，也可通过插入点的位置和所述基因前后的碱基序列来调节。例如，在仙台病毒中，插入点越靠近病毒基因组负链RNA的3′-末端(野生型病毒基因组的基因排列中越靠近NP基因)，插入基因的表达水平越高。为了获得外源基因的高水平表达，优选将其插入负链基因组的上游区(负链上的3′侧翼序列)，如NP基因的上游(负链上的3′侧翼序列)，或NP与P基因之间。相反，插入点越靠近负链RNA的5′-末端(野生型病毒基因组的基因排列中越靠近L基因)，插入基因的表达水平越低。为了降低外源基因的表达水平，可将其插入负链上的5′最末端位置，即野生型病毒基因组的L基因下游(负链上L基因的5′侧翼区)或L基因的上游(负链上L基因的3′侧翼区)。这样，可以适当调整外源基因的插入位置，以便获得所需的基因表达水平，或者使插入子与其周边编码病毒蛋白的基因的组合最佳化。例如，给与高滴度病毒载体导致导入基因的高水平表达表现出毒性时，除了可以控制所给病毒的滴度外，还可以将载体中插入基因的插入点设置在载体负链的5′-末端，或将转录起始序列替换成低效率的序列等，由此可以降低各病毒载体的表达水平，从而获得合适的表达量和疗效。
一般认为，只要不表现细胞毒性，如果能获得表位结合型β2md的高水平表达，则对高效生产蛋白质和免疫诱导有利。因此，优选将编码表位结合型β2m的基因连接到高效的转录起始序列，并插入到负链基因组的3’-末端附近。优选的载体例子包括在副粘病毒载体的负链基因组中，编码表位结合型β2m的基因配置在所有副粘病毒蛋白的3’侧翼的载体。例如优选N基因上游(负链中N基因编码序列的3’侧翼)插入外源基因的载体，或者也可以插入紧邻N基因的下游。
为了使外源基因易于插入，可以在编码基因组的载体DNA中的插入位置设计克隆位点。例如，克隆位点可以是限制酶的识别序列。所述克隆位点可以是包含多个限制酶识的别序列的多克隆位点。另外，本发明的载体还可以在插入上述表位结合型β2m基因位置以外的其它位置具有其它外源基因。对这些外源基因无限制，例如可以是趋化因子或细胞因子基因，也可以是MHI class I重链基因或其它基因。
可以按照例如Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.，1997，78：2813-2820，KatoA.等，EMBO J.，1997，16：578-587和Yu D.等，Genes Cells，1997，2：457-466中记载方法，如下构建带有外源基因的重组仙台病毒载体。
首先，制备包含所需外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA样品。优选此DNA样品在25ng/μl或更高的浓度可以通过电泳确认为单个质粒。下面是将外源基因插入病毒基因组DNA的NotI位点的一个实施例。如果目的cDNA核苷酸序列中包含NotI识别位点，优选事先用定点诱变法等改变核苷酸序列以除去该位点，但不改变所编码的氨基酸序列。从所述DNA样品通过PCR扩增回收所需的DNA片段。为了获得两个末端都带有NotI位点的扩增片段，并在其中一个末端添加仙台病毒转录终止序列(E)、间插序列(I)和转录起始序列(S)(EIS序列)的拷贝，制备了作为引物对的正向DNA序列(正义链)和反向DNA序列(反义链)，该引物对包含NotI限制酶识别序列、转录终止序列(E)、间插序列(I)、转录起始序列(S)和目的基因的部分序列。
例如，正向合成性DNA序列在5′-末端包含任意两个或多个核苷酸(优选4个核苷酸，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列，更优选ACTT)，以确保用NotI消化。在该序列的3′-末端添加NotI识别序列GCGGCCGC。另外，在3′-末端还添加任意9个核苷酸或9加6的倍数个核苷酸作为间隔序列。进一步地，还在3′-末端添加ORF的约25个核苷酸的序列，它从所需cDNA的起始密码子ATG开始并包括ATG。优选地，从所需cDNA选取约25个核苷酸作为正向合成性寡DNA的3′-末端，使最后一个核苷酸为G或C。
反向合成性DNA序列在5′-末端包含任意两个或多个核苷酸(优选4个核苷酸，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列，更优选ACTT)。在该序列的3′-末端添加NotI识别序列GCGGCCGC。另外，在3′-末端还添加插入片段寡DNA以调节引物的长度。寡DNA的长度按下述方法设计：包括NotI识别序列GCGGCCGC、cDNA的互补序列和后述源自仙台病毒基因组的EIS序列，核苷酸总数为6的倍数(所谓“6的法则”；KolakofskiD.等，J.Virol.，1998，72，891-899；Calain P.和Roux L.，J.Virol.，1993，67，4822-4830)。此外，在插入片段的3′-末端，进一步添加仙台病毒S序列的互补序列(优选5′-CTTTCACCCT-3′；SEQ ID NO：1)、I序列的互补序列(优选5′-AAG-3′)、E序列的互补序列(优选5′-TTTTTCTTACTACGG-3′；SEQ IDNO：2)。进一步地，在该3′-末端添加所需cDNA的互补序列，使最后一个核苷酸为G或C，此最后一个核苷酸位于该cDNA终止密码子上游约25个核苷酸处，以此作为反向合成性寡DNA的3′-末端。
可以利用ExTaq聚合酶(TaKaRa)通过常规方法进行PCR。优选使用Vent聚合酶(NEB)，扩增了的目的片段用NotI消化，然后插入质粒载体pBluescript的NotI位点。用自动DNA测序仪检测所得PCR产物的核苷酸序列，选出具有正确序列的质粒。通过NotI消化而将插入片段从该质粒上切下来，克隆至包含副粘病毒基因组cDNA的质粒的NotI位点。或者，不通过质粒载体pBluescript而将PCR产物直接插入NotI位点，也可以获得重组仙台病毒cDNA。
例如，可以根据文献记载的方法构建重组仙台病毒基因组cDNA(Yu，D.等，Genes Cells，1997，2，457-466，1997；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.，78：2813-2820，1997)。例如，首先将带有NotI识别位点的18bp间隔序列(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′；SEQ ID NO：3)插到克隆化仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))中前导序列与编码N-蛋白质的序列的5′-末端之间的相邻基因座上，得到带有源自δ肝炎病毒反基因组链的自我裂解性核酶位点的质粒pSeV18+b(+)(Hasan M.K.等，J.General Virol.，1997，78，2813-2820)。将外源基因片段插入pSeV18+b(+)的NotI位点，能获得插入了所需外源基因的重组仙台病毒cDNA。
往该载体中插入编码表位结合型β2m的DNA。对本发明所用的表位没有限制，可以使用对肿瘤、感染疾病和其它普通疾病具有疗效的所需表位等。一般优选使用约10个氨基酸的肽作为表位，但可以适当改变肽的长度。表位结合型β2m可以是例如以下蛋白质，其中在β2m的分泌序列之后连接表位，以及将β2m通过合适长度的间插序列与表位相连。或者，所述表位也可以不通过间隔而直接与β2m相连。对间隔的氨基酸序列没有特殊限制，但优选使用例如包含由Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO：13)组成的氨基酸序列或其重复序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n的肽。对重复次数(n)没有限制，可以是1～5(1、2、3、4或5)。使用间隔时，其长度优选至多为16个氨基酸，可以列举4、8或16个氨基酸等。
在按上述方法制备的重组副粘病毒载体DNA上连接合适的转录启动子，将所得的DNA在试管或细胞中转录，在副粘病毒的L、P和NP蛋白的存在下重建RNP，这样就能生成含有该RNP的病毒载体。本发明提供副粘病毒载体的制备方法，其包括转录编码本发明副粘病毒载体基因组的DNA的步骤。本发明还提供含有上述DNA的用于制备本发明副粘病毒载体的DNA。另外，本发明还涉及用于制备本发明副粘病毒载体的编码该载体基因组的DNA的用途。可以按照公知的方法由病毒载体DNA重建病毒(WO97/16539；WO97/16538；Durbin A.P.等，Virol.，1997，235，323-332；Whelan S.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，8388-8392；Schnell M.J.等，EMBO J.，1994，13，4195-4203；Radecke F.等，EMBO J.，1995，14，5773-5784；Lawson N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，4477-4481；Garcin D.等，EMBO J.，1995，14，6087-6094；Kato A.等，Genes Cells，1996，1，569-579；Baron M.D.和Barrett T.，J.Virology，1997，71，1265-1271；Bridgen A.和Elliott R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，15400-15404)。用这些方法能从DNA重建所需的包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙台病毒等的副粘病毒载体以及其它其它(-)链RNA病毒载体。病毒载体DNA中缺失F、HN和/或M基因时，无法形成感染性病毒颗粒，但有可能将这些缺失基因和/或编码其它病毒包膜蛋白的基因从另一种病毒导入宿主细胞中并进行表达，从而能产生感染性病毒颗粒。
副粘病毒载体通常可以如下制备：(a)在表达NP、P和L蛋白质的细胞(辅助细胞)中转录编码来自副粘病毒的负链单链RNA或其互补链(正链)的载体DNA，(b)培养这些细胞并从其培养上清中回收病毒粒子。从载体DNA转录的RNA与NP、P和L蛋白质形成RNP复合体，进一步形成包裹在含有包膜蛋白的外壳中的病毒粒子。
在辅助细胞中表达的编码病毒基因组的DNA(载体DNA)可以编码基因组的负链(负链RNA)或其互补链(正链RNA)。例如，将编码负单链RNA或其互补链的DNA连接到T7启动子的下游，然后通过T7 RNA聚合酶转录到RNA。作为启动子，可以用任何所需的启动子代替包含T7聚合酶识别序列的启动子。或者，也可以将体外转录的RNA转染至辅助细胞。病毒基因组的正链和负链都可以在细胞内转录，但优选使正链转录，以提高重建效率。
将载体DNA导入细胞的方法包括：(1)制备能掺入所需细胞的DNA沉淀，(2)制备包含带正电的DNA的复合体，它适于掺入所需细胞并且具有较低细胞毒性，和(3)利用电脉冲在所需细胞膜上打开一个瞬时性小孔，其大小仅足以让DNA通过。
方法(2)中可以使用各种转染试剂，例如DOTMA(Boehringer)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE和DOSPER(Boehringer#1811169)等。方法(1)中，可以用磷酸钙进行转染。在这种方法中，DNA以吞噬泡的形式被细胞摄入，但已知足量的DNA也能被摄入细胞核中(Graham F.L.和Van DerEb J.，Virology.，1973，52，456；Wigler M.和Silverstein S.，Cell，1977，11，223)。Chen和Okayama研究了导入技术的最佳条件，他们报道说：(1)细胞和共沉淀物的温育条件为：2～4％ CO2，35℃，15～24hr，(2)环状DNA比线性DNA活性更高，和(3)当沉淀混合溶液中DNA浓度为20～30μg/ml时，可形成最佳沉淀(Chen C.和Okayama H.，Mol.Cell.Biol.，1987，7，2745)。方法(2)适于瞬时转染。已知更早的方法是配制具有所需DNA浓度比的DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885 M.W.5×105)混合液进行转染。由于大多数复合体在内体中降解，可以加入氯喹来提高转染效力(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。方法(3)被称为电穿孔方法，由于没有细胞选择性，它比方法(1)和(2)应用更广。可通过最优化脉冲电流的持续时间、脉冲形式、电场强度(电极间空隙，电压)、缓冲液的导电性、DNA浓度和细胞密度使转染效力最大化。
在上述三种方法中，使用转染试剂进行的方法(2)操作简单，并且能用大量的细胞检测大量样品，因此转染试剂适用于在重建载体时将DNA导入细胞中，转染试剂优选但不限于Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，#301305)和DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Boehringer Mannheim#1811169)。
具体地，可以按下述方法从cDNA进行重建：
在24～6孔左右的塑料板或100mm Petri培养皿中，用极限必需培养基(MEM)将猴肾细胞LLC-MK2培养至70-80％铺满，所述培养基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)。将表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3在1μg/ml补骨脂素的存在下于UV中暴露20分钟灭活，然后以2PFU/细胞的量感染细胞(Fuerst T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，8122-8126；和Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)，可以适当调整补骨脂素的加入量和暴露于UV的时间长短。感染1小时后，将2-60μg(更优选3-5μg)上述重组仙台病毒cDNA和表达病毒蛋白的质粒(24-0.5μg pGEM-N、12-0.25μg pGEM-P和24-0.5μg pGEM-L，或更优选1μg pGEM-N、0.5μg pGEM-P和1μg pGEM-L)(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)通过采用Superfect(QIAGEN公司)的脂转染方法等进行转染，所述表达病毒蛋白的质粒能用于产生全长仙台病毒基因组并且是必需的。在MEM中培养转染细胞，所述MEM不含血清，根据需要，可以仅含有100μg/ml利福平(Sigma)和优选浓度为40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，以便将药物浓度调整至最佳，从而使痘苗病毒的细胞毒性最小而病毒的回收率最高(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)。转染后将细胞培养48-72hr，然后收集并通过三次冻融而裂解。用细胞裂解物转染LLC-MK2细胞并培养。或者回收培养上清，将其添加到LLC-MK2细胞的培养液中，使其感染细胞并进行培养。培养3～7天后回收培养液。或者将上述冻融细胞裂解物接种到10天龄的受孕鸡卵的尿囊内，约3天后回收尿囊液。为了重建缺乏编码包膜蛋白的基因并且不能复制的病毒载体，可以用表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞进行转染，或与包膜蛋白的表达质粒一起转染。另一种方法是，将转染过的细胞覆盖在表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞的上层并进行培养，使缺陷型病毒载体繁殖(参照WO00/70055和WO00/70070)。培养上清或尿囊液中所含病毒的滴度可通过测定血凝素活性(HA)来确定。HA可通过“内点稀释法”来测定(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579；Yonemitsu Y.和Kaneda Y.，Hemagglutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.，Molecular Biology ofVascular Diseases.Methods in Molecular Medicine，Baker A.H.，Humana Press编辑，1999，295-306)。为了除去可能混入的T7聚合酶表达痘苗病毒，可以适当稀释(例如106倍)所得的尿囊液样品，在鸡卵中进行重扩增，重扩增可以重复3次或更多次。所得病毒可以在-80℃保存。
对用于重建的宿主细胞类型无特殊限制，只要所述病毒载体能在这些细胞中重建。例如，在仙台病毒载体等的重建中，可以使用LLC-MK2细胞、CV-1细胞和来自仓鼠肾的BHK细胞等的培养细胞和来自人的细胞等。通过在这些细胞中表达适当的包膜蛋白，可以获得包膜中包含该蛋白的感染性病毒粒子。此外，为了获得大量仙台病毒载体，可以用从上述宿主细胞获得的病毒载体感染受孕鸡卵，从而扩增该载体。已经开发了用鸡卵制备病毒载体的方法(Advanced protocols in neuroscience study III，Molecularphysiology in neuroscience.，Nakanishi等编辑，Kouseisha，Osaka，1993，153-172)。具体地，例如，将受精卵在孵化器中37-38℃培养9-12天以形成胚。将病毒载体接种到尿囊腔，进一步将该受精卵培养数日使病毒载体繁殖。可根据所用的重组仙台病毒类型的不同而改变培养时间等条件。然后，回收含有病毒的尿囊液。可以用常规方法从尿囊液样品中分离和纯化仙台病毒载体(Tashiro M.，Protocols in virus experiments.，Nagai和Ishihama编辑，MEDICAL VIEW，1995，68-73)。
例如，可以如下构建和制备F蛋白缺失型仙台病毒载体(参照WO00/70055和WO00/70070)。
<1>构建F缺失型仙台病毒基因组cDNA和F表达质粒
用SphI/KpnI消化SeV的全长基因组cDNA，pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78，2813-2820，1997)(“pSeV18+b(+)”也叫“pSeV18+”)，回收消化片段(14673bp)。将消化片段克隆到pUC18，得质粒pUC18/KS，在此pUC18/KS上，联合应用PCR-连接反应来构建F基因缺失部位，除去F基因ORF(ATG-TGA＝1698bp)，用atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO：4)填满空隙，由此构建了F基因缺失型SeV基因组cDNA(pSeV18+/ΔF)。PCR中，采用如下引物对：F基因上游：正向：5′-gttgagtactgcaagagc (SEQ ID NO：5)，反向：5′-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc(SEQ ID NO：6)；F基因下游：正向：5′-atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO：7)，反向：5′-tgggtgaatgagagaatcagc(SEQ ID NO：8)。将所得的PCR产物用EcoT22I连接。用SacI和SalI消化按上述方法获得的质粒，回收含有F基因缺失部位的片段(4931bp)并将其克隆到pUC18，得pUC18/dFSS。用DraIII消化所得的pUC18/dFSS，回收片段，用pSeV18+中包含F基因区域的DraIII片段置换，连接后得到质粒pSeV18+/ΔF。
将外源基因插入例如pUC18/dFSS中F基因缺失部位的NsiI和NgoMIV限制酶位点。为此，例如，可以用末端为NsiI的引物和末端为NgoMIV的引物扩增外源基因片段。
<2>制备诱导表达SeV-F蛋白质的辅助细胞
为了构建表达SeV-F基因的Cre/loxP诱导型表达质粒，通过PCR扩增SeV-F基因，将扩增产物插入为了能通过Cre DNA重组酶诱导基因产物表达而设计的质粒pCALNdLw(Arai，T.等，J.Virol.72：1115-1121(1998))的单一SwaI位点，由此构建质粒pCALNdLw/F。
为了从F基因缺失型基因组回收感染性病毒颗粒，建立表达SeV-F蛋白的辅助细胞株。可以使用例如SeV增殖中常用的猴肾细胞株LLC-MK2细胞。在37℃和5％ CO2中用含有下列成分的MEM培养LLC-MK2细胞：10％的热处理灭活胎牛血清(FBS)、50U/ml的青霉素G钠和50μg/ml的链霉素。由于SeV-F基因产物具有细胞毒性，用磷酸钙法(MammalianTransfection Kit；Stratagene，La Jolla，CA)将为了能通过Cre DNA重组酶诱导F基因产物表达而设计的上述质粒pCALNdLw/F按公知的方案导入LLC-MK2细胞。
将10μg质粒pCALNdLw/F导入在10cm培养皿中培养至40％铺满的LLC-MK2细胞中，然后用10ml含10％FBS的MEM培养基在37℃、5％CO2的恒温箱中培养24小时。24小时后将细胞剥下，悬浮于10ml培养基后，播种到五个10ml的培养皿中，5ml的一皿、2ml的两皿、0.2ml的两皿，用10ml含G418(Gibco-BRL)1,200μg/m和10％ FBS的MEM培养基培养14天，每两天更换一次培养基，选出稳定的基因导入株。用克隆环回收在上述培养基中繁殖的G418抗性细胞。回收的各克隆均在10cm的培养皿中扩增到铺满。
在6cm培养皿中将细胞扩增到铺满，按照齐藤等的方法(Saito等，Nucl.Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72(2)，1115-1121，1998)以例如moi＝3的感染复数感染腺病毒AxCANCre，由此诱导F蛋白质的表达。
<3>F基因缺失型SeV病毒的重建和扩增
将携带上述pSeV18+/ΔF外源基因的质粒用如下方法转染至LLC-MK2细胞中。将LLC-MK2细胞以5×106个细胞/皿的浓度播种到直径为10cm的Petri皿中，培养24小时后，用经Solaren和长波长紫外线(365nm)处理20分钟的表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)室温转染1小时(moi＝2)(moi＝2～3，优选moi＝2)。用例如装有5只15瓦灯泡的UV Stratalinker 2400(商品目录号400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，美国)进行痘苗病毒的紫外线照射。将细胞洗涤3次后，将质粒pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.，等，Genes Cells 1，569-579，1996)分别以12μg，4μg，2μg和4μg/皿的量悬浮于OptiMEM(GIBCO)，加入SuperFect转染试剂(1μg DNA/5μlSuperfect，QIAGEN)混合，室温放置10分钟后，最后加入3ml含3％ FBS的OptiMEM。将所得混合物加到细胞中，培养3小时后，用不含血清的MEM将细胞洗涤两次，然后在含40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM中培养70小时。回收这些细胞，将颗粒悬浮于OptiMEM(107个细胞/ml)并反复冻融三次。将冻融裂解物与脂转染试剂DOSPER(Boehlinger Mannheim)混合(106个细胞/25μlDOSPER)混合，室温放置15分钟后，转染上述克隆的F表达辅助细胞之一LLC-MK2/F7细胞(106个细胞/孔，12孔平皿)，用不含血清的MEM(含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培养，回收上清。
制备缺损病毒载体时，例如，如果将载体中包含的病毒基因组上缺损不同包膜基因的两种载体导入同一细胞时，每种缺失的包膜蛋白通过另一载体的表达来提供，这种互补导致产生感染性病毒颗粒，它们能复制并繁殖。即，如果将两种或多种包膜蛋白互补的本发明病毒载体同时混合接种，能以较低成本产生各种包膜基因缺陷型病毒载体的大量混合物。由于这些包膜基因缺陷的病毒具有较小的基因组，它们允许插入较长的外源基因。此外，这些本身没有感染能力的病毒在细胞外稀释后很难维持共感染状态，因此它们不会产生后代，对环境的损害较小。
另外，将复制型副粘病毒载体施用到个体或细胞后，在终止治疗等必须抑制病毒载体的增殖时，如果给与RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂，则也可以仅特异性地抑制病毒载体的增殖而不损害宿主。
可以将回收的副粘病毒纯化使其达到基本纯。纯化方法包括过滤、离心分离和柱纯化等公知的纯化分离方法或上述方法的组合。“基本纯”是指病毒是其所在样品的主要成分，一般来说，当样品所含的全部蛋白质(作为载体或稳定剂加入的蛋白质出外)中，来自病毒载体的蛋白质比例为10％或以上，优选20％或以上，更优选50％或以上，优选70％或以上，更优选80％或以上，进一步优选90％或以上时，可以确定为基本纯的病毒载体。副粘病毒的具体纯化方法包括采用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753)和吸附于含有岩藻糖硫酸的多糖和/或其分解产物上的方法(WO97/32010)。
以可表达的方式编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体通过导入哺乳动物细胞而在该细胞中表达、分泌表位结合型β2m。本发明提供生产表位结合型β2m的方法，该方法包括以下步骤：(a)将可表达地编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体导入哺乳动物细胞，和(b)从导入了所述载体的哺乳动物细胞或其培养上清中回收生成的表位结合型β2m。
在哺乳动物细胞中表达的表位结合型β2m与细胞本身带有或外源性表达的MHC分子形成异二聚体。回收该异二聚体，则可以得到含有表位结合型β2m的蛋白质复合体。具体地，本发明提供生产包含I类MHC重链和表位结合型β2m的I类MHC/肽复合体的方法，该方法包括以下步骤：(a)将可表达地编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体导入哺乳动物细胞，和(b)从导入了所述载体的哺乳动物细胞或其培养上清中回收生成的I类MHC/肽复合体。制备I类MHC/肽复合体时，更优选在哺乳动物细胞中外源性地高水平表达I类MHC重链，使该重链与表位结合型β2m形成复合体。例如，将表达I类MHC重链的病毒载体导入哺乳动物细胞。对所述病毒载体没有特别限制，但可以优选使用副粘病毒载体，也可以使用其它载体。或者，也可以使用下述哺乳动物细胞，将载体整合到该细胞的染色体中，组成型表达或诱导型表达所需的I类MHC重链。由此可以在细胞中大量表达所需的I类MHC重链，制备I类MHC/肽复合体。或者，也可以通过使分别制备的表位结合型β2m与I类MHC重链结合来制备I类MHC/肽复合体。
被表达的I类MHC重链可以是膜结合型或分泌型(或游离型)。另外，I类MHC重链可以是野生型蛋白，也可以是氨基酸序列被修饰的蛋白。分泌型I类MHC重链可以通过表达缺失膜结合区域的蛋白质制备。并且，还可以在I类MHC重链上附加所需的肽。例如，可以在I类MHC重链上附加生物素化基质肽并使其表达，将所得的I类MHC/肽复合体生物素化后，用抗生物素蛋白简便地制备I类MHC/肽四聚体。
本发明中，“生物素化基质肽”是指可以作为生物素化基质的肽。对生物素化基质肽无特殊限制，例如只要是氨基酸残基上的-NH2以可以进行化学反应的状态排列的肽，任何一种均可以使用。例如如果在反应试剂中使用生物素酰肼(Assay Design，Co.，Ltd.)，则可以化学修饰糖部分，用生物素HNS则可以化学修饰赖氨酸的-NH2，用生物素BMCC可以化学修饰-SH，用5-(生物素酰胺基)-戊基胺EZ-Link可以化学修饰-COOH。优选生物素化基质肽是被酶生物素化的肽。例如，优选作为生物素化酶(生物素连接酶)基质的肽，其在氨基酸(例如赖氨酸)上特异性地附加一个生物素。这种酶可以列举来自大肠杆菌的被称为Bir A的生物素连接酶。BirA识别13个氨基酸的肽序列，可以在肽中央的赖氨酸上添加一个生物素。已知作为BirA基质的肽序列有多种，例如LGGIFEAMKMELRD(SEQ ID NO：31)等(Schatz，P.，Biotechnology 11：1138-1143(1993)；Crawford，F.，Immunity 8：675-682(1998))。
可以通过下述方法制备上述I类MHC/肽四聚体，该方法包括(a)将包含生物素化基质肽的I类MHC重链生物素化的步骤，和(b)在抗生物素蛋白的存在下装配生物素化I类MHC重链的步骤。具体地，例如在I类MHC重链上附加BirA基质肽(BSP)序列，然后制备包含该I类MHC重链的I类MHC/肽复合体。随后，用BirA酶将I类MHC重链生物素化。通过FPLC等纯化添加了生物素的I类MHC/肽复合体，该复合体可以通过与链霉抗生物素蛋白的生物素化部位以1∶1的比例反应而多聚体化。链霉抗生物素蛋白可以用R-藻红蛋白(R-PE)、Cy 5等适当标记。四聚体化的I类MHC/肽复合体与CTL(表位特异性CD8阳性T细胞)的结合能力提高，因此对CTL(表位特异性CD8阳性T细胞)的检测和定量极为有用。与I类MHC/肽多聚体结合的细胞可以通过FACS等检测。
即，本发明涉及抗原特异性T淋巴细胞的检测和定量的方法，该方法使用本发明载体或用本发明载体表达的表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体。另外，本发明涉及抗原特异性T淋巴细胞的检测试剂，其包含本发明载体或用本发明载体制备的表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体。本发明还提供本发明载体或用本发明载体制备的表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体在抗原特异性T淋巴细胞检测中的应用。
例如，用I类MHC/肽四聚体可以方便并且高灵敏度地进行表位特异性CD8阳性T细胞的定量。使用该四聚体的抗原特异性T淋巴细胞检测方法包括以下步骤：(1)使该四聚体在包含T淋巴细胞的试样中存在的步骤，和(2)检测与该四聚体结合的细胞的步骤。通过确定与该四聚体结合的细胞的量，可以定量抗原特异性T淋巴细胞。
个体中表位特异性CD8-阳性T淋巴细胞的定量可以如下进行：例如，当表位来自HIV时，对HIV感染者的PBMC 1×106，加入呈递HIV表位的四聚体，添加量以I类MHC/肽复合体的量计为20μg/ml，在37℃反应15分钟，然后在4℃反应20分钟。此时四聚体的最适量和最佳反应温度因各四聚体而异，因此可以适当调整。然后细胞用抗CD8-APC双重染色，用流式细胞计进行分析，测定所有CD8阳性T细胞中四聚体阳性细胞的频率。不仅是PBMC，从淋巴节等组织分离的细胞也可以用该方法定量。
按照上述方法用四聚体染色的细胞可以用抗PE抗体-磁珠(DaiichiPure Chemicals)进一步染色，用磁细胞分离装置(Daiichi Pure Chemicals)分离表位特异性细胞。因此，本发明四聚体也可以用于表位特异性细胞的分离。即，可以通过如下步骤分离抗原特异性T淋巴细胞：使该四聚体在包含T淋巴细胞的试样中存在的步骤，和检测与该四聚体结合的细胞的步骤。
另外，本发明的载体或用该载体表达的表位结合型β2m也可以用于体外CTL分析。CTL分析的靶细胞通常包括与CTL来自同一个体的细胞株，例如用合成肽对已经被Epstein-Barr病毒(EBV)转化的B细胞株(自体-淋巴母细胞样细胞系，auto-LCL)进行脉冲所得的细胞可以用作靶细胞，可以添加用本发明载体制备的表位结合型β2m代替合成肽，或通过用表达表位结合型β2m的病毒载体感染auto-LCL而作为靶细胞使用。实际上所述auto-LCL被确认具有细胞毒性。通过用表达表位结合型β2m的病毒载体及表达所需I类MHC重链(膜结合型)的病毒载体进行共感染，可以类似地使用人细胞株作为靶细胞，所述表位结合型β2m由I类MHC重链呈递。
另外，表位结合型β2m可以用于建立表位特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。表位特异性CTL可以通过试管内施加一次或多次刺激来建立。例如，可以如下建立HIV Nef138-10特异性CTL：通过放射线照射阻止HIV-1感染者外周血单核细胞(PBMC)的增殖，通过用HIVNef138-10肽脉冲过的刺激细胞(来自同一个体的细胞)施加刺激，然后在IL-2的存在下进行共培养。此时，通常使用合成肽，但在感染了表达本发明表位结合型β2m的病毒载体的细胞的培养上清(即游离型表位结合型β2m蛋白质)中也发现了同样的效果。另外，也可以通过将表达表位结合型β2m的病毒载体感染刺激细胞，从而类似地制备CTL。
另外，本发明的表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体(单体或多聚体)，通过例如利用除了生物素-抗生物素蛋白结合以外的方法结合到蛋白芯片的支撑基材上，也可以用作蛋白芯片。
对I类MHC重链没有特别限制，但用于人时优选人I类MHC分子。人I类MHC分子被称为人白细胞抗原(HLA)，种类非常丰富，本发明所用的HLA可以是其中的任何一种。例如，本发明可以用于感染性疾病或癌症等中目的表位已经鉴定的任何类型的HLA，它们可以作为定做(或量身定做)的试剂。
特别是在日本，HLA-A24(约60～70％)、HLA-A2(约40％)和HLA-A26(约20％)等HLA型的频率较高，其次，HLA-A11(20％)、HLA-A31(至多20％)和HLA-A33(至多20％)的频率也很高。用于日本人时特别优选这些HLA型。
为了开发适应于一定范围内不特定多数个体的试剂和药物，例如在日本，优选在日本人中等位基因频率为5％或以上的HLA(即，10％或以上的日本人具有的HLA)。这样的HLA型可以列举：
A座位 B座位
A*0201 B*0702
A*0206 B*1501
A*1101 B*3501
A*2601 B*4001
A*31012 B*4002
A*3303 B*44031
B*4601
B*52011
B*5401
本发明人在实施例中使用A24限制性I类HLA重链作为I类MHC分子，用A24限制性I类HLA分子呈递的来自HIV-1的表位作为表位。约60～70％的日本人具有HLA-A*2402基因型。因此，A24限制性I类HLA重链，特别是A*2402(Litte，A.-M.，Immunogenetics 35：41-45(1992))适合于本发明。
通过本发明获得的表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体可以用于诱导抗原特异性细胞免疫。本发明提供抗原特异性细胞免疫诱导剂，其包含通过本发明获得的表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体。另外，本发明涉及通过本发明获得的表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体在诱导抗原特异性细胞免疫中的用途。
本发明人用SeV表达系统，以HLA-A*2402呈递的来自HIV-1Nef蛋白的表位为例，制备了表位结合型β2m，证明所述表位结合型β2m以分泌型蛋白的形式与细胞表面上的HLA-A*2402分子结合，由此可以将抗原高效地呈递到CTL。本发明病毒载体产生的表位结合型β2m被提示能用作蛋白制剂，将其纯化除去病毒污染后，可以得到临床上有用的抗原特异性细胞免疫诱导剂。本发明提供含有用本发明病毒载体制备的表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体的药物组合物。
用本发明表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体诱导抗原特异性细胞免疫的方法具体包括，使本发明表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体与(表位特异性)CD8阳性T细胞接触的步骤。
例如，本发明的表位结合型β2m可以用于体外建立表位特异性CTL细胞株。表位特异性CTL细胞株可以通过试管内施加一次或多次刺激而建立。例如，可以如下建立HIVNef138-10特异性CTL：通过放射线照射阻止HIV-1感染者外周血单核细胞(PBMC)的增殖，通过用HIV Nef138-10肽脉冲过的刺激细胞(来自同一个体的细胞)施加刺激，然后在IL-2的存在下进行共培养。此时，通常使用合成肽，但在感染了表达本发明表位结合型β2m的病毒载体的细胞的培养上清中也发现了同样的效果。
另外，本发明的表位结合型β2m可以用于体外CTL分析中脉冲靶细胞。脉冲CTL分析的靶细胞时，用表位结合型β2m感染细胞培养上清等代替合成肽也可以获得同样的效果。通常I类MHC重链(膜结合型)+β2m+肽的复合体已经在细胞表面上表达。用合成肽脉冲是旨在用复合体的肽部分交换合成肽的方法，但在用表位结合型β2m进行脉冲时，认为进行了与复合体中β2m+肽的交换。
本发明的表位结合型β2m还可以用于回体脉冲患者树突细胞。采集患者的外周血单核细胞，用标准方法诱导分化成树突细胞。用表位结合型β2m脉冲这些树突细胞，然后接种到患者皮下。结果与体内试验一样，表位结合型β2m以I类MHC重链(膜结合型)+表位结合型β2m的形式在细胞表面表达，有望诱导表位特异性CTL。与用肽脉冲树突细胞时相比，表位可能在I类MHC重链(膜结合型)上长期表达，其有望用作细胞疫苗(治疗疫苗)。另外，通过将本发明的表位结合型β2m作为蛋白制剂直接体内给与，也可以诱导表位特异性CTL。
另外，以可表达的方式编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体本身可以用于诱导抗原特异性细胞免疫。本发明涉及包含以可表达的方式编码表位结合型β2m的哺乳动物细胞感染性病毒载体的抗原特异性细胞免疫诱导剂。另外，本发明涉及以可表达的方式编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体在诱导抗原特异性细胞免疫中的应用。本发明的病毒载体可以用于基因治疗。本发明还提供包含以可表达的方式编码表位结合型β2m的哺乳动物细胞感染性病毒载体的药物组合物。该病毒载体可以诱导抗原特异性细胞免疫，因此能在感染性疾病或癌症等中用于诱导抗原特异性免疫。将本发明的病毒载体用于基因治疗时，可以通过直接(体内)或间接(回体)给药的基因表达来给与。
例如，体外建立表位特异性CTL细胞株时，在对刺激细胞的刺激中，通过用表达表位结合型β2m的病毒载体感染细胞来代替合成肽的使用，可以建立CTL。
另外，在体外CTL分析的靶细胞脉冲中，也可以使用本发明的病毒载体。可以用感染了表位结合型β2m的病毒表达载体的Auto-LCL细胞而不是合成肽作为靶细胞。实际上该细胞被确认具有细胞毒性。另外，使用人细胞株时，可以将这些细胞株用表达所需I类MHC重链(膜结合型)的病毒载体和表达该I类MHC重链呈递的表位结合型β2m的病毒载体共感染，用作靶细胞。
进一步地，本发明的载体还可以用于往患者树突细胞中回体导入基因。采集患者的外周血单核细胞，用标准方法诱导分化成树突细胞。用表达表位结合型β2m的病毒载体感染该树突细胞，然后接种到患者皮下。问题在于即使用肽或表位结合型β2m蛋白等进行脉冲，也不知能在树突细胞上持续表达多长时间。实际上，有报告指出，当细胞用合成肽来脉冲时，表位在树突细胞上的表达在短时间内消失。相反，用病毒载体感染树突细胞，然后使表位结合型β2m在细胞中表达，由此可以使表位结合型β2m长时间表达。另外，本发明的载体还可以用于体内基因治疗，其中通过体内给与载体诱导表位特异性CTL。
利用载体进行基因导入时，靶细胞优选具有抗原呈递能力的细胞。这种细胞可以特别列举树突细胞(DC)。例如，通过将本发明的载体回体导入树突细胞中，可以在这些细胞中形成所需的I类MHC/肽复合体。所得的细胞可以用于活化抗原特异性T细胞。本发明涉及导入了感染哺乳动物细胞的病毒载体的哺乳动物细胞，所述载体可表达地编码本发明表位结合型β2m。哺乳动物细胞可以使用具有抗原呈递能力的所需的分离细胞。特别是通过往这些细胞中导入编码I类MHC重链的外源基因，可以形成大量I类MHC/肽复合体。编码I类MHC重链的基因可以由染色体外的表达载体编码，也可以整合到细胞染色体中。如果在细胞内使分泌型I类MHC重链表达，则产生分泌型I类MHC/肽复合体。这样的细胞对分泌型I类MHC/肽复合体的制备尤为有用。如果在细胞中使膜结合型I类MHC重链表达，则膜结合型I类MHC/肽复合体在该细胞表面表达。这类细胞对表位特异性CTL具有优良的抗原呈递能力。另外，本发明涉及细胞表面具有通过本发明方法制备的表位结合型β2m的细胞。这种细胞可以通过例如将用本发明方法制备的表位结合型β2m添加到细胞中来制备。例如，从患者制备树突细胞，用本领域技术人员公知的方法在试管内诱导分化成树突细胞。将所得的细胞与通过本发明方法制备的表位结合型β2m混合。由此，所述表位结合型β2m与来自患者的树突细胞表面的I类MHC重链形成复合体。这些细胞还对表位特异性CTL具有抗原呈递能力。将如此制备的呈递目的表位的细胞返回患者体内，由此可以诱导表位特异性免疫。即这些细胞可以用作疫苗。因此，用本发明方法制备的表位结合型β2m可以用作在患者体内诱导抗原特异性免疫的药物。通过将用本发明方法制备的表位结合型β2m脉冲到细胞而制备细胞表面具有表位结合型β2m的细胞时，脉冲前可以通过酸处理除去既存的表位。酸处理可以通过下述步骤进行：将细胞暴露在酸性环境中，使细胞表面呈递的表位肽明显解离。酸处理可以通过例如下述方法进行：将细胞用肽-剥离(stripping)缓冲液(0.13M柠檬酸(pH3)，66mMNa2HPO4，150mM NaCl，17mg/ml酚红)4℃处理1分钟，然后用足够量的培养液(例如RPMI)中和。本领域技术人员可以通过不同的方法进行具有相同效果的酸处理。本发明提供一种药物组合物，该组合物包含导入了以可表达的方式编码上述表位结合型β2m的哺乳动物细胞感染性病毒载体的细胞，或呈递由本发明方法制备的表位结合型β2m的细胞。
大体上几乎所有的体细胞都内源性地表达I类MHC，因此制备上述细胞的过程中没有必要外源性地表达I类MHC重链，可以只表达或添加表位结合型β2m。检查患者的MHC类型，通过表达或添加根据上述类型选择的表位结合型β2m，可以获得量身定做的治疗。例如，如果患者的I类MHC型为A24限制型，通过使用与A24限制性T细胞呈递的肽融合的β2m，有望获得更好的疗效。优选MHC型与血清型或基因型一致，更优选与基因型一致。约70％的日本人具有所谓的HLA-A*2402基因型，因此鉴定通过具有所述HLA-A*2402型的细胞呈递的表位，用该表位设计表位结合型β2m，由此可以制备特别适用于日本人的药物。进一步地，通过解析多种类型的MHC型的表位，可以决定对每个患者最适合的治疗方案。
本发明的感染哺乳动物细胞的病毒载体、由该载体获得的表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体、导入了该载体的细胞、或细胞表面具有该表位结合型β2m的细胞，可以根据需要与可药用的所需载体组合形成组合物。“可药用载体”是指可以与本发明载体、表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体或上述细胞一起给药，不明显损害它们的活性的材料。例如，可将本发明的感染哺乳动物细胞的病毒载体、或由该载体得到的表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体用生理盐水或磷酸缓冲生理盐水(PBS)等适当稀释制成组合物。使副粘病毒载体在鸡卵中增殖时，组合物可以包含尿囊液。另外，也可以将上述细胞悬浮在生理盐水、PBS或培养液等中。本发明的组合物还可以含有去离子水、5％葡萄糖水溶液等载体。进一步地，还可以含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂和杀菌剂等。另外，可以添加防腐剂或其它添加剂。本发明的组合物可以用作试剂或药物，还可以用作疫苗。本发明还涉及下述组合物作为试剂、药物或疫苗的用途，该组合物含有本发明的载体、或由该载体获得的表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体、或上述细胞。为了提高免疫原性，疫苗组合物中可以加入细胞因子、霍乱毒素和沙门毒素等免疫促进剂。另外，疫苗还可以与明矾、不完全弗氏佐剂、MF59(油乳胶)、MTP-PE(来自分枝杆菌属细胞壁的胞壁酰三肽)和QS-21(来自皂树Quilaja saponaria)等佐剂组合。
另外，施用本发明的药物组合物时，与提高佐剂效果的细胞因子类组合也有效。该组合包括：i)IL-2与单链IL-12的组合(Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(15)：8591-8596(1999))，ii)IL-2与干扰素-γ的组合(US5,798,100)，iii)单独使用的粒细胞集落刺激因子GM-CSF，和iv)用于治疗脑肿瘤的GM-CSF和IL-4组合(J.Neurosurgery 90(6)：1115-1124(1999))等。
用作疫苗时，可以适用于例如肿瘤、感染性疾病和其它一般性疾病。治疗感染性疾病时，例如可以分析感染性微生物抗原蛋白的表位，制备结合了该表位的β2m。抗原蛋白包括例如流感强毒株H5N1型等的包膜、日本脑炎的包膜蛋白(Vaccine 17(15-16)：1869-1882(1999))、艾滋病中的HIV gag或SIV gag蛋白(J.Immunology 164：4968-4978(2000))、HIV包膜蛋白、Nef蛋白和其它病毒蛋白等；霍乱中例如霍乱毒素的B亚单位(CTB)(Arakawa，T.等，Nature Biotechnology，16(10)：934-8(1998)；Arakawa，T.等，NatureBiotechnology，16(3)：292-7(1998))，狂犬病中例如狂犬病病毒糖蛋白(Lodmell，D.L.等，Nature Medicine 4(8)：949-52(1998))，宫颈癌的人乳头状瘤6型的衣壳蛋白L1(J.Med.Virol 60：200-204(2000))等。本发明还可以用于致病性副粘病毒例如麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒等很需要疫苗的病毒。另外，也可以使用抗原蛋白的表位，包括日本脑炎的JE-E抗原蛋白(特开昭64-74948，特开平1-285498)、人单纯疱疹病毒的gD2蛋白(特开平5-252965)、来自丙型肝炎病毒的多肽(特开平5-192160)和来自假型狂犬病病毒(pseudorabies virus-derived)的多肽(特表平7-502173)等。例如，解析来自感染了这些病原性微生物的患者的细胞，鉴定由抗原呈递细胞(APC)呈递的抗原蛋白的表位。通过选择适当的HLA型可以鉴定用于所需HLA型的表位。
着眼于肿瘤特异性抗原，开发多种新治疗策略和方法在肿瘤治疗上具有临床意义。例如，在肿瘤治疗中，可以用本发明的载体在肿瘤细胞或DC细胞等抗原呈递细胞(APC)中表达表位结合β2m，或给予表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体等蛋白制剂。
开发疫苗疗法的一般方法可以列举利用下述DC细胞的方法：已知该树突细胞(DC)对辅助T细胞(Th)具有抗原呈递能力，其对CTL也具有通过I类MHC分子高水平呈递抗原的能力(Mayordomo，J.I.等，Nature Med.1(12)：1279-1302(1995))。肿瘤免疫疗法的一个例子是，Yasushi Fuji等正在建立以MAGE抗原为靶的肿瘤疫苗疗法，所述MAGE抗原被确认在多种恶性肿瘤中表达(National Hospital Kyushu Cancer Center)。对胃肿瘤复发患者6例、食道肿瘤复发患者1例进行治疗，结果在食道肿瘤病例中发现转移淋巴结缩小、肿瘤标记减少以及临床症状(声嘶)得到改善，6例胃肿瘤病例中发现4例肿瘤标记减少。没有发现任何副作用，这表明肿瘤免疫疗法的安全性。另外，发现临床症状改善和肿瘤标记减少的病例多，这表明通过选择疫苗的给药途径或适应病例等，其可能成为一种有效的疗法。实际中已经开始了利用MAGE-3肽的DC疫苗疗法，其表明可能成为对进行性复发型消化器官癌病例安全的肿瘤特异性免疫疗法。但是，在以大量患者为对象的预防性疫苗给药中，对每个患者调整作为“自然助剂(natural adjuvant)”的树突细胞的最适给药条件是复杂而不切实际的。因此正在寻找有效的方法(Yamagishi，H.等，Oral presentation in the General meeting of Japan society ofCancer Therapy：October 12(1999)，Gifu City)。将本发明用于这些肿瘤疫苗疗法可能极为有效。
病毒引起的肿瘤的预防可以通过使用该病毒的疫苗进行预防性感染而实现。与其它原因导致的肿瘤相比，病毒引起的肿瘤更能实际预防。例如，对于与肝脏肿瘤相关的丙型肝炎病毒(HCV)、与子宫癌相关的乳头状瘤病毒(HPV)以及与成人性白血病相关的HTLV-1，已经有以预防感染和治疗为目的的疫苗。在日本肿瘤中，肝脏肿瘤占相当高的比例。非口服途径可以感染丙型肝炎病毒，并且在免疫能力正常的成人中相当一部分变成慢性。预计约20％的感染者将患慢性肝炎或肝硬化。进一步地，肝硬化患者多数引发肝细胞癌。丙型肝炎的干扰素治疗使一部分患者有可能治愈，但其有效率不及当初期望的水平，目前尚有半数以上的患者没有有效的治疗方法。一般病毒感染的预防是通过接种疫苗诱导中和抗体进行，但丙型肝炎病毒容易变异，目前还没有证明终止感染的中和抗体的存在。已知病毒感染疾病中，除了诱导中和抗体外，通过诱导CTL可以预防感染。通过给与本发明的载体，对这些情况也有望诱导CTL活化。
作为诱导CTL的新方法，Moriyama，T.等(Jichi Medical School)正在研究用编码致病体抗原的基因本身作为疫苗(DNA疫苗)。如他们的文章中所述，其问题是表达量不足，给药部位局限于肌肉等(Kurane，I.“DNA vaccine，present situation and new findings”，Current Concepts in Infectious Diseases19(3)：6-9(2000))。另一篇文章中概述了利用膜型糖蛋白HER2的癌症疫苗，所述糖蛋白HER2具有可在乳癌等中过度表达的酪氨酸激酶活性(Kageyama，S.，Watanabe，M.，Hiasa，A.，and Suku，K.，“Cancer and immunity，cancer-specific immune therapy，vaccine therapy against breast cancer using aHER-derived peptide”，New Horizon for Medicine 32(5)：1167-1172(2000))。本发明提供的病毒载体有望发挥比这些DNA疫苗更高的效果。如果用在哺乳动物组织中可以广范围表达的病毒载体(腺病毒载体、腺伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、痘苗病毒载体和仙台病毒载体等)构建本发明的载体，则可以提供具有高效率的疫苗。
虽然子宫癌只是女性特有的肿瘤，但开发预防和治疗HPV感染的疫苗同样很重要。HTLV-1感染的主要途径是母婴传播，但还有其它感染途径。近年发现的HGV的致病性尚不明确，但它与HCV一样在社会上广泛传播，预防这些病毒在公共卫生上也是必要的。因此，这些病毒也是本发明适用的对象。
对抗原呈递细胞的利用及给药途径的研究也很重要。研究最广的用于疫苗治疗的给药途径包括下述步骤：利用树突细胞(DC)对CTL也具有通过I类MHC分子呈递抗原的能力，从患者外周血分离极少量的DC细胞，在试管内培养扩增，然后通过静脉注射使其返回体内。该方法需要相当的设施和培养时间。最近备受关注的方法是利用皮肤的疫苗疗法。近年来发现树突细胞包括朗氏细胞(Langerhans cell，LC)通过其细胞表面的I类MHC分子将病毒抗原或癌症抗原等内源性抗原高效地呈递到CTL，利用这些细胞的抗病毒疫苗疗法或癌疫苗疗法的研究目前备受关注。皮肤表皮中存在大量LC细胞，因此，通过在皮肤上施用病毒肽或癌肽、或涂布含有抗原的基因，有可能开发出更有效的DNA疫苗法。但是，LC细胞在正常皮肤中处于休眠状态，对Th和CTL的抗原呈递能力低，向淋巴结的移动性也很弱，因此利用正常皮肤的病毒疫苗法或癌疫苗疗法难于实现。为了解决这一问题，Naohiro Seo和Masahiro Takigawa(Hamamatsu Univ.School of Medicine)等证实，通过反复进行带剥离(tape stripping)(TS)(8～15次)破坏皮肤最外层的角质层屏障，可以使LC细胞在皮肤中活化，然后转移到淋巴结内，并将抗原高效呈递到Th细胞(特愿平10-316585，“Percutaneous peptideimmunization via comeum barrier-disrupted murine skin for experimental tumorimmunoprophylaxis″；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：371-376(2000))。该方法扩大了病毒疫苗或癌治疗的可能性，因其可能将病毒肽、癌肽或抗原DNA用于破坏了屏障的皮肤。本发明中也可以采用这些给药方法。
为了更可靠的临床应用，建立人HLA限制性癌特异性CTL细胞株，克隆该细胞株识别的癌反应性CTL诱导型抗原基因，开发可以对癌症患者临床应用的肿瘤特异性免疫疗法的靶分子，这很重要。鉴定由与患者同型的HLA所呈递的表位，用该表位制备本发明的载体或肽疫苗，由此有望更有效地诱导免疫。
在日本多发的癌症，例如肺癌、消化道癌(食道癌、胃癌、大肠癌)、肝癌、头和颈部癌、乳癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌和白血病中，选择作为组织型占这些癌症大部分的鳞状上皮癌和腺癌作为治疗目标在临床上是有益的。上皮癌不仅在日本占成人恶性肿瘤的大半，在全世界也是发病率最高的癌症。因此，上皮癌细胞特异性抗原的表位适用于本发明。另外，对于HLA，在日本出现频率高的HLA-A24(约60％的癌症患者)、HLA-A2(约40％)、HLA-A26(约20％)抗原限制性的CTL识别性癌退化抗原的鉴定尤为重要。其次，以HLA-A11(20％)、HLA-A31(最多20％)，和HLA-33(最多20％)为对象的抗原的鉴定也很重要。95％以上的日本人至少具有HLA-A24、-A2、-A26、-A31和-A33中的任意一种，并且上述HLA等位基因在各人种中广泛分布。因此，可以从具有这些HLA型的细胞鉴定出癌反应性CTL诱导型抗原基因，并将其用于本发明。
Kyogo Ito(Medical school of Kurume Univ.)等建立了大量对日本人多发的人HLA限制性上皮癌(腺癌和鳞状上皮癌)的特异性杀伤T细胞，并且克隆了编码被这些细胞识别并具有上皮癌反应性CTL诱导能力的抗原的基因。进一步地，他们鉴定了这些基因编码的癌抗原肽，分析了它们的体外杀伤T细胞诱导能力(Tou，U.，Yamana，H.，Sueyoshi，S.，Shintani，F.，Tanaka，T.，Kubota，M.，Mine，T.，Sasahara，H.，and Ito，K.，“Cloning and analysis of anantigen gene from the peripheral blood lymphocytes after the specific adoptiveimmunotherapy by a local injection of CTL from a patient carrying esophaguscancer”，The Japanese Society of Gastroenterological Surgery 33(7)：1191(2000))。至今为止，鳞状上皮癌cDNA库的4种基因(SART-1～SART-4)和腺癌cDNA库的3种基因已经被克隆，其编码的蛋白质已经分析出。导入了SART-1基因的癌细胞诱导了选择性凋亡。另外，确认HLA-A24限制性肽(SART-1 690-698)强烈诱导CTL，HLA-A26限制性肽(SART-1 736-744)诱导HLA-A2601，-A2602，或-A2603癌症患者中的CTL(Yamana，H.和Ito，K.(Medical School of Kurume Univ.)，“Antigen peptide therapy of tumors；cancerimmunotherapy using the SART-1 antigen peptide”，Joumal of Clinical andExperimental Medicine 190(2)：129-133(1999)；Inoue，K.(Research Institute ofNational Cancer Center)，Nakao，M.，Matsunaga，K.，Matsuoka-kikuchi，S.，Yamana，H.，and Ito，K.(Medical School of Kurume Univ.)，“Induction of CTLin peripheral blood lymphocytes from HLA-A26-positive healthy subjects andcancer patients with different HLA subtypes，using the SART-1 peptide”，Generalmeeting abstracts of Japanese Cancer Association)。另外，发现SART-3癌反应性CTL诱导抗原(140kD)在增殖细胞中选择性表达，并且还在癌细胞核内表达，在该抗原中鉴定出两种对HLA-A24阳性癌患者淋巴细胞具有CTL诱导能力的9肽(Yamana，H.，Sasatomi，T.，Miyagi，Y.，Tou，U.，Shiromizu，K.，and Ito，K.(Medical School of Kurume Univ.)，Japan Surgical Society(supplement)101：417(2000))。这些癌反应性CTL诱导抗原在各种癌中的蛋白表达水平如下：SART-1抗原在60～80％的鳞状上皮癌、40～50％的除乳癌以外的腺癌中表达。SART-2在60％以上的鳞状上皮癌中表达，SART-3在包括腺癌、鳞状上皮癌的大部分恶性肿瘤中表达。相反，这些抗原在正常组织(除睾丸外)中不表达(Ito，K.，Shichijo，S.，and Yamana，H.(MedicalSchool of Kurume Univ.)，“Tumor immunity 9，Human cancer specific Tcell-recognized antigen 2，Squamous cell carcinoma-reactive CTL-inducingantigen SART-1 and peptide vaccines”，Immunology Frontier 9(3)：195-204(1999))。22％的日本人有HLA-A26，约60％的日本人有HLA-A*2402。因此，这些肽疫苗有望用于日本大量上皮癌症患者。久留美大学目前正在计划利用上述肽进行I期临床试验(Yamana，H.and Ito，K.(Medical School ofKurume Univ.)，“An explanation of guideline to clinical studies”，A proposalregarding the first clinical studies on tumor peptide vaccines，Cellular MolecularMedicine 1(1)：89-95(2000))。将本发明用于来自这些抗原蛋白的表位可能有效。
将编码上述记载的肽抗原的基因用于本发明，有可能对肿瘤进行有效的免疫治疗。其它的肽包括例如癌抗原Muc-1和Muc-1样粘蛋白串联重复肽(US 5,744,144)和黑素瘤gp100抗原等。采用这些基因进行的免疫治疗广泛用于乳癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌和肺癌等。另外，上述肿瘤抗原肽HER2的基因在正常组织和肿瘤中的表达如下：在约20～40％的乳癌、卵巢癌、胃癌、非小细胞性肺癌病例中出现基因扩增或表达增加，该表达增加呈现较高的肿瘤特异性趋势。还可以列举从卵巢癌患者和健康人外周血单核细胞纯化的树突细胞中得到的HER 2的两种9肽(HER2p63-71、HER2p780-788)等(Eur.J.Immunol.30：3338-3346(2000))。另外，本发明的载体或蛋白质还可以用于利用CEA表位肽对CEA阳性进行性实体瘤实施癌疫苗疗法(特异主动免疫疗法)(Kim，C.等，Cancer Immunol.Immunother.47：W90-96(1998))。例如，通过选择性收集血液组分从患者采集大量外周血单核细胞后，从单核细胞级分添加IL-4和GM-CSF诱导树突细胞(DC)。往被诱导的DC中导入用本发明载体制备的CEA表位肽或载体本身，最后树突细胞以“DC疫苗”的形式进行皮下给药(Okamoto，K.，Shirokazu，T.，Sakakura，C.，Otsuji，E.，Kitamura，K.，and Yamagishi，K.(Kyoto Prefectural University ofMedicine)，“A case of bone metastatic lung cancer wherein dissociation betweenserum CEA values and anti-tumor effect was achieved via CEA-specific activeimmunotherapy”，Intemational Association of Surgeons and Gastoenterologists)。
另外，本发明还可以用于一般疾病。糖尿病中，例如I型糖尿病动物模型中，可以用胰岛素片段肽作为表位(Coon，B.等，J.Clin.Invest.104(2)：189-194(1999))。
含有本发明载体或用本发明载体制备的表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体的组合物以足够至少部分诱导抗原特异性细胞免疫的量给与。但是，蛋白质的给与量或导入基因的表达量应该考虑其有效水平和中毒水平后决定。可以适当选择给药途径，例如经皮、经鼻、经支气管、肌内、腹腔、静脉、关节内或皮下等，但不限于此。另外，可以局部或全身给药。细胞免疫的诱导可以通过本发明记载的CTL试验等检测。
通过给与本发明载体而导入细胞中的基因的表达量可以通过本领域技术人员公知的方法分析。基因转录产物可以通过例如Northern杂交、RT-PCR或RNA保护分析等检测、定量。通过Northern杂交或RNA保护分析进行的检测可以原位进行。另外，翻译产物的检测可以通过使用抗体进行蛋白印迹、免疫沉淀、RIA、ELISA和Pull-down分析等进行。另外，为了更容易地检测导入基因的表达，可以在待表达的蛋白质上添加标记，或插入报道基因以使其表达。报道基因包括例如编码β-半乳糖苷酶、CAT、碱性磷酸酶或GFP蛋白的基因等，但不限于此。
表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体的给药量因疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组合物的形式和给药途径等而异，本领域技术人员可以适当决定。例如在10ng/kg～100μg/kg、优选100ng/kg～50μg/kg、更优选1μg/kg～5μg/kg的范围。当多种表位组合给药时，每种表位可以按照上述的量给药。表位结合型β2m或I类MHC/肽复合体可以与适当的可药用载体组合给药。
载体的给药量因疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组合物的形式、给药途径和导入的基因等而异，本领域技术人员可以适当决定。副粘病毒载体优选以病毒滴度优选为约105pfu/ml～约1011pfu/ml、更优选约107pfu/ml～109pfu/ml、最优选约1×108pfu/ml～约5×108pfu/ml的量在可药用载体中给药。剂量优选约105pfu/次～1011pfu/次，更优选约107pfu/次～109pfu/次，最优选约108pfu/次～109pfu/次。
含有病毒的本发明组合物的给药对象包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、羊、牛和狗等所有的哺乳动物。
【附图说明】
图1表示表达表位结合型β2m(e/β2m)的SeV载体(e/β2m/SeVb)的结构。
图2表示表达膜结合型和分泌型HLA-A*2402分子的SeV载体结构。分泌型HLA-A*2402分子中添加了生物素化基质肽(BirA基质肽)。
图3表示表达膜结合型HLA-A*2402的SeV载体结构。
图4表示从表位结合型β2m的SeV表达载体和分泌型HLA-A*2402的SeV表达载体共感染的细胞回收的I类MHC/肽复合体的检测。CV-1细胞分别用moi＝10和2的A24-BSPhis/SeVb和e/β2m/SeVb感染。三天后，回收培养上清100μl，通过ELISA检测I类MHC/肽复合体。用β2m/SeVb或wt/SeV(不带外源基因的野生型SeV)代替e/β2m/SeVb感染细胞作为阴性对照。
图5是表示分泌型I类MHC/肽复合体纯化的图和照片。CV-1细胞分别用moi＝10和2的A24-BSPhis/SeVb和e/β2m/SeVb感染。三天后，回收培养上清100μl，用抗His标记抗体进行FPLC分级。每一级分取一部分通过SDS-PAGE和蛋白印迹进行分析，测定蛋白质的含量。回收约1mg的分泌型I类MHC/肽复合体。
图6表示膜表达型I类MHC/肽复合体的效果。H9细胞(人T细胞株，HLA-A*2402-)分别用moi＝10和2的A24full/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb感染。用感染wt/SeVb的细胞代替感染e/Nef138-β2m/SeVb的细胞作为阴性对照。18小时后，细胞用100μCi的Na251CrO4标记2小时，然后用Nef-138-10特异性CTL克隆进行51Cr释放分析。
图7表示分泌型表位结合型β2m的效果。H9细胞(HLA-A*2402-，人T细胞株)用moi＝2的e/Nef138-β2m/SeVb共感染，或用moi＝2的wt/SeV感染作为对照组。三天后回收培养上清，用0.22μm的滤膜过滤。
作为靶细胞，H9细胞(HLA-A*2402-，人T细胞株)分别用moi＝10和2的A24full/SeVb和wt/SeV感染。SeV感染18小时后，靶细胞用100μCi的Na251CrO4标记2小时，然后将细胞用如上制备的包含e/Nef138-β2m的培养上清、或作为阳性对照的10μM Nef138-10合成肽、或作为阴性对照的wt/SeV感染细胞培养上清脉冲。1小时后，用Nef138-10特异性CTL克隆进行51Cr释放分析。作为比较，分别用moi＝10和2的A24full/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb感染的H9细胞也同样进行分析。
图8是用I类MHC/肽四聚体检测表位特异性CD8阳性T细胞的照片。往带有HLA-A*2402的HIV感染者和健康人的外周血单核细胞(PBMC)1×106中加入20μg/ml RPE-标记的A24/Nef138-10四聚体(I类MHC/肽四聚体)，在37℃反应15分钟。细胞洗涤一次后，加入APC标记的抗CD8抗体，在4℃反应20分钟。将细胞洗涤3次，用包含1％低聚甲醛的PBS(磷酸盐缓冲液)固定。染色和洗涤时使用含2％胎牛血清、0.1％叠氮化钠的PBS。图中是将含有1×105淋巴细胞的级分用A24/Nef138-10四聚体和抗CD8抗体展开，图中的数字表示CD8阳性T淋巴细胞中四聚体阳性细胞的比例(％)。
发明的最佳实施方案
下面通过实施例详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。另外，本发明所引用的文献作为本说明书的一部分。
[实施例1]HLA-A*2402基因和人β2m基因的分离
从携带HLA-A24的健康人外周血单核细胞(PBMC)的信使RNA(mRNA)克隆HLA-A*2402基因(人I类MHC之一)和人β2m基因。分离mRNA时用Micro-FastTrack Kit(Invitrogen)，合成cDNA时用AMV-RT First-strandcDNA synthesis kit(LIFE SCIENCE)。
以所得的cDNA为模板，HLA-A*2402基因用引物对HLA-5P2和HLA-3B、β2m基因用引物对b2m-5’和b2m-3’进行PCR。
HLA-5P2，5’-GGGCGGATCCGGACTCAGAATCTCCCCAGACGCCGAG-3’(SEQ ID NO：9)
HLA-3B，5’-CCGCCTCGAGCTGGGGAGGAAACAGGTCAGCATGGGAAC-3’(SEQ ID NO：10)
b2m-5’，5’-GGCACGAGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGC-3’(SEQ IDNO：11)
b2m-3’，5’-AATTTGGAATTCATCCAATCCAAATGCGGC-3’(SEQ IDNO：12)
PCR在94℃进行30秒、58℃进行30秒、72℃进行1分钟共35个循环后，在72℃进行延伸反应7分钟。PCR用ExTaq(TaKaRa)进行。所得的PCR产物用pGEM-T载体系统(Promega)克隆(分别为A*2402/pGEM和β2m/pGEM)，其核苷酸序列通过序列反应确认。所述序列反应是用染料终止剂化学(dye terminator chemistry)(Big-Dye terminator cycle sequencing ReadyReaction Kit；Applied Biosystems)在AB1-377 DNA测序仪上进行电泳。
[实施例2]表位结合型β2m表达载体的制备
如下构建编码表达表位结合型β2m的SeV载体的质粒(e/β2m/pSeVb)。表位和接头各自序列在β2m信号序列下游的插入，以及仙台病毒E、S信号、NotI位点的添加通过PCR进行(图1)。接头的氨基酸序列(GGGSGGGSGGGS/SEQ ID NO：14)设计成具有3个重复的GGGS(SEQ IDNO：13)序列。
所用的引物是：
e/b2m-a 1，5’-GGAGGTGGCGGGTCCGGAGGTGGTTCTGGTGGAGGTTCGATCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’(SEQ ID NO：15)
e(Nef)-a2，5’-TCTGGCCTGGAGGCTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTTCGGAGGAGGTGGCGGGTCC-3’(SEQ ID NO：16)
e(Env)-a2，5’-TCTGGCCTGGAGGCTAGATACCTAAGGGATCAACAGCTCCTAGGGATTGGAGGTGGCGGGTCC-3’(SEQ ID NO：17)
e/b2m-a3，5’-TGCGGCCGCCGTACGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCT-3’(SEQ ID NO：18)
b2m-d，5’-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGTTACATGTCTCGATCCCACTT-3’(SEQ ID NO：19)
PCR以β2m/pGEM为模板，用引物对e/b2m-a1和e/b2m-d在94℃进行1分钟、48℃进行1分钟、72℃进行1分钟共15个循环后，在72℃进行延伸反应7分钟。以所得的PCR产物为模板，用e(Nef)-a2或e(Env)-a2和b2m-d在相同条件下进一步进行PCR。再以该PCR产物为模板，用e/b2m-a3和b2m-d在相同条件下继续PCR，得到Nef138-β2m、e/Env584-β2m片段。用pGEM-T载体系统(Promega)克隆上述片段，通过序列反应确认其碱基序列。确认碱基序列后用NotI消化，并插入到pSeV18+b(+)的NotI消化位点，再度确认碱基序列，得到e/Nef138-β2m/pSeVb和e/Env584-β2m/pSeVb(统称为“e/β2m/pSeVb”)。另外，仅表达固有β2m的仙台病毒载体β2m/pSeVb用b2m-a(5’-TGCGGCCGCCGTACGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTA-3’(SEQ ID NO：20)和b2m-d与上述同法构建。Nef表位(Nef138-10)的氨基酸序列和Env表位(Env584-11)的氨基酸序列分别表示在SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26中。
[实施例3]添加了生物素化基质肽的分泌型I类MHC重链表达载体的构建
通过PCR将Bir A基质肽(BSP)序列(SEQ ID NO：31)、组氨酸标记(his)、仙台病毒的E、S信号、和NotI位点添加到HLA-A*2402基因胞外区(图2)。
所使用的引物如下：
A24-a，5’-TGCGGCCGCCGTACGAGGATGGCCGTCATGGCGCCCCG-3’(SEQ ID NO：32)
A24-d1，5’-GTCCCGCAGCTCCATCTTCATTGCCTCAAAGATTCCTCCAAGGGATCCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTT-3’(SEQ ID NO：33)
A24-d1/his，5’-CTACGGCGTACGTCAATGGTGGTGATGGTGGTGGTCCCGCAGCTCCAT-3’(SEQ ID NO：34)
A24-d2/his，5’-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGTCA-3’(SEQ ID NO：35)
PCR以A*2402/pGEM为模板，用引物对A24-a和A24-d1，在94℃进行1分钟、48℃进行1分钟、72℃进行1分钟共15个循环后，在72℃进行延伸反应7分钟。以所得的PCR产物为模板，用A24-a和A24-d1/his在相同条件下进一步进行PCR。再以该PCR产物为模板，用A24-a和A24-d2/his在相同条件下继续PCR，得到A24-BSPhis片段。与制备e/β2m/pSeVb同样，得到A24-BSPhis/pSeVb。
[实施例4]膜结合型I类MHC重链表达载体的构建
通过PCR添加仙台病毒的E、S信号和NotI位点(图2和3)。
所用引物如下：
A24-a#，5’-TGCGGCCGCCGTACGCCGAGGATGGCCGTCATGGCGCCCCG-3’(SEQ ID NO：40)
A24-d4，5’-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGTCACACTTTACAAGCTGTGAG-3’(SEQ ID NO：41)
PCR以A*2402/pGEM为模板，用引物对A24-a#和A24-d4，在94℃进行1分钟、48℃进行1分钟、72℃进行1分钟共15个循环后，在72℃进行延伸反应7分钟，得到A24-full片段。与制备e/β2m/pSeVb同样，得到A24full/pSeVb。
[实施例5]仙台病毒载体的重建和感染
pSeV18+b(+)、pGEM-L、pGEM-P、pGEM-N和vTF7-3已有记载(Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78：2813-2820(1997)；Kato，A.等，EMBO.J.16：578-587(1997)；Yu，D.等，Genes Cells，2：457-466(1997))。仙台病毒载体的重建按照上述文献的方法进行。由e/Nef138-β2m/pSeVb和e/Env584-β2m/pSeVb分别得到e/Nef138-β2m/SeVb和e/Env584-β2m/SeVb(统称为e/β2m/SeVb)。另外，由A24-BSPhis/pSeVb和A24full/pSeVb分别得到A-24-BSPhis/SeVb和A24full/SeVb。
将猴肾细胞株CV-1和LLCMK2用含有10％胎牛血清(FCS)、100U/ml链霉素和100U/ml青霉素(Life Technologies)的MEM(Sigma)培养基(M10)培养。除非特别说明，以下的仙台病毒感染中，CV-1细胞以各种感染复数感染重组仙台病毒，用无血清MEM培养三天。
[实施例6]表位结合β2m(e/β2m)的回收和定量
将感染了e/β2m/SeVb或β2m/SeVb的CV-1细胞的培养上清以40,000×g离心以除去仙台病毒粒子，回收上清。
培养上清中的e/β2m定量通过夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)进行。用抗人β2微球蛋白单克隆抗体(DACO)2.5μg/ml作为捕捉抗体，用过氧化物酶标记的抗人β2微球蛋白单克隆抗体(DAKO)500ng/ml作为检测抗体。发色时使用TMB过氧化物发色试剂盒(BIO-RAD)。
用纯化的人β2微球蛋白(Biogenesis)作为标准样品。
[实施例7]分泌型I类MHC/肽复合体的回收和纯化
CV-1细胞共感染A24-BSPhis/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb或e/Env584-β2m/seVb。回收感染细胞的培养上清，以40,000×g离心除去仙台病毒粒子，回收上清，加入1mM PMSF、3μg/ml亮抑酶肽、3μg/ml抑酶肽和3μg/ml胃酶抑制剂A。I类MHC/肽复合体分泌到上清中的确认通过夹心ELISA法进行。用1μg/ml抗人I类MHC单克隆抗体(Ancell)作为捕捉抗体，用250ng/ml经过氧化物酶标记的抗人β2微球蛋白单克隆抗体(DAKO)作为检测抗体。发色时使用TMB过氧化物发色试剂盒(BIO-RAD)(图4)。
将培养上清加载到填充了NiSO4的Hitrap-Chelating柱(AmershamPharmacia)，在0.02 M NaHPO4、0.5 M NaCl(pH7.4)的缓冲条件下，通过FPLC(Amersham Pharmacia)以0～0.5M的咪唑进行浓度梯度洗脱。用PD-10柱(Amersham Pharmacia)将洗脱缓冲液取代成10mM Tris-HCl(pH8.0)后，用Centricon-30(Amicon)进行超滤并浓缩(图5)。
[实施例8]I类MHC/肽复合体的制备
添加生物素时采用Bir A酶(Avidity)。1mg I类MHC/肽复合体(1.8mg/ml)与10μg BirA在10mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM N-二甘氨酸(pH8.3)、10mMATP、10mM MgOAc中，在100μM生物素的存在下于25℃反应18小时。
添加了生物素的I类MHC/肽复合体的纯化在Superdex 200 HR 10/30柱(Amersham Pharmacia)上用20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl通过FPLC进行。然后用PD-10柱将缓冲液取代成含2mM EDTA的PBS，用Centricon-30经超滤调整至2mg/ml。生物素化的I类MHC/肽复合体与链霉抗生物素蛋白-RPE(Molecular Probe)以生物素化的I类MHC/肽复合体∶链霉抗生物素蛋白的生物素化位点＝1∶1的比例反应，由此形成多聚体。
[实施例9] Nef138-10特异性CTL克隆的建立
将携带HLA-A*2402的HIV-1感染者的外周血单核细胞(PBMC)用R10100μl以3×105/96孔培养一晚上。第二天加入刺激细胞(自身PHA-blast，其用含有0.2μg/ml PHA(Sigma)、10％ Lymphocult-T(Biotest)的RPMI1640(Sigma)培养基(R10)活化一晚上，以3000rad进行放射线照射后，用10μMNef138-10脉冲1小时)，在1μg/ml抗人CD28的存在下培养2周。以后每隔一周用刺激细胞(以10,000rad进行放射线照射后，用10μM Nef138-10脉冲的自身Epstein-Barr病毒转化型B细胞株(B-LCL))施加刺激。刺激2～4次后，一旦能确认CTL活性，则克隆这些细胞。
克隆如下进行：将0.8个细胞/孔的细胞与1×105个细胞/孔的刺激细胞(以10,000rad进行放射线照射后，用10μM Nef138-10脉冲的自身B-LCL)和5×104个细胞/孔的饲养细胞(以3000rad进行放射线照射的健康人PBMC)在10％ Lymphocult-T和2.5％ PHA-sup上清(将健康人PBMC(3×106/ml)用0.2μg/ml PHA刺激48小时的培养上清)的存在下培养3～4周。
[实施例10]CTL对导入了SeV、且能形成膜结合型I类MHC/肽复合体的细胞的识别
通过下述方法进行CTL51Cr释放分析。将人CD4+T淋巴细胞株H9用包含10％ FCS、100U/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI1160(Sigma)培养基(R10)培养。将2×103个细胞/孔的靶细胞(人T细胞株H9)用100μCiNa251CrO4标记2小时，用R10洗涤3次，然后用10μM肽脉冲1小时。以导入了SeV载体的细胞作为靶细胞时，在脉冲前的17小时(即添加效应细胞前20小时)，该细胞以moi＝10∶2的感染复数感染图6所示的SeV载体组合。按照图6所示的每一种E∶T比(效应细胞∶靶细胞)加入实施例9的细胞作为效应细胞，在37℃温育4小时，用γ计数器测定释放到上清中的51Cr。测定自发释放时加入R10代替效应细胞，测定最大释放时加入4％ TritonX-100/PBS代替效应细胞。
特异性裂解(％)用(每一样品的cpm-自发释放的cpm)/(最大释放的cpm-自发释放的cpm)×100进行计算。
CTL对膜结合型I类MHC/肽复合体的识别的检查结果如图6所示。结果表明，在共感染了A24full/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb的细胞中能检测到抗原特异性CTL活化。
[实施例11]从导入了SeV的细胞回收的表位结合型β2m的效果
为了制备SeV导入细胞产生的表位结合型β2m，将e/Nef138-β2m/SeVb以m.o.i＝2的感染复数导入H9细胞，三天后回收培养上清，过滤，得到包含表位结合型β2m的溶液。以感染了A24full/SeVb的H9细胞作为靶细胞与实施例10同法进行CTL分析，比较用肽脉冲和用所得的含表位结合型β2m的溶液脉冲的效果。
表位结合型β2m的效果如图7所示。将从SeV导入细胞回收的表位结合型β2m添加到靶细胞的培养液中，由此可以检测出抗原特异性CTL活化
[实施例12]通过I类MHC/肽四聚体检测表位特异性CD8阳性T细胞
往携带HLA-A*2402的HIV感染者和健康人的外周血单核细胞(PBMC)1×106中加入20μg/ml RPE标记型A24/Nef138-10四聚体(一种I类MHC/肽四聚体)，在37℃反应15分钟。洗涤一次后，加入APC标记型抗CD8抗体，在4℃反应20分钟。将细胞洗涤3次，用包含1％低聚甲醛的PBS(磷酸盐缓冲液)固定。染色和洗涤时使用含2％胎牛血清、0.1％叠氮化钠的PBS。结果如图8所示。图中是将淋巴细胞级分1×105用A24/Nef138-10四聚体和抗CD8抗体展开，图中的数字表示CD8阳性T淋巴细胞中四聚体阳性细胞的比例(％)。
产业适用性
根据本发明，在哺乳动物细胞中可以高效地表达表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体。所得的表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体对以下方面极为有用：抗原特异性CTL的检测和定量；使用表位结合型β2m纯化蛋白质将抗原呈递到抗原特异性CTL；和通过体内和回体导入病毒载体来诱导抗原特异性细胞免疫。通过本发明可以获得的表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体可以用于以下方面：与自身抗原或病毒抗原、肿瘤抗原等反应的CTL的检测和定量，对病毒或细菌等感染性疾病的防御免疫的诱导，以及对癌症的免疫疗法等。另外，本发明的载体可以在对感染性疾病的防御免疫的诱导和对癌症的免疫疗法等中用作基因治疗用载体。
序列表
<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)
<120>编码表位结合型β2m且感染哺乳动物细胞的病毒载体及其应用
<130>D3-A0101P
<140>
<141>
<150>JP 2001-301 290
<151>2001-09-28
<160>45
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>1
ctttcaccct 10
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>2
tttttcttac tacgg 15
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>3
cggccgcaga tcttcacg 18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>4
atgcatgccg gcagatga 18
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>5
gttgagtact gcaagagc 18
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>6
tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>7
atgcatgccg gcagatga 18
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>8
tgggtgaatg agagaatcag c 21
<210>9
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>9
gggcggatcc ggactcagaa tctccccaga cgccgag 37
<210>10
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>10
ccgcctcgag ctggggagga aacaggtcag catgggaac 39
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>11
ggcacgagcc gagatgtctc gctccgtggc 30
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>12
aatttggaat tcatccaatc caaatgcggc 30
<210>13
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>13
Gly Gly Gly Ser
1
<210>14
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>14
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210>15
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>15
ggaggtggcg ggtccggagg tggttctggt ggaggttcga tccagcgtac tccaaagatt 60
<210>16
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>16
tctggcctgg aggctagata tccactgacc tttggatggt gcttcggagg aggtggcggg 60
tcc 63
<210>17
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>17
tctggcctgg aggctagata cctaagggat caacagctcc tagggattgg aggtggcggg 60
tcc 63
<210>18
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>18
tgcggccgcc gtacggccga gatgtctcgc tccgtggcct tagctgtgct cgcgctactc 60
tctctttctg gcctggaggc t 81
<210>19
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>19
ttgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg ttacatgtct 60
cgatcccact t 71
<210>20
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>20
tgcggccgcc gtacggccga gatgtctcgc tccgtggcct ta 42
<210>21
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<220>
<221>CDS
<222>(21)..(80)
<400>21
gcggccgccg tacggccgag atg tct cgc tcc gtg gcc tta gct gtg ctc gcg 53
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala
1 5 10
cta ctc tct ctt tct ggc ctg gag gct 80
Leu Leu Ser Leu Ser Gly Leu Glu Ala
15 20
<210>22
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>22
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala
20
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(30)
<400>23
aga tat cca ctg acc ttt gga tgg tgc ttc 30
Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe
1 5 10
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>24
Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe
1 5 10
<210>25
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(33)
<400>25
aga tac cta agg gat caa cag ctc cta ggg att 33
Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile
1 5 10
<210>26
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<400>26
Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile
1 5 10
<210>27
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(60)
<400>27
gga ggt ggc ggg tcc gga ggt ggt tct ggt gga ggt tcg atc cag cgt 48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg
1 5 10 15
act cca aag att 60
Thr Pro Lys Ile
20
<210>28
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg
1 5 10 15
Thr Pro Lys Ile
20
<210>29
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1 8)
<400>29
aag tgg gat cga gac atg taacgtacgc cgtagtaaga aaaacttagg 48
Lys Trp Asp Arg Asp Met
1 5
gtgaaagttc atcgcggccg c 69
<210>30
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>30
Lys Trp Asp Arg Asp Met
1 5
<210>31
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>31
Leu Gly Gly Ile Phe Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Arg Asp
1 5 10
<210>32
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>32
tgcggccgcc gtacgaggat ggccgtcatg gcgccccg 38
<210>33
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>33
gtcccgcagc tccatcttca ttgcctcaaa gattcctcca agggatcccc atctcagggt 60
gaggggctt 69
<210>34
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>34
ctacggcgta cgtcaatggt ggtgatggtg gtggtcccgc agctccat 48
<210>35
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>35
ttgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg tca 53
<210>36
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<220>
<221>CDS
<222>(18)..(36)
<400>36
gcggccgccg tacgagg atg gcc gtc atg gcg ccc c 36
Met Ala Val Met Ala Pro
1 5
<210>37
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>37
Met Ala Val Met Ala Pro
1 5
<210>38
<211>138
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(87)
<400>38
aag ccc ctc acc ctg aga tgg gga tcc ctt gga gga atc ttt gag gca 48
Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Gly Ser Leu Gly Gly Ile Phe Glu Ala
1 5 10 15
atg aag atg gag ctg cgg gac cac cac cat cac cac cat tgacgtacgc 97
Met Lys Met Glu Leu Arg Asp His His His His His His
20 25
cgtagtaaga aaaacttagg gtgaaagttc atcgcggccg c 138
<210>39
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<400>39
Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Gly Ser Leu Gly Gly Ile Phe Glu Ala
1 5 10 15
Met Lys Met Glu Leu Arg Asp His His His His His His
20 25
<210>40
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>40
tgcggccgcc gtacgccgag gatggccgtc atggcgcccc g 41
<210>41
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>41
ttgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg tcacacttta 60
caagctgtga g 71
<210>42
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<220>
<221>CDS
<222>(21)..(38)
<400>42
gcggccgccg tacgccgagg atg gcc gtc atg gcg ccc 38
Met Ala Val Met Ala Pro
1 5
<210>43
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>43
Met Ala Val Met Ala Pro
1 5
<210>44
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1 8)
<400>44
ctc aca gct tgt aaa gtg tgacgtacgc cgtagtaaga aaaacttagg 48
Leu Thr Ala Cys Lys Val
1 5
gtgaaagttc atcgcggccg c 69
<210>45
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>45
Leu Thr Ala Cys Lys Val
1 5