骨质疏松症治疗剂及破骨细胞形成抑制剂 【技术领域】
本发明涉及对骨质疏松症的治疗有效的冬虫夏草，尤其涉及以培养的冬虫夏草的菌丝体为有效成分的骨质疏松症治疗剂及破骨细胞形成抑制剂。
背景技术
骨骼的作用是克服重力支撑身体，保持运动功能，同时，作为体内最大的钙储藏库维持钙的体内平衡。因为骨骼具有运动功能及钙的体内平衡维持功能，通常，其反复进行骨形成和骨吸收，维持现状并进行新的再生，反复进行重新构筑。
下面，通过骨形成和骨吸收反复进行骨骼的重新构筑的骨骼的生命周期进行说明。
骨骼的代谢过程是，软骨细胞、成骨细胞及破骨细胞三种细胞进行功能性的分工，并且这些细胞控制骨骼的代谢。骨骼的代谢主要可以分类为三个过程，所分类地三个过程是：(1)软骨内骨化引起的骨骼新生和成长；(2)由骨形成、骨吸收的周期构成的重塑引起的质、量的维持；对于骨折等损伤的骨骼再生。
上述主要的三个过程的骨骼的代谢是介由各种Ca代谢激素或者细胞因子及各个细胞内在的信息传递机制或者转录因子等，通过调节上述三种细胞系统的分化、功能及细胞间的相互作用来控制的。
例如，骨骼的吸收是，处于休止期的骨骼的表面受到激素或者细胞因子等刺激物质的刺激时，向破骨细胞传递信息从而开始的。另一方面，由破骨细胞吸收从而被破坏的骨骼通过成骨细胞被修复，并进行骨骼的形成。这样，破骨细胞和成骨细胞同时作用，进行骨骼的吸收及骨骼的形成，在处于正常状态的机体内，骨骼的吸收量和骨骼的形成量是同时进行的，通过机体内的调和使骨骼维持现状的同时进行新的再生。
伴随着近年来的高龄化社会，在壮年期以后的人们身上发现的骨质疏松症令人瞩目。骨质疏松症并不是骨骼本身的化学成分的变化引起的，而是一种伴随着骨量的异常减少，骨密度及骨强度降低从而产生骨折或者骨破坏的病症，骨质疏松症因为上述的骨骼的代谢平衡被破坏而发病。此外，尤其是，伴随着闭经的性激素的减少及年龄增加等引起的骨质疏松症发病的病例较多，因此，据信是因为性激素的减少等导致骨骼的代谢平衡被破坏从而发病。
作为防治骨质疏松症的治疗剂而研究了各种药剂。例如，雌激素对骨质疏松症具有治疗作用，因此，进行了维持对骨质疏松症的治疗作用同时减少了雌激素所具有的副作用的与雌激素的化学结构相似的类固醇系列激素及其衍生物物质的开发。但是，还没有进行实质性的研究。
另外还揭示，以类固醇系列激素作为化学结构一部分的双膦酸衍生物对骨骼疾病的治疗具有作用(参照专利文献1)。但是，没有列举双磷酸衍生物对骨骼疾病的治疗作用究竟有何种程度效果的具体实验数据。另外，还揭示了以美雄烷及环硫雄醇中至少一种作为有效成分的骨质疏松症治疗剂(参照专利文献2)。
并且，还揭示了含有并以活性型的维生素D类及其衍生物作为有效成分的药剂，对伴随着骨延长、骨折、骨缺损等骨骼组织的破坏的疾病的治疗或者防止再发等的更积极的治疗非常有用(参照专利文献3)。
另外，1α-羟基维生素Ds(1α-OH-Ds)、1α，24-二羟基维生素Ds、1α，25-二羟基维生素Ds等活性维生素D类，因其对调解骨吸收、骨形成等具有作用，因而被用作骨质疏松症治疗剂等的治疗剂。例如，揭示了通过同时使用活性型维生素D类和双膦酸类，使骨密度及骨强度提高，并且，保持平衡不使血中钙浓度上升的骨质疏松症治疗剂(参照专利文献4)。
专利文献1
特开平4-352795号公报
专利文献2
特开平7-215878号公报
专利文献3
特开平8-12580号公报
专利文献4
特开平11-60489号公报
但是，上述的骨质疏松症治疗剂，均为由化学物质构成的治疗剂，不能得到对骨质疏松症的充分的治疗效果。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种可以有效预防骨质疏松症的骨质疏松症治疗剂及破骨细胞形成抑制剂。
为达成上述目的，本发明的发明人经过各种研究，着眼于作为中药使用的冬虫夏草。冬虫夏草在全世界中已知的约有300种，寄生的宿主也多种多样。宿主主要是昆虫，但是，也有寄生在菌类上的情况，根据寄生的宿主的种类，繁殖的菌的种类也各不相同，极端的例子中，也有即使是同一种昆虫，成虫和幼虫也生长着不同的菌种的情况。
如上所述，多种类的冬虫夏草，其药理作用有强精健体及治疗贫血症等效果。另外，在近年来的研究中，还报告了各种对结核菌的抗菌作用及支气管扩张作用、肾上腺素作用的强化等。但是，认为冬虫夏草还具有未知的药理作用。因此，本发明的发明人发现另一种药理作用，通过服用一定量使用由独特的制造方法发酵培养的冬虫夏草的菌丝体、并且提取冬虫夏草的菌丝体从而以冬虫夏草菌丝体的粉末为有效成分的药剂，抑制了破骨细胞的形成。此外，抑制破骨细胞的形成并保持骨吸收和骨形成的代谢平衡，由此防止骨密度的减少，以冬虫夏草的菌丝体为有效成分的药剂对骨质疏松症的治疗有效，并根据此发现完成本发明。
即，本发明是以冬虫夏草或者其处理物为有效成分的骨质疏松症治疗剂。
另外，本发明是冬虫夏草或者其处理物为有效成分的破骨细胞形成抑制剂。
上述冬虫夏草优选的是使用培养的冬虫夏草的菌丝体，在将冬虫夏草溶解在水提取物中的情况下，水提取物的浓度优选的是30μg/ml以上的浓度。其原因是，水提取物的浓度不足30μg/ml时，对破骨细胞的抑制作用降低，不能有效地预防骨质疏松症。更好的浓度是30～3000μg/ml的范围，最好的浓度是300～3000μg/ml。
另外，在以本发明的冬虫夏草菌丝体作为骨质疏松症治疗剂及破骨细胞形成抑制剂等医药进行给药的情况下，优选的是，将在医药上可接受的无毒非活性载体中添加一定比例并调整的处理物向包括人在内的动物给药。作为载体，可以使用固态、半固态或者液态的稀释剂、填充剂及其他处方用助剂的一种以上。
另外，本发明的骨质疏松症治疗剂及破骨细胞形成抑制剂，可以进行静脉内给药、口服、组织内给药、点鼻及点眼等局部给药，或者经直肠进行给药，尤其，优选的是口服。
口服可以通过固态或者液态的用量单位，例如粉末剂、散剂、锭剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浊剂、液体剂、糖浆剂、滴(drop)剂、舌下锭剂或者其它剂型进行，尤其优选的是颗粒剂的粉末。
骨质疏松症治疗剂及破骨细胞形成抑制剂的用量优选的是，对应不同年龄和体重等的患者，另外，在考虑患者的状态和给药路径等的基础上进行设定，但是，通常，对成人而言，作为本发明的有效成分量，在口服的情况下，每人每天25～250mg/kg的范围内，更加优选的是在每人125～250mg/kg的范围内。并且，并不仅限于该范围，也可以超过该用量，另外，还可以分成每天两次到四次给药。
【附图说明】
图1是表示调整本发明的水提取物的顺序的图；
图2是表示本发明中摘除卵巢的组和施以假性手术的组的比较的图。
【具体实施方式】
下面，参照表1～表8及图1～图2对本发明的实施例进行详细说明。
首先，就被用作骨质疏松症治疗剂的本发明的冬虫夏草菌丝体的制造方法进行说明。然后，使用所制造的冬虫夏草菌丝体，并应用体外实验系统进行破骨细胞形成能的抑制的相关评估，在体内的实验系统中，使用DEXA(Dual energy X-ray absorptiometry)及pQCT(peripheral quantitative computed tomography)，对冬虫夏草菌丝体相对骨密度的活性进行评估。
冬虫夏草菌丝体的培养方法
本实施例中使用的冬虫夏草的菌丝体(Cordyceps SinensisMycellium)是通过斜面培养或者平板培养而成的。
首先，在300.0g马铃薯小块、20.0g葡萄糖及15.0g琼脂中加入1.0L蒸馏水，作为马铃薯糖培养基(PDA：Potate Dextrose Agar)。
斜面培养
将39g的PDA加入1L水中，并溶解PDA直到培养基在热水中完全溶解。然后，在尺寸为16×160mm的试管内，将培养基分成每份8ml加入后，在121℃的温度下灭菌20分钟。
用经过灭菌处理的刀切下约0.5平方菌种，使用接种针将菌种植入斜面培养基。然后，在28℃下进行培养。
平板培养
在39g的PDA加入1L水中，并分成5个培养瓶。然后，在121℃的温度下灭菌20分钟，并将约20ml培养基放入平板。
用经过灭菌处理的刀切下约0.5平方菌种，使用接种针将菌种植入平板培养基。然后，在28℃下进行培养。
对上述斜面培养或者平板培养而成的冬虫夏草菌丝体进行低温处理，将冬虫夏草菌丝体从培养基分离。将分离的冬虫夏草菌丝体干燥后粉碎，得到冬虫夏草菌丝体的粉末。
大量发酵培养
大量生产的方法是，首先保存或者筛选菌种，并进行三角瓶培养或者接种。然后，在第一次罐中发酵，并在第二次罐中发酵后，进一步在生产罐中大量生产。然后，分离菌丝和发酵液并干燥菌丝。然后，将干燥过的菌丝粉碎，并将其填充、封口、包装并储存，从而进行菌丝的大量发酵培养。生产罐中的大量生产的条件是，空气流速0.2～0.3(vvm)、温度范围25～28℃、发酵时间96～136小时、pH为5.5～6.0，然后，在转速150～180(rpm)、温度范围25～28℃、发酵时间8～10天、pH为5.5～6.0的条件下经过两个阶段进行大量生产。另外，发酵培养基可以使用水、食用淀粉、葡萄糖、动物及植物蛋白提取液。
冬虫夏草菌丝体水提取提取物的体外破骨细胞形成能实验
在体外实验系统中，使用骨髓细胞和成骨细胞样细胞的共培养法，进行破骨细胞形成能的实验。骨髓细胞和成骨细胞样细胞在活性维生素D的存在下共培养时，分化成具有酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP：tartrate resisted acidic phosphatase)的破骨样多核细胞(破骨细胞)，破骨样多核细胞(破骨细胞)经TRAP染色后显示阳性。由此，通过骨髓细胞和成骨细胞样细胞的共培养法进行培养，并计数破骨细胞，对破骨细胞形成能进行评估。
冬虫夏草菌丝体的水提取物的调制
图1时表示调整水提取物的顺序的图。如图1所示，首先，将80g通过上述制造方法得到的冬虫夏草菌丝体的粉末在1200ml乙醚中进行回流，并提取物。将其进行两次。接着，将残渣在1200ml甲醇中进行回流，同样调制水提取物。
共培养法
在24孔板中共培养成骨细胞和骨髓细胞。在共培养液中分别添加PTH(100ng/ml)、1α，25(OH)2VD3(10-8M)和被验物质(冬虫夏草菌丝体水提取物；3mg/ml，300μg/ml，Elcationin；2U/ml)，并作为样品1号～样品6号。分别使用4个孔进行培养，并且在6天中每2天更换培养液。
所形成的破骨细胞的鉴别
培养结束后，使用染色液将酒石酸抗性酸性磷酸酶阳性细胞染色为暗红色。染色后，计算3核以上的TRAP阳性破骨样多核细胞。在每个样品中计数破骨细胞后，求得4个样品中的破骨细胞数的平均数并以其作为破骨细胞数。
在1α，25(OH)2VD3的破骨细胞数为100％的情况下，以计算所形成的破骨细胞数时的比例为形成率，具体来说，通过下面的式1求得。其结果表示在表1中。而且，在显著差异检测中使用Student′s t-test进行统计学处理。
(式1)
形成率(％)＝样品的破骨细胞数/1α，25(OH)2VD3的破骨细胞数×100
表1试料号 给药剂破骨细胞数的平均 (n＝4)形成率 (％) T-test SD 种类 浓度实施例 1冬虫夏草菌丝体 3mg/ml 0.0 0.0 0.00 0.0 2冬虫夏草菌丝体 300μg/ml 509.0 62.1 0.00 30.9 3冬虫夏草菌丝体 30μg/ml 478.5 58.4 0.00 108.9 4冬虫夏草菌丝体 3μg/ml 792.8 96.8 0.59 37.3比较例 5 1α，25(OH)2VD3 10-8M 819.0 100.0 69.4 6 Elcatonin 2U/ml 113.0 13.8 0.00 15.7
如表1所示，本实验系统中，医药品中使用的Elcationin和无添加的对照组相比较示出有显著差异，由此证明其是合理的。另外，在添加了冬虫夏草菌丝体的水提取物的实施例中，在30μg/ml、300μg/ml、3mg/ml的各浓度中，破骨细胞的形成率分别为58.4％、62.1％、0.0％，判断可以显著地抑制破骨细胞的形成。另外，特别是在添加了浓度为3mg/ml的冬虫夏草菌丝体的实施例中，显示比作为医药品的Elcationin更强的活性。因此，在体外实验系统中，启示了本发明的冬虫夏草菌丝体水提取物具有抗骨质疏松症活性。
然后，就使用作为被检测体的大鼠的体内实验系统进行说明。
使用冬虫夏草菌丝体的体内双能X射线吸收法(Dual energy X-rayabsorptiometry，DEXA)的实验
做成摘除卵巢的骨质疏松症模型大鼠。并将其分为3组，以假性手术组为对照组，以摘除卵巢组为骨质疏松症模型组，以及向骨质疏松症模型进行被验物质给药组。通过测定各组中的各只大鼠的腰椎的总骨密度，就作为骨质疏松症的主要症状的骨密度减少，对骨密度进行直接比较研究。而且，总骨密度的测定中，使用医药领域中进行诊断所用的双能X射线吸收法(Dual energy X-ray absorptiometry，DEXA)。
使用双能X射线吸收法的骨密度的比较实验
1.将8个月龄的大鼠分为摘除卵巢组(OVX)、假性手术组(Sham)以及向摘除卵巢组进行冬虫夏草菌丝体给药组，在各组中分别使用7只大鼠。
2.通过向各组大鼠腹腔内注射戊巴比妥进行麻醉，并进行两侧卵巢摘除的手术。假性手术是通过戊巴比妥麻醉，并以镊子触动两侧的卵巢，进行假性手术。
3.将冬虫夏草菌丝体以10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的浓度通过插管口服。给药每2天一次，共进行5个星期。
4.5周后，再次用戊巴比妥麻醉大鼠。然后，使用双能X射线吸收法(Dual energy X-ray absorptiometry，DEXA)进行平均骨密度(BMD)的测定。
测定方法是，通过戊巴比妥麻醉大鼠，使大鼠趴着放在测定台上后，用small animal program(line specing和point resolution，0.5×0.5mm，scan speed，15mm/sec)扫描腰椎，测量第2腰椎到第4腰椎(lumbar spine(L2-L4))的平均骨密度。而且，作为统计处理，在显著差异检测中使用Student’s t-test进行计算。
5.骨密度测定后，使大鼠安乐死，摘除子宫并测定重量。
所得到的结果如图2及表2所示。
表2 Sham OVX 冬虫夏草菌丝体 100 50 10 初期体重 296±4 298±5 298±3 298±5 293±6 最终体重 302±4 334±6 340±7 331±10 329±6卵巢重量(mg)/100gb.w. 306±53 46±3 51±3 49±3 48±3
##p＜0.01(相对于Sham)
如图2及表2所示，摘除卵巢组和施以假性手术组的体重可以看到显著差异，在子宫重量中也可以看出显著差异。因此可以确认该样品的合理性。
如图2所示，认为口服了冬虫夏草菌丝体的组和摘除卵巢组具有显著差异。另外，如表2所示，虽然没有显示依赖于浓度的效果，但是，对体重和子宫重量并没有影响，可以抑制腰椎的骨密度的减少。从而，认为在体内实验系统中也具有抗骨质疏松症活性。
使用冬虫夏草菌丝体的体内pQCT(peripheral quantitativecomputed tomography)骨密度比较实验
和上述使用双能X射线吸收法(DEXA)的实验相同，做成卵巢摘除的模型大鼠，并分别进行被验物质的给药。
就各模型大鼠的胫骨，测量被区分为皮层骨、海绵骨的骨密度，并分别进行比较研究。另外，求得影响骨骼动态的骨外膜长、骨内膜长、骨强度指标的SSI，从而进行抗骨质疏松症活性的评估。而且，作为骨密度测定装置，使用的是比医疗领域中诊断骨质疏松症所用的DEXA精度更高的pQCT(peripheral quantitative computedtomography)。下面说明其方法。
1.买入6个月龄的Wistar雌大鼠之后，使其适应饲养一周。
2.一周之后，将大鼠分为摘除卵巢组和假性手术组，分别施以卵巢摘除手术和假性手术。而且，各组中各使用7只大鼠。
3.手术一周后，每周3次口服100mg/kg冬虫夏草菌丝体粉末的悬浊液。
4.一个月后，用50mg/kg戊巴比妥麻醉并用pQCT测定骨骼动态的数据。
5.测定结束后，测定体重。用戊巴比妥使大鼠安乐死，提取血液。将提取的血液离心分离，提取血清并在-80℃下保存。
6.血液提取后摘除子宫并进行测量。
7.分析所得的数据并进行统计处理。
所得结果分别表示在表3～表8中。表3表示体重及子宫重量，表4表示总骨量、总骨密度及剖面积，表5表示海绵骨量及海绵骨密度，表6表示骨外膜长及骨内膜长，表7表示大鼠贴近颈骨的皮层骨量、皮层骨密度及皮层骨厚度，表8表示骨强度的指标。
表3 组 体重(g) 子宫重量(g) 对照 326.8±17.5 0.16±0.03 Sham 307.5±25.0 0.48±0.06 T-100 305.0±12.6 0.15±0.03
对照；卵巢摘除组，Sham；假性手术组
T-100；冬虫夏草菌丝体粉末悬浊液100mg/kg(1％CMC)
表4 组 n 总骨量(mg/mm)总骨密度(mg/cm3) 剖面积(mm2) 对照 8 8.63±0.60# 672.65±13.81# 13.70±1.22 Sham 4 9.93±1.06 753.22±32.26 13.16±0.91 T-100 7 8.36±0.61 681.04±47.08 12.30±1.21
#p＜0.01(相对于Sham) *p＜0.01(相对于对照)
表5 组 海绵骨量(mg/mm)海绵骨密度(mg/cm3) 对照 0.85±0.16 170.5±27.8## Sham 0.84±0.15 244.5±40.0 T-100 0.98±0.21 210.3±23.6*
##p＜0.01(相对于Sham) *p＜0.05(相对于对照)
表6 组 骨外膜长(mm) 骨内膜长(mm) 对照 12.53±0.51 9.28±0.54 Sham 12.85±0.45 9.17±0.24 T-100 12.42±0.63 9.25±0.65
#p＜0.05(相对于Sham) *p＜0.05(相对于对照)
表7 组皮层骨量(mg/mm)皮层骨密度(mg/cm3)皮层骨的厚度(mm) 对照 6.62±0.37# 1173.87±18.27 0.52±0.02# Sham 7.50±0.67 1161.16±18.20 0.59±0.04 T-100 6.27±0.40 1146.62±23.90 0.50±0.01
#p＜0.05(相对于Sham) *p＜0.05(相对于对照)
表8 组 XSSI YSSI PSSI 对照 3.43±0.76# 4.51±1.31 7.31±2.03 Sham 5.61±1.81 5.64±1.01 9.75±1.23 T-100 2.83±0.41 3.21±1.74 5.35±2.65
#p＜0.05(相对于Sham) *p＜0.05(相对于对照)
研究使用卵巢摘除标本大鼠的冬虫夏草菌丝体的粉末的抗骨质疏松症活性的结果是，如表3所示，在卵巢摘除组(对照)和假性手术组(Sham)中，各组的体重、子宫重量具有显著差异，因此，认为可以做成模型。另外，如表4所示，大鼠贴近胫骨的总骨量、总骨密度在对照和冬虫夏草菌丝体给药组(T-100)中没有见到显著差异。但是，看到总骨密度有增加的趋势。
另外，关于表6所示的骨外膜长、骨内膜长，表7所示的皮层骨量、皮层骨密度、皮层骨厚度及表8所示的骨强度的指标，均没有看到显著差异。
并且，如表5所示，看到对作为骨质疏松症的主要症状的海绵骨密度的降低的显著差异。由此，认为冬虫夏草菌丝体的粉末具有抗骨质疏松症活性，尽管不是很强。
根据上述实验结果研究冬虫夏草菌丝体的抗骨质疏松症活性的结果是，通过表示体外破骨细胞形成抑制启示了妨碍骨骼代谢中的骨吸收(骨骼的溶解)。另外，在使用pQCT的实验中，因为抑制了作为骨质疏松症的症状的海绵骨密度的减少，推测对骨质疏松症活性有效。另外，体内实验系统中使用DEXA、pQCT的骨密度的比较实验也判明了显著差异。从而，根据体内和体外实验结果，认为冬虫夏草菌丝体具有抗骨质疏松症活性。
发明的效果
如以上所说明的，通过含有本发明的冬虫夏草，特别是培养的冬虫夏草的菌丝体的药剂的给药，会抑制破骨细胞的形成，其结果是，可以防止骨密度的减少，并预防骨质疏松症的发病。