一种滇重楼种子的催芽方法 【技术领域】
本发明涉及种子催芽的方法，特别是涉及滇重楼催芽种子方法。
背景技术
滇重楼隶属于延龄科Trilliaceae重楼属Paris植物，主要分布在我国的西南地区。滇重楼因云南分布最广，药用价值最高，被1995年版和2000年版中国药典收载，学名为Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand-Mazz。祖国医学认为本品味苦，性微寒，有小毒，归肝经。具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊等功效。常用于疔痈红肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等症，是著名中成药云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁等成药的主要组成药物。近年来药理研究表明该植物具有止血、抗肿瘤、抗生育、免疫调节、抗心肌缺血等多方面的生理活性。因此，充分开发和利用这一自然资源有着十分重要的意义。
种子休眠是指具有活力的种子处在适宜的萌发条件下而不能正常萌发。是植物发育过程中一个暂停现象，或者称为“生命的隐蔽”现象，对植物本身来说，既是一个很重要的生命活动过程，又是一种有益的生物学特性，是植物经过长期演化而获得的一种对环境条件及季节性变化的生物学适应性。
种子休眠是植物长期适应气候变化的结果，可以避免在不适当的季节中萌发，以“休眠种子”这一形式躲过严寒、酷暑、干旱等恶劣环境条件，对维持植物的生命，繁衍后代有深远的意义。种子休眠也会给引种栽培造成一定的困难，有休眠的种子需要采取一些措施解除休眠，这就为适时播种带来一些额外的工作。很多中药种子休眠期长达0.5-2年，有的野生性状重的中药种子休眠期长短不一，发芽极不整齐，这就给引种栽培造成一定困难。
滇重楼种子在自然条件下，需要两冬一夏才能萌发，15个月的发苗率仅为46.2％，大量种子在漫长的休眠期间丧失了生命力。滇重楼种子深度休眠极大地限制了实生繁殖，制约了滇重楼的种植业发展。
【发明内容】
本发明的目的是针对滇重楼种子具有休眠特性，提供一种可以使滇重楼种子具有高出苗率的催芽的方法。
本发明的目的通过下述方案予以实现：
一种滇重楼种子催芽方法，包括如下步骤：
步骤1：用含水量60-80％的湿沙与滇重楼种子以2-4∶1比例混合，8-15℃放置25-35天；
步骤2：取出种子用50-200mg/L的GA3(赤霉素)溶液浸种1.5-2.5小时；
步骤3：再用含水量60-80％的湿沙与种子以2-4∶1比例混合，放置18-25℃条件下，保持湿沙水份55-70天；
步骤4：取出种子再用浓度2.5-30mg/L的IAA(生长素)溶液浸种1.5-3小时；
步骤5：用含水量60-80％的湿沙与种子以2-4∶1比例混合，再置于20-22℃植物生长箱，保持湿沙水份。
本发明所述的一种滇重楼种子催芽方法优选如下步骤：
步骤1：用含水量70％的湿沙与种子3∶1混合，放置10℃冰箱中1个月；
步骤2：取出种子用清水冲洗干净，用100mg/L的GA3(赤霉素)溶液浸种2小时；
步骤3：再用含水量70％的湿沙与种子3∶1混合，放置20-22℃条件下，保持湿沙水份2个月；
步骤4：取出种子用清水冲洗干净，再用浓度25mg/L的IAA(生长素)溶液浸种2小时；
步骤5：用含水量70％的湿沙与种子3∶1混合，再置于20-22℃植物生长箱，保持湿沙水份。
所述滇重楼种子优选为成熟的鲜种，后熟3-5天。
所述湿沙优选消毒后的湿沙。
滇重楼种子自然萌发，需15个月才能出苗，且出苗率仅为46.2％，出苗时间不一，整齐度低，等不足之处，本发明的方法可以使滇重楼种子提前萌发，出苗率高。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限制本发明。
实验例1 激素调控对种子萌发的影响
1、实验目的：观察本发明滇重楼在不同激素种类及浓度下萌发率的变化。筛选合适激素种类及浓度
2、材料与方法
种子：2004年10月采收的滇重楼的成熟种子。
试验用种是采收的新鲜种子。阴凉处放置5天，清水浸泡2小时，去掉种皮，洗净。选取100粒成熟饱满种子若干组，用不同种类激素浸泡2小时，然后以1∶3的洗净细沙层积于种子培养皿中，层积沙含水量为70％。层积温度和时间：0-30天，10±1℃；30-150天，放置20±1℃植物生长箱中。150天时计算萌发率。
3结果
表1
表2
由种子萌发率可筛选出浸种合适浓度，100mg/L的GA3浓度及25mg/L、2.5mg/L的IAA浓度可以促进种子萌发。
实验例2激素调控对滇重楼种胚休眠和发育过程中胚率及内源激素变化的研究
1 实验目的：
观察本发明滇重楼种胚休眠和发育过程中种子胚率及内源激素的动态变化。
2 材料与方法
2.1 材料
种子：2004年10月采收的滇重楼的成熟种子。
试剂盒：采用酶联免疫分析方法(ELISA)，试剂盒购自中国农业大学，按试剂盒说明测定样品中GA3、IAA的含量。
仪器：芬兰雷勃Multiskan MK3全自动多工功能酶标仪；美国贝克曼AllegraTM 25R centrifuge冷冻离心机；瑞士PT1600E匀浆机；瑞士梅特勒AX205天平。
2.2 方法
2.2.1 处理方法：
试验用种是采收的新鲜种子。阴凉处放置5天，清水浸泡2小时，去掉种皮，洗净，阴干种子表皮的水后以1∶3的洗净细沙层积于种子培养皿中，层积沙含水量为70％。层积温度和时间：0-30天，10±1℃；取出种子，去沙洗净，用100mg/L的GA3浸种2小时轩，放置20±1℃植物生长箱中30-90天；取出种子，去沙洗净，用浓度25mg/L的IAA浸种2小时，放置20±1℃植物生长箱中90-150天。测试时间为层积后0、30、60、90、120、150天。在各时间点取样，样品经液氮冷冻后贮藏于低温冰箱中(-70℃)保存，以备测试。
2.2.2 胚率的测定：在不同的层积时间点，每次取30粒种子，沿种胚中央将胚乳切成两半。在双目解剖镜下用测微尺测量胚与胚乳的长度(mm)。
计算胚率：胚率＝胚长/胚乳长，求每个时间点的平均胚率。
2.2.3 梗死区心肌染色从心尖向心底方向将心脏均匀切为8片，将其置于0.1％的NBT溶液中，37℃气浴摇床摇动10min，用吸水纸吸干表面水分，按顺序摆放，拍照；分别切取梗死区与非梗死区并称量，计算心梗指数。心梗指数＝梗死区湿质量/全心湿质量。
2.2.3 内源激素GA3、IAA的提取和测定
激素的提取：精密称取各时间点的样品1.0g于研钵中，加4ml样品提取液，在冰浴中研磨成匀浆，4℃下提取4h，1000g离心15min。上清液过C18胶柱，步骤为：80％甲醇平衡胶柱上样，收集样品，移开样品后用100％甲醇洗柱100％乙醚洗柱100％甲醇洗柱循环。将过柱后样品用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容至1ml。
激素的测定：采用酶联免疫分析方法(ELISA)，试剂盒购自中国农业大学，按试剂盒说明测定样品中GA3、IAA的含量。
2.2.4统计处理所有数据用平均数表示。
3数据分析 结果显示，外源激素的调控可促进滇重楼种胚的发育，同时外源激素的调控可促使滇重楼种子内源激素的提高，从而促进滇重楼种胚的发育，使滇重楼的发芽时间提前。
表3 胚率结果
表4 内源激素变化结果
实验例3 滇重楼种子催芽方法的筛选和优化
1变温层积上限温度的确定
变温层积是缩短种子后熟进程，提高种子萌发率的常用方法。确定变温层积的上下限温度是变温层积技术中的关键。变温上限温度的确定一方面要促进种胚的发育；另外，也要防止过高的变温层积温度对种子萌发抑制。
1.1方法
新鲜滇重楼种子，去外种皮，洗净，每份100粒，三次重复，放入湿沙中，置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃植物生长箱。以平均胚根长度为指标。实验时间90天。
1.2结果
表5
由上表可知，温度显著地影响着滇重楼种子的种胚发育。通过观察90d后不同温度处理下的平均胚根长度的变化，可知滇重楼胚根发育随处理温度的升高而呈现出先升高后降低的单峰曲线的趋势。20℃处理下，滇重楼胚根生长最长，发育程度最高；5℃和10℃处理下，滇重楼种胚发育缓慢，胚根生长缓慢而很难突破种子；高温处理(25℃及30℃)下滇重楼种子虽仍能进行种胚发育，但与20℃相比，高温抑制了种胚发育，笔者认为高温一方面提高了种子糖与脂肪的代谢水平促进了种子营养物质的调配，另一方面高温也提高了代谢酶的水平，种子营养衰竭，种胚发育反遭抑制。
2植物激素种类与浓度的确定
植物激素是打破种子休眠，促进种子萌发的重要物质，选择合适激素类型与浓度，结合变温层积技术可有效提高种子萌发，缩短种子萌发的后熟期。本研究选用不同种类的植物激素，观察不同浓度下各类激素对种胚发育(此处以胚根长为统计指标)影响，以选用合适的激素类型及浓度。
2.1植物激素的选用试验
GA3浸种浓度分别为50、100、200、500mg/L；IAA浸种浓度分别为0.25、2.5、25、250mg/L；KT浸种浓度分别为25、50、100、200mg/L。浸种时间24h，置于20℃植物生长箱，实验时间90天。以平均胚根长度为指标。
2.2结果
表6
表7
不同种类的激素对滇重楼种胚发育作用不同。GA3浸种浓度影响着滇重楼种胚发育，如上图所示，滇重楼胚根长度随着GA3浸种浓度的升高显现先升高后降低的趋势，由此表明在滇重楼的种胚发育过程中，合适浓度的GA3(100mg/L)表现出较为显著的促进作用。生长素IAA对滇重楼的种胚发育的影响与赤霉素类同，表现为滇重楼胚根长度随着IAA浸种浓度的升高而显现先升高后降低的趋势；与对照相比，较低浓度的IAA促进了胚根的生长(图中数据未显示)，较高浓度的IAA抑制了胚根的生长，即IAA表现为低浓度与高浓度有所不同的双重效应，试验结果显示25mg/LIAA胚根长度较长，种胚发育最好。本研究亦发现细胞分裂素类激素KT对滇重楼的种胚发育的影响不如对照，高低浓度KT浸种的胚根长度均不如对照。因此，在促进滇重楼种子萌发过程中，应注意选用100mg/L的GA3以及25mg/L的IAA。
3变温温度、GA3浓度及IAA浓度三因素正交试验
根据上述实验结果，温度、GA3和IAA对滇重楼种子萌发促进作用较大，本研究选取合适的变温温度、GA3浓度及IAA浓度组合为最佳催芽方案，并通过正交实验对此进行检验。
表8温度、GA3浓度及IAA浓度三因素正交试验结果
上表为温度、GA3浓度及IAA浓度三因素对滇重楼种子萌发影响的正交试验结果表。由上表可知，温度、GA3浓度及IAA浓度均显著影响着滇重楼种子胚根的生长。通过计算并比较不同因素的极差，可知在温度因素的3个水平中，以20℃所对应的极差最大，因此确定20℃为滇重楼胚根生长最大效应温度。通过检验不同GA3浓度和不同IAA浓度的极差，可知200mg/LGA3与25mg/L IAA促进了滇重楼胚根的生长。由此可知，最好的方案为20℃下200mg/L GA3与25mg/L IAA混合处理。在本研究中，处理7即为优选方案，处理7的胚根生长长度最长，由此表明，最优方案符合实际，经得过检验。
下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果
【具体实施方式】
实施例1：
步骤1：取滇重楼成熟的鲜种，放置阴凉处后熟，或用三份湿沙和一份种子混合，后熟3-5天，除去果皮，清水洗净。用含水量70％的湿沙与种子3∶1混合，放置10℃冰箱中1个月；
步骤2：取出种子用清水冲洗干净，用100mg/L的GA3(赤霉素)溶液浸种2小时；
步骤3：再用含水量70％的湿沙与种子3∶1混合，放置20-22℃条件下，保持湿沙水份2个月；
步骤4：取出种子用清水冲洗干净，再用浓度25mg/L的IAA(生长素)溶液浸种2小时；
步骤5：用含水量70％的湿沙与种子3∶1混合，再置于20-22℃植物生长箱，保持湿沙水份至出苗。
实施例2：
步骤1：取滇重楼成熟的鲜种，放置阴凉处后熟，或用三份湿沙和一份种子混合，后熟5天，除去果皮，清水洗净，用含水量65％的湿沙与种子2.5∶1混合，放置11℃冰箱中28天；
步骤2：取出种子用清水冲洗干净，用200mg/L的GA3(赤霉素)溶液浸种2小时；
步骤3：再用含水量70％的湿沙与种子3∶1混合，放置20℃条件下，保持湿沙水份58天；
步骤4：取出种子用清水冲洗干净，再用浓度25mg/L的IAA(生长素)溶液浸种2.5小时；
步骤5：用含水量70％的湿沙与种子2.5∶1混合，再置于20℃植物生长箱，保持湿沙水份至出苗。