具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置.pdf

本发明适用于细胞等样品三维成像，提供了一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置。所述方法包括以下步骤：产生激发光和熄灭光；分光，将所述激发光分成第一激发光和第二激发光，将所述熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；调整所述第一激发光与第二激发光之间的相位差和强度比，调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差和强度比，使所述第一激发光与第二激发光和所述第一熄灭光与第二熄灭光在样品轴向的一个薄层或几个薄层处相干形成轴向调制照明实现轴向选择性激发。所述轴向选择性激发使大部分处于荧光态的荧光标记物集中分布在轴向几个或一个薄层内，大大抑制了厚样品成像时的背景噪声，提高了图像信息获取速率。

权利要求书
1.  一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
产生激发光和熄灭光，所述激发光和熄灭光分别由激发光源和熄灭光源产生；
分光，将所述激发光分成第一激发光和第二激发光，将所述熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；
调整所述第一激发光与第二激发光之间的相位差和强度比，使所述第一激发光和第二激发光经相对放置的第一物镜和第二物镜后相干形成激发光轴向调制照明作用于样品，所述样品内均匀分布有荧光标记物，其中所述第一激发光与第二激发光之间的相位差为(2n+2)π，其中n为非负整数；
调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差和强度比，使所述第一熄灭光和第二熄灭光经所述第一物镜和第二物镜后相干形成熄灭光轴向调制照明作用于所述样品，其中所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差为(2n+1)π±δ，其中n为非负整数，δ为所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差允许的误差值；
探测荧光，由探测器探测所述荧光标记物发出的荧光；
质心定位，根据探测到的荧光确定所述荧光标记物的二维位置；
轴向扫描，轴向移动所述样品，或调整所述第一激发光与第二激发光之间的强度比和所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的强度比，使所述第一激发光与第二激发光和所述第一熄灭光与第二熄灭光在所述样品的轴向不同位置实现所述轴向调制照明，探测所述荧光标记物发出的荧光，从而确定所述荧光标记物的轴向位置；
三维重构，结合所述荧光标记物的二维位置及轴向位置，获取所述样品的三维纳米分辨图像。

2.  根据权利要求1所述的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述荧光标记物为具有开关效应的荧光蛋白分子、荧光染料分子或荧光量子点。

3.  根据权利要求1所述的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述熄灭光为使所述荧光标记物从荧光态转化为非荧光态所需的光源；所述激发光为使所述荧光标记物从非荧光态转化为荧光态所需的光源。

4.  根据权利要求1或3所述的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述激发光和熄灭光均为空间非相干光。

5.  根据权利要求1所述的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述激发光轴向调制照明的调制度由所述第一激发光与第二激发光之间强度比控制；所述熄灭光轴向调制照明的调制度由所述第一熄灭光与第二熄灭光之间强度比控制。

6.  根据权利要求1所述的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述误差值δ在0～0.4π范围内取值。

7.  根据权利要求4所述的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述激发光与熄灭光之间的强度比为1/50～1/5000。

8.  根据权利要求1所述的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述第一激发光聚焦于所述第一物镜的后焦面，所述第二激发光聚焦于所述第二物镜的后焦面；所述第一熄灭光聚焦于所述第一物镜的后焦面，所述第二熄灭光聚焦于所述第二物镜的后焦面。

9.  一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像装置，包括：
激发光源，用于产生激发光；
熄灭光源，用于产生熄灭光；
激发光分光器件，用于将所述激发光源发出的激发光分成第一激发光和第二激发光；
熄灭光分光器件，用于将所述熄灭光源发出的熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；
激发光光程调整装置，用于调整所述第一激发光与第二激发光之间的光程差；
激发光光强调整装置，用于调整所述第一激发光与第二激发光之间的强度比；
熄灭光光程调整装置，用于调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的光程差；
熄灭光光强调整装置，用于调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的强度比；
第一物镜和第二物镜，使所述第一激发光与第二激发光相对照射并相干，同时使所述第一熄灭光与第二熄灭光相对照射并相干；
微调样品台，用于放置和调整具有荧光标记物的样品的位置，所述荧光标记物为具有开关效应的荧光分子或荧光分子团；
探测器，用于探测所述荧光标记物产生的荧光；
多个镜片，用于调整光路及导出所述荧光。

10.  如权利要求9所述的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像装置，其特征在于，所述多个镜片包括第一双色镜、第二双色镜、第三双色镜、第四双色镜、第一管镜和第二管镜；所述第一激发光经由激发光光程调整装置、第一双色镜、第一管镜和第二双色镜传输至第一物镜的后焦面形成空间非相干面光源，再经所述第一物镜形成宽场照明；所述第二激发光经由激发光光强调整装置、第三双色镜、第二管镜和第四双色镜传输至第二物镜的后焦面形成空间非相干面光源，再经所述第二物镜形成宽场照明；所述第一熄灭光经由熄灭光光强调整装置、第一双色镜、第一管镜和第二双色镜传输至第一物镜的后焦面形成空间非相干面光源，再经所述第一物镜形成宽场照明；第二熄灭光经由熄灭光光程调整装置、第三双色镜、第二管镜和第四双色镜传输至第二物镜的后焦面形成空间非相干面光源，再经所述第二物镜形成宽场照明。

说明书具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置
技术领域
本发明属于光学显微成像技术，尤其涉及一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置。
背景技术
众所周知，纳米分辨荧光成像可以以纳米的空间分辨率直观地显示被标记分子在被标记物内的空间分布，并能用来研究被标记分子之间的相互作用过程，尤其可用来研究细胞内DNA、RNA与蛋白质分子之间的相互作用和运动规律，是将细胞作为“试管”在位研究主要生物大分子相互作用规律的重要工具。近年来出现了一类利用荧光标记物本身的开关效应的荧光标记物定位显微技术，通过时分复用、质心定位以及图像复合来进行纳米分辨成像，例如光敏定位显微(PALM)，随机光学重建显微(STORM)等等。它们在每个时刻获取稀疏分布的荧光标记物的定位信息，然后将不同时刻获得的定位信息叠加，最终实现高横向纳米分辨，如果结合轴向分辨辅助元件或方法，例如在探测光路引入柱面镜，或利用荧光自干涉，或多焦面探测(MUM、dMUM)，还可以实现轴向的纳米分辨。
然而，如果将这类分子定位显微直接用于厚达一二十微米甚至更厚的细胞成像，来自非焦平面荧光分子产生的荧光信号将直接影响焦平面荧光分子的质心定位精度，从而降低横向空间分辨率。正因为如此，目前这些方法大都以结合全内反射荧光显微(TIRF)的方式实现，通过TIRF只激发表面的荧光分子，从而有效遏制了非焦平面的荧光信号。但TIRF同时也带来一定的局限性，即这种成像方式只局限于细胞膜表面100nm左右范围内的成像，应用范围受到很大限制。因此，对具有一定厚度的样品，例如细胞进行三维纳米分辨成像时，通常的做法是将开关分子的稀疏程度降到很低的水平，单纯依靠轴向分辨以及轴向扫描手段实现三维纳米分辨成像。但是，考虑到不同深度荧光开关分子信号的叠加对定位精度会产生影响，这种成像方式对荧光态分子稀疏程度的要求大大增加；而且，非探测区域内荧光分子的无效激发也使得这些分子面临过早被漂白的危险；同时，由于不同深度被激发而发的荧光相互叠加，常常不得不抛弃一些发光点，从而进一步降低了图像信息的获取速率，使获得完整三维图像的时间过长。单分子定位显微需要结合一些辅助手段实现三维纳米成像。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种高效的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置，旨在解决现有分子定位显微成像效率低的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
产生激发光和熄灭光，所述激发光和熄灭光分别由激发光源和熄灭光源产生；
分光，将所述激发光分成第一激发光和第二激发光，将所述熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；
调整所述第一激发光与第二激发光之间的相位差和强度比，使所述第一激发光和第二激发光经相对放置的第一物镜和第二物镜后相干形成激发光轴向调制照明作用于样品，所述样品内均匀分布有荧光标记物，其中所述第一激发光与第二激发光之间的相位差为(2n+2)π，其中n为非负整数；
调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差和强度比，使所述第一熄灭光和第二熄灭光经所述第一物镜和第二物镜后相干形成熄灭光轴向调制照明作用于所述样品，其中所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差为(2n+1)π±δ，其中n为非负整数，δ为所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差允许的误差值；
探测荧光，由探测器探测所述荧光标记物发出的荧光；
质心定位，根据探测到的荧光确定所述荧光标记物的二维位置；
轴向扫描，轴向移动所述样品，或调整所述第一激发光与第二激发光之间的强度比和所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的强度比，使所述第一激发光与第二激发光和所述第一熄灭光与第二熄灭光在所述样品的轴向不同位置实现所述轴向调制照明，探测所述荧光标记物发出的荧光，从而确定所述荧光标记物的轴向位置；
三维重构，结合所述荧光标记物的二维位置及轴向位置，获取所述样品的三维纳米分辨图像。
本发明实施例的另一目的是这样实现的，一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像装置，包括：激发光源，用于产生激发光；熄灭光源，用于产生熄灭光；激发光分光器件，用于将所述激发光源发出的激发光分成第一激发光和第二激发光；熄灭光分光器件，用于将所述熄灭光源发出的熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；激发光光程调整装置，用于调整所述第一激发光与第二激发光之间的光程差；激发光光强调整装置，用于调整所述第一激发光与第二激发光之间的强度比；熄灭光光程调整装置，用于调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的光程差；熄灭光光强调整装置，用于调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的强度比；第一物镜和第二物镜，使所述第一激发光与第二激发光相对照射并相干，同时使所述第一熄灭光与第二熄灭光相对照射并相干；微调样品台，用于放置和调整具有荧光标记物的样品的位置，所述荧光标记物为具有开关效应的荧光分子或荧光分子团；探测器，用于探测所述荧光标记物产生的荧光；多个镜片，用于调整光路及导出所述荧光。
本发明实施例中所述激发光源和熄灭光源发出的光分光后经过光强及光程调整装置调整形成轴向调制照明作用于样品，所述样品内的荧光标记物发出荧光，所述轴向调制照明使处于样品轴向中心位置的荧光标记物处于荧光态的概率最大，远离样品轴向中心位置的荧光标记物处于荧光态的概率大大降低，实现了细胞等厚样品内荧光标记物的轴向选择性激发，避免了荧光标记物定位显微用于细胞等厚样品成像时，不同层中处于荧光态的荧光标记物的相互串扰，降低了单次成像中无效成像的荧光标记物数量，提高成像效率，同时避免处于非探测层的荧光标记物的无效激发次数以及可能的光漂白。
附图说明
图1是本发明实施例提供的荧光三维纳米分辨成像装置的结构示意图；
图2是本发明实施例提供的荧光三维纳米分辨成像装置的结构示意图(光源部分细化)；
图3是本发明实施例中光程调整装置另一种结构示意图；
图4是本发明实施例第一层次的轴向选择性激发中激发光和熄灭光形成的驻波沿样品轴向的强度分布图；
图5是本发明实施例第一层次的轴向选择性激发中荧光标记物处于荧光态的概率沿样品轴向分布的曲线图；
图6是本发明实施例更高层次的轴向选择性激发中激发光和熄灭光形成的驻波沿样品轴向的强度分布图；
图7是本发明实施例更高层次的轴向选择性激发中荧光标记物处于荧光态的概率沿样品轴向分布的曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1和图2所示，本发明实施例提供的荧光三维纳米分辨成像装置包括光源、分光器、光强及光程调整装置、微调样品台和探测器以及若干镜片，样品内均匀分布有荧光标记物。所述光源由激发光源38和熄灭光源39组成，与此相对应地，所述分光器具有激发光分光器7和熄灭光分光器20，所述光强及光程调整装置具有激发光光强及光程调整装置和熄灭光光强及光程调整装置。所述微调样品台15为压电陶瓷样品台。激发光和熄灭光的波长均取决于所采用的荧光标记物的激发谱。一般来说，激发光波长在激发谱中激发较弱的谱段选取；而熄灭光波长在激发谱中激发较强的谱段选取。本实施例以Cy5作为荧光标记物，与此相适应，所述激发光源38系产生中心波长为514nm，带宽为10nm激发光的光源，此波长的光经本成像装置传输后可使荧光标记物处于荧光状态；所述熄灭光源39系产生中心波长为647nm，带宽为10nm熄灭光的光源，此波长的光经本成像装置传输后可使荧光标记物处于非荧光状态。为易于分析所述荧光标记物的开关特性，所述激发光和熄灭光优选单色性好的激光。为将原来为相干光的激发光和熄灭光转化为成像装置所需的非相干光，所述激发光和熄灭光的传输光路上设散射片2，所述散射片2由电机3驱动高速旋转。为将所述激发光扩大到成像装置所需的大小，所述激发光的传输光路上设准直扩束装置4，所述激发光经此装置后，被准直扩束成一束平行光。为排除带宽之外杂光的影响，所述激发光的传输光路上设第一窄带滤光片5。经所述第一窄带滤光片5过滤的激发光的传输光路上设方位角偏振片6，所述激发光变成方位角偏振光，这样的激发光就适用于调制照明沿轴向的强度分布公式。所述激发光分光器7将具有方位角偏振特性的激发光分成第一激发光和第二激发光，所述激发光分光器7为50/50分光棱镜。本实施例中所述第一激发光经由激发光光程调整装置、第一双色镜11、第一管镜12、第二双色镜13和第一物镜14照射至样品，所述激发光光程调整装置由调整架10和设于所述调整架10的角锥棱镜9构成，所述调整架10优选高精度一维调整架，所述角锥棱镜9(图3a)可由相互垂直的反射镜片40、41(图3b)代替，这样就可以调整所述第一激发光与第二激发光之间的光程差。所述第一双色镜11对波长为514±10nm的激发光反射；所述第一管镜12为成像透镜；所述第一物镜14为复消色差物镜，其放大倍率为100X，数值孔径N.A为1.4。所述第一激发光经所述角锥棱镜9出射后由所述第一双色镜11反射进入所述第一管镜12，从所述第一管镜12出射后由所述第二双色镜13反射进入所述第一物镜14，从所述第一物镜14出射后照射至设于所述微调样品台15上的样品，所述微调样品台15由微调装置驱动，其轴向定位精度为39nm。这样就可以对样品中不同深度的荧光标记物的状态进行轴向扫描。本实施例中所述第二激发光经由激发光光强调整装置、第三双色镜25、第二管镜26、第四双色镜27和第二物镜28照射至样品。所述激发光光强调整装置为一个可调中性滤光片31，这样就可以调整所述第一激发光与第二激发光之间的强度比。所述第二激发光从所述激发光光强调整装置出射后，经所述第三双色镜25反射进入所述第二管镜26，从所述第二管镜26出射后由所述第四双色镜27反射进入所述第二物镜28，从所述第二物镜28出射后照射至设于所述微调样品台15上的样品。所述第二管镜26亦为成像透镜，所述第二物镜28为复消色差物镜，其放大倍率为100X，数值孔径N.A为1.4。
本实施例中所述熄灭光的传输光路与激发光的传输光路类似，所述熄灭光源发出的激光经散射片2、准直扩束装置17、第二窄带滤光片18和方位角偏振片19传输至熄灭光分光器20，此散射片2、准直扩束装置17、第二窄带滤光片18和方位角偏振片19适用于647±10nm的激光。所述熄灭光分光器20将具有方位角偏振的熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光，所述熄灭光分光器20为50/50分光棱镜。本实施例中所述第一熄灭光经由熄灭光光强调整装置、第一双色镜11、第一管镜12、第二双色镜13和第一物镜14照射至样品。所述熄灭光光强调整装置亦为一个可调中性滤光片29，这样就可以调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的强度比。所述第一熄灭光从所述熄灭光光强调整装置出射后，经反射镜反射，再经所述第一双色镜11透射进入所述第一管镜12，从所述第一管镜12出射后由所述第二双色镜13反射进入所述第一物镜14，从所述第一物镜14出射后照射至设于所述微调样品台15上的样品。本实施例中所述第二熄灭光经由熄灭光光程调整装置、第三双色镜25、第二管镜26、第四双色镜27和第二物镜28照射至样品，所述熄灭光光程调整装置亦由调整架23和设于所述调整架23的角锥棱镜22构成，所述调整架23优选高精度一维调整架，所述角锥棱镜22(图3c)可由相互垂直的反射镜片42、43(图3d)代替，这样就可以调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的光程差。所述第二熄灭光由所述角锥棱镜22出射后经所述第三双色镜25透射进入所述第二管镜26，从所述第二管镜26出射后由所述第四双色镜27反射进入所述第二物镜28，从所述第二物镜28出射后照射至设于所述微调样品台15上的样品，所述微调样品台15由微调装置驱动，其轴向定位精度为39nm。这样就可以对样品中不同深度的荧光标记物的状态进行轴向扫描。所述第一双色镜11和第三双色镜25均对波长为647±10nm的激光透射。
本发明实施例提供的显微成像装置具有第一层次的轴向选择性激发和更高层次的轴向选择性激发。第一层次的轴向选择性激发中，激发光源38和熄灭光源39发出的光均设为相干光，激发光源发出的光经激发光分光器7分成第一激发光和第二激发光，此第一激发光和第二激发光经传输，分别在第一物镜14和第二物镜28的后焦面聚焦，再经第一物镜14和第二物镜28扩散成平行光束，相对照射到样品；调整激发光光程调整装置，使第一激发光与第二激发光之间的相对相位差为(2n+2)π(n为非负整数)，所述第一激发光与第二激发光形成驻波照明作用于样品，使样品内的荧光标记物处于荧光态。第一层次的轴向选择性激发中，熄灭光源发出的光经熄灭光分光器20分成第一熄灭光和第二熄灭光，此第一熄灭光和第二熄灭光经传输，亦分别在第一物镜14和第二物镜28的后焦面聚焦，再经第一物镜14和第二物镜28扩散成平行光束，相对照射到样品；调整熄灭光光程调整装置，使第一熄灭光与第二熄灭光之间的相对相位差为(2n+1)π±δ(n为非负整数)，δ为所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差允许的误差值，所述误差值δ在0～0.4π范围内取值。所述第一熄灭光与第二熄灭光形成驻波照明共同作用于样品，使样品内的荧光标记物处于非荧光态，如图4所示。根据荧光标记物本身的开关特性以及样品中荧光标记物的密度，调整第二激发光和\或第一熄灭光的光强和\或激发光与熄灭光之间的强度比，所述激发光和熄灭光形成的驻波照明使得荧光标记物处于荧光态的概率沿样品轴向分布具有调制性，也就是说，实现了荧光标记物的轴向选择性激发。如果样品中荧光标记物均匀分布，处于荧光态的大部分荧光标记物将集中在层宽(半高全宽)＜100nm的几层，如图5所示。由此可知，第一层次的轴向选择性激发可以降低荧光标记物定位显微的背景噪声。
更高层次的轴向选择性激发中，激发光源和熄灭光源发出的光均设为非相干光。激发光源发出的光经激发光分光器7分成第一激发光和第二激发光，第一激发光经由激发光光程调整装置、第一双色镜11、第一管镜12和第二双色镜13传输至第一物镜14的后焦面形成具有一定大小的空间非相干的面光源，再经第一物镜14形成宽场照明；第二激发光经由激发光光强调整装置、第三双色镜25、第二管镜26和第四双色镜27传输至第二物镜28的后焦面形成具有一定大小的空间非相干的面光源，再经第二物镜28形成宽场照明；这样第一激发光和第二激发光就相对照射到放置于压电陶瓷样品台上的样品。角锥棱镜9的位置由高精度一维调整架在轴向进行调整，使得第一激发光与第二激发光之间的相对光程差为(2n+2)π(n为非负整数)；激发光可调中性滤光片31调整所述第一激发光与第二激发光之间的强度比。所述第一激发光与第二激发光形成科勒照明作用于样品，使样品内的荧光标记物处于荧光态。此更高层次的轴向选择性激发中，熄灭光源发出的光经熄灭光分光器20分成第一熄灭光和第二熄灭光，第一熄灭光经由熄灭光光强调整装置、第一双色镜11、第一管镜12和第二双色镜13传输至第一物镜14的后焦面形成具有一定大小的空间非相干的面光源，再经第一物镜14形成宽场照明；第二熄灭光经由熄灭光光程调整装置、第三双色镜25、第二管镜26和第四双色镜27传输至第二物镜28的后焦面形成具有一定大小的空间非相干的面光源，再经第二物镜28形成宽场照明；这样第一熄灭光和第二熄灭光就相对照射到放置于压电陶瓷样品台上的样品。角锥棱镜9的位置由高精度一维调整架在轴向进行调整，使得第一熄灭光与第二熄灭光之间的相对光程差为(2n+1)π；熄灭光可调中性滤光片29调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的强度比。所述第一熄灭光与第二熄灭光形成科勒照明共同作用于样品，使样品内的荧光标记物处于非荧光态。空间非相干光的引入，使得远离轴向中心位置的荧光标记物处于荧光态的概率大大降低。如果样品中荧光标记物分布均匀，大部分处于荧光态的荧光标记物集中在层宽(半高全宽)＜100nm的一层。由此可知，更高层次的轴向选择性激发显著降低荧光标记物定位显微的背景噪声。
样品内荧光标记物产生的荧光经由第一物镜14收集，第二双色镜13透射，第三窄带滤光片32过滤，第三管镜33透射，最终成像在第一探测器34；所述第一探测器34为电子倍增CCD探测器(EMCCD)。对第一探测器34获得的荧光图像进行分析，可以获得荧光标记物的定位信息。为获得样品内不同深度的图像，有以下两种方式：一、具有轴向精密移动功能的微调样品台带动样品在轴向移动；二、调整所述相对光程差，使激发光和熄灭光光强分布沿轴向移动。此两种轴向扫描方式结合二维质心定位法实现荧光标记物的三维纳米定位。多次成像获得的定位信息叠加，并通过样品本身轴向移动或者激发光/熄灭光强度分布的轴向移动，结合三维重构，最终获得样品的三维纳米分辨成像。本实施例优选微调样品台沿轴向精密移动的方式。
为更加高效地获得三维纳米分辨成像，探测结构中还可以结合其他具有轴向定位功能的结构和算法，例如多焦面探测结构(MUM、dMUM)和轴向定位算法(MUMLA)。此时，除第一探测器34上获得的部分荧光信号外；样品内荧光标记物产生的另一部分荧光还可经第二物镜28收集，第四双色镜27透射，第四窄带滤光片35过滤，第四管镜36透射，最终成像在第二探测器37；通过所述轴向定位算法MUMLA分析第一探测器34和第二探测器37获得荧光图像，计算出探测到的荧光标记物的三维纳米定位信息。由于轴向定位算法MUMLA是一种可选的辅助轴向定位方法，因此图1中的第四窄带滤光片35、第四管镜36和第二探测器37均用虚线表示。第一探测器34多次曝光成像，或者结合MUMLA后，第一探测器34和第二探测器37多次同时曝光成像，可以迅速获得样品与轴向垂直的某一薄层或若干薄层内所有荧光标记物的三维纳米定位信息。
所述第一层次的轴向选择性激发和更高层次的轴向选择性激发中，激发光源和熄灭光源发出的光分光后经过光强及光程调整装置调整形成调制照明，所述激发光和熄灭光沿样品轴向的强度分布满足以下公式：
Pi=∫0αidθisin(θi)Ii,(i=1,2)]]>-----①
其中θi为照射到样品上的空间非相干光与样品轴向的夹角；αi为θi的最大值，α1＝α2＝60°；I1＝Iλ1{1+r1 cos[2k1 cos(θ)z]}，I2＝Iλ2{1-r2 cos[2k2cos(θ)z]}；Iλ2/Iλ1＝500。其中，Iλi为强度常数；ri为调制对比度，r1＝r2＝0.9；ki＝2niπ/λi；λi为波长，λ1＝514nm，λ2＝647nm；ni为折射率，n1＝1.512，n2＝1.520；下标i表示对应变量与激发光(i＝1)或熄灭光(i＝2)相关。激发光和熄灭光形成的驻波沿轴向的强度分布，如图6所示。
在这种照明方式下，荧光标记物处于荧光态的概率p为：
p＝kon/(kon+koff)-----②
其中，kon、koff为开关速率，分别与激发光和熄灭光强度成正比：
kon＝η1P1 -----③，koff＝η2P2 -----④
其中，η1、η2为两个比例系数常数，对于Cy5，有η1＝4/15，η2＝4/11。
利用式①～式④，经过数值计算，可以得到荧光标记物处于荧光态的概率p沿样品轴向分布的曲线，如图7所示，它只存在一个峰，层宽(半高全宽)为39nm；样品轴向中心位置p＝0.025，远离样品轴向中心位置处于荧光态的概率是位于样品轴向中心位置荧光标记物处于荧光态的概率的1/50；样品轴向中心位置附近90％处于荧光态的荧光标记物位于厚度为90nm的薄层内。这表明，本装置实现了细胞等厚样品内荧光标记物的轴向选择性激发。MUMLA算法实现样品内荧光标记物的三维纳米定位。MUMLA算法使用的两幅源图像由第一探测器34和第二探测器37获得，MUMLA算法的横向定位精度比传统的质心定位方法提高了20％～35％；当采集到的荧光标记物数大于1000时，MUMLA算法可以对深度为0～500nm的荧光标记物实现20～30nm的轴向定位精度。
本实施例中压电陶瓷样品台的轴向移动步长为39nm，确保轴向扫描结束后，所有轴向上的荧光标记物均受到一致的激活次数。
本发明基于轴向选择性激发，得到高效的成像装置。每次曝光成像时，大部分处于荧光态的荧光标记物集中于样品的一个薄层或若干薄层中，避免了荧光标记物定位显微用于细胞等厚样品成像时，不同层中处于荧光态的荧光标记物的相互串扰，降低了单次成像中无效成像的荧光标记物数量，提高成像效率，同时避免处于非探测层的荧光标记物的无效激发次数以及可能的光漂白。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，如将光程调整装置的位置跟光强调整装置的位置进行调换，均应包含在本发明的保护范围之内。