PH敏感型壳聚糖衍生物及其在药剂学中的应用.pdf

本发明涉及高分子化学领域和药物制剂领域，具体涉及一种pH敏感型壳聚糖衍生物N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖及其在药剂学中的应用，其在水溶液中能自发形成两亲性聚合物胶束，本发明公开了该壳聚糖衍生物的制备方法及其作为抗癌药物载体的用途，其可用于制备对难溶性药物有增溶作用的聚合物胶束。

权利要求书
1.  通式I的壳聚糖衍生物：

其中：壳聚糖粘均分子量为5kDa，29k或70kDa，x、y、z分别是8％、13％-64％、27％-79％。

2.  权利要求1的壳聚糖衍生物，其中壳聚糖粘均分子量为70kDa。

3.  权利要求1的壳聚糖衍生物，其中y是36％。

4.  权利要求1、2或3的壳聚糖衍生物的制备方法，包括：将壳聚糖与辛醛反应得到N-辛基壳聚糖，然后再将其2-NH2与六氢苯酐上的羧基反应，即得。

5.  一种药物组合物，其中含有药物及权利要求1、2或3的壳聚糖衍生物，其中药物选自喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、藤黄酸、环孢素A、足叶乙苷、替尼泊甙、依托泊甙、长春酰胺、尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、甲氨喋呤、冬凌草素、藤黄酸、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素或靛玉红。

6.  权利要求5的药物组合物，其中药物是紫杉醇。

7.  权利要求5的药物组合物，其中药物与壳聚糖衍生物的重量比为1∶1-1∶3。

说明书pH敏感型壳聚糖衍生物及其在药剂学中的应用
技术领域
本发明涉及高分子化学领域和药物制剂领域，具体涉及一种pH敏感型壳聚糖衍生物N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖，其在水溶液中能自发形成两亲性聚合物胶束，本发明公开了该壳聚糖衍生物的制备方法及其作为抗癌药物载体的用途，用于制备对难溶性药物有增溶作用的聚合物胶束。
背景技术
可生物降解的聚合物胶束是当前药物传递系统研究的热点领域，它能在水环境中自组装形成独特的核-壳结构，增溶难溶性药物，提高药物的生物利用度。聚合胶束还具有纳米级粒径，可避免被巨噬细胞识别和吞噬，通过EPR效应增强肿瘤组织的被动靶向性，减少药物毒副作用(M.Jones，J.Leroux，Eur.J.Pharm.Biopharm.，1999，48(2)：101-111.)。pH敏感型聚合物胶束是指在体内某个特定的酸碱环境下，载体的性能发生改变，使释药增加的一类给药系统。利用这一特性，可以实现对病灶组织的靶向给药。其有两种作用模式：一是利用肿瘤细胞外基质的pH(pH＜7.0)要低于正常组织的pH，使胶束积累在肿瘤细胞表面从而提高对肿瘤组织的靶向性(V.A.Sethuraman，K.Na，Y.H.Bae，Biomacromolecules，2006，7(1)：64-70.)；二是利用细胞内内涵体和溶酶体的pH要明显低于细胞外pH，促使胶束水解，释放药物或促使内涵体、溶酶体膜破裂，避免药物被溶酶体内酶降解，从而提高治疗效果(Y.Bae，W.D.Jang，N.Nishiyam，S.Fukushima，K.Kataoka，Mol.BioSyst.，2005，1：242-250)。
紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是从红豆杉属植物紫杉的树干和树皮中提取得到的有紫杉烯环的二萜类化合物，此药于1983年开始用于卵巢癌和乳腺癌的临床研究，1992被美国FDA批准上市，也是唯一具有抗微管作用机理的广谱细胞毒类抗癌药。
由于紫杉醇难溶于水，由于其结构中缺少能够离子化的基团，因此常用的改变pH值、添加络合剂及成盐等常规药剂学手段均不能增加其水溶性。目前市售常用制剂均为紫杉醇的聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL)和无水乙醇(50∶50，v/v)的油溶液。如百时美施贵宝公司的澳大利亚Faulding公司的以及国产的紫素、泰素等临床应用时用生理盐水或5％葡萄糖注射液稀释5-20倍。但是该制剂存在以下问题：主要是cremophor EL的致敏性，cremophor EL在体内降解时能释放组胺，导致严重的过敏反应引起血压下降、胸闷、支气管痉挛或全身泛发性荨麻疹等。此外，cremophor EL可溶解PVC输液器中的二乙烯己基邻苯二甲酸盐，引起严重的毒性反应，从而影响了传统紫杉类药物的临床安全应用，因此开发不含cremophor EL的新剂型已经成为紫杉醇研究领域的一个热点。
壳聚糖是可生物降解和具有生物相容性的天然聚合物，来源广泛，价格便宜，安全无毒。发明人在先期的授权专利CN03112981.1和CN200510095442.X中公开了一类N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖和一类N-长链烷基-N-季胺化壳聚糖，均可形成胶束且对难溶性药物具有增溶作用，但形成的胶束无智能响应性。
发明内容
本发明以壳聚糖为主链，通过接枝反应引入辛基疏水基和pH敏感的亲水基，赋予整个体系以独立的pH敏感特性。该材料在水中自组装形成胶束，并用其有效增溶难溶性抗癌药物，其在人体正常生理条件下(pH值7.4)稳定存在，而在弱酸性环境中(如内涵体和溶酶体)酰胺键快速水解，亲水基断裂，胶束水解，药物快速释放，从而实现肿瘤治疗的有效性和安全性。
本发明的的壳聚糖衍生物见通式I，命名为：N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖：

其中：壳聚糖粘均分子量为5kDa、29kDa或70kDa，表示取代度的x、y、z分别是8％、13％-64％、27％～79％。
壳聚糖粘均分子量优选70kDa。
y优选36％。
本发明的壳聚糖衍生物I的制备方法，包括：先制得N-辛基壳聚糖，再与六氢苯酐反应制得N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖(I)。
式I壳聚糖衍生物简单的合成路线为：

更优选的制备方法如下：
a.N-辛基壳聚糖(NOC)的合成
取壳聚糖(5kDa，29kDa，70kDa)溶于无水甲醇中，搅拌2h，升温至30度，加入辛醛，反应2-72h。加入KBH4，室温还原24h，调pH至7，过滤，用水、甲醇、乙醚洗涤，烘干，得N-辛基壳聚糖。
b.N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖的合成
取N-辛基壳聚糖，悬浮于DMSO中搅拌1h，加入六氢苯酐，升温至80度反应24h，加1倍水稀释，1mol/LNaOH调pH至10，透析72h，冻干，得N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖(I)。
本发明的壳聚糖衍生物I为白色至黄色粉末，易溶于水，溶于水中时两亲性的疏水基团向内与水隔离，亲水基团向外在水中定向排列可自发形成具有壳核结构的胶束，载体性质研究表明载体的临界胶束浓度为0.042-0.18mg/ml，因此只要在水溶液中浓度高于此临界胶束浓度时就可以自发形成空白胶束，测得其空白胶束粒径在100-180nm之间。当体系中加入疏水性药物后，药物和其疏水链通过疏水作用而将其增溶在胶束核中。在正常生理环境(pH7.4)下通过酰胺键连接的亲水外层能稳定存在，弱酸性环境(pH5.0～6.0)使连接臂发生水解，胶束外壳的亲水部分断裂使胶束释药。
本发明还公开了一种药物组合物，其含有药物和本发明的壳聚糖衍生物。本发明最适合的是制备抗癌药物组合物。所述抗癌药物优选难溶性药物如：喜树碱类(如喜树碱、10-羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、SN-38等)、紫杉醇、多西紫杉醇、藤黄酸、环孢素A、足叶乙苷、替尼泊甙、依托泊甙、长春酰胺、尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、甲氨喋呤、冬凌草素、藤黄酸、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素或靛玉红，本发明的壳聚糖衍生物对上述药物均有很好的增溶作用。更优选的药物是：紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素或喜树碱。最优选的药物是紫杉醇。
本发明的N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖(I)对难溶性药物特别如紫杉醇等有很好的增溶效果，其包载紫杉醇的最高载药量可达到40％。
研究还发现，随着药物和N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖的重量比例不同，增溶效果和粒径也不同，本发明人对不同药载比对胶束载药性质的影响进行了深入研究。
表1.紫杉醇和N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖载体不同比例对于胶束载药性质的影响

结果显示：紫杉醇与N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖在1∶3～1.5∶1的范围内可以形成胶束，并且随着药载比的升高，胶束的载药量和包封产率逐渐增大，且粒径逐渐减小，多分散指数变化不大，但药载比大于1.05∶1后，载药量及包封产率开始下降，而且粒径和多分散指数也显著升高。说明药载比为1.05∶1时载体达到了饱和载药能力。因此，本发明优选紫杉醇和N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖的重量比为1∶1～1∶3。
本发明制备的药物组合物制备简单：N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖和药物分别溶于去离子水和无水乙醇中，随后在磁力搅拌下将紫杉醇的乙醇液逐滴加入至N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖的水溶液中，所得溶液在去离子水中透析后过微孔滤膜即得。用这种方法制得到的胶束有较高的包封产率和载药量。
如需制备成冻干制剂，则加入赋形剂，也称为冻干保护剂，无菌过滤，冻干。赋形剂优选右旋糖酐、甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一种或几种。赋形剂的用量按胶束溶液体积算，1份胶束溶液加入0.01-0.1份赋形剂，过滤后冷冻干燥。临床使用时可以用注射用水，生理盐水或者葡萄糖重新溶解，本冻干制剂溶解迅速，且溶解后溶液澄清。
本发明制备的pH敏感的药物胶束具有较高的载药量和包封产率，胶束体外释药特性研究表明：环境中的pH变化显著影响胶束释药，胶束大量释药的pH敏感值为5.5，酸性环境能大大提高胶束的释药性能，从而实现细胞内靶向释药。
以对照Taxol(紫杉醇的市售制剂)与N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖，以及N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖制备的紫杉醇胶束进行MTT法细胞毒实验表明：本发明的N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖IC50远高于Taxol对照组，说明载体本身无毒。抗肿瘤药效学实验表明：本发明紫杉醇胶束制剂以及Taxol对小鼠移植Heps瘤的生长具有明显的抑制作用(p＜0.01)，且胶束制剂对小鼠体重没有影响，空白载体也无明显的抗肿瘤效果(p＞0.05)，可以说明胶束制剂有显著抗肿瘤活性且无明显毒副作用。
附图说明：
图1.(a)透光率随着pH的变化，(b)空白胶束的粒径随着pH的变化图(n＝3)
图2.48h内紫杉醇胶束制剂随着pH变化的累积释放曲线图
具体实施方式
实施例1
pH敏感壳聚糖衍生物(I)的合成：
1.N-辛基壳聚糖的制备(NOC-1)
250mL三颈瓶中加入4g壳聚糖(粘均分子量70kDa)，120mL无水甲醇，30℃水浴中机械搅拌2小时。向三颈瓶中滴加10.6mL辛醛，保温反应2h，分批加入3g KBH4，室温还原反应24h，用1mol/L NaOH调反应液pH至7，过滤，用水洗2次，甲醇洗4次，乙醚洗2次，烘干，得黄色粉末3.8g。
2.N-辛基-N-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖的制备(OCCC-1)
取1g N-辛基壳聚糖(NOC-1)，悬浮于50mL二甲亚砜中，搅拌1h，加入六氢苯酐1.18g，80℃剧烈搅拌反应24h，反应液倒入1倍量体积水稀释，用1mol/L NaOH调pH至10，透析72h，抽滤除去沉淀，滤液冻干，得淡黄色粉末0.9g。
OCCC-1：
FT-IR：3424，3348，2932，2860，1726，1648，1553，1448，1414，1305，1152，1073，1032，629cm-1.1H NMR(300MHz，D2O)：4.9(H1)，4.1-3.4(H3，H4，H5，H6)，3.2(H2)，3.0-2.8(CO-(CH-CH2-CH2-CH2-CH)-COOH)，2.1(NH-CO-CH3)，1.9，1.8，1.4(-NH-CH2-(CH2)6-CH3，CO-(CH-CH2-CH2-CH2-CH)-COOH)，1.4-1.2(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)，0.9(-NH-CH2-(CH2)6-CH3).
根据元素分析数据，可以计算出OCCC-1中辛基取代度为13％。
实施例2
1.N-辛基壳聚糖的制备(NOC-2)
用壳聚糖同辛醛反应5h，用KBH4还原，即得，制备方法同实施例1中NOC-1的制备。
2.N-辛基-N-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖的制备(OCCC-2)
用N-辛基壳聚糖(NOC-2)与六氢苯酐反应制备，制备方法同实施例1中OCCC-1的制备。
OCCC-2：
FT-IR：3416，2930，2857，1716，1641，1558，1447，1413，1387，1309，1176，1068，1035，615cm-1.1H NMR  (300MHz，D2O)：4.3-4.5(H1)，3.8-3.2(H3，H4，H5，H6，H2)，2.8-2.2(CO-(CH-CH2-CH2-CH2-CH)-COOH)，1.8，1.4(-NH-CH2-(CH2)6-CH3，CO-(CH-CH2-CH2-CH2-CH)-COOH)，1.4-1.2(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)，0.9(-NH-CH2-(CH2)6-CH3).
根据元素分析数据，可以计算出OCCC-2中辛基取代度为29％。
实施例3
1.N-辛基壳聚糖的制备(NOC-3)
用壳聚糖同辛醛反应8h，用KBH4还原，即得，制备方法同实施例1中NOC-1的制备。
2.N-辛基-N-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖的制备(OCCC-3)
用N-辛基壳聚糖(NOC-3)与六氢苯酐反应制备，制备方法同实施例1中OCCC-1的制备。
OCCC-3：
FT-IR：3472，3415，2932，2855，1711，1650，1557，1448，1413，1384，1067，1032，620cm-1.1H NMR(500MHz，D2O)：4.6(H1)，4.1-3.4(H3，H4，H5，H6)，3.2(H2)，3.0-2.7(CO-(CH-CH2-CH2-CH2-CH)-COOH)，1.9，1.7，1.5(-NH-CH2-(CH2)6-CH3，CO-(CH-CH2-CH2-CH2-CH)-COOH)，1.4-1.0(-NH-CH2-(CH2)7-CH3)，0.8(-NH-CH2-(CH2)7-CH3).
根据元素分析数据，可以计算出OCCC-3中辛基取代度为36％；2-羧基环己甲酰基的取代度为58％。
实施例4
1.N-辛基壳聚糖的制备(NOC-4)
用壳聚糖同辛醛反应36h，用KBH4还原，即得，制备方法同实施例1中NOC-1的制备。
2.N-辛基-N-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖的制备(OCCC-4)
用N-辛基壳聚糖(NOC-4)与六氢苯酐反应制备，制备方法同实施例1中OCCC-1的制备。
OCCC-4：
FT-IR：3414，2928，2855，1707，1638，1556，1448，1413，1384，1157，1068，1033，616cm-1.1H NMR(300MHz，D2O)：4.5(H1)，4.0-3.4(H3，H4，H5，H6)，3.2(H2)，3.0-2.8(CO-(CH-CH2-CH2-CH2-CH)-COOH)，2.0(NH-CO-CH3)，1.9，1.8，1.5(-NH-CH2-(CH2)6-CH3，CO-(CH-CH2-CH2-CH2-CH)-COOH)，1.4-0.9(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)，0.8(-NH-(CH2)7-CH3).
根据元素分析数据，可以计算出OCCC-4中辛基取代度为43％；2-羧基环己甲酰基的取代度为49％。
实施例5
pH敏感性实验研究
配制浓度为10mg/mL的pH敏感聚合物(OCCC-3)水溶液，取1mL分别滴加入8mLpH＝7.4、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的磷酸盐缓冲溶液中，用紫外-可见分光光度计测定500nm处的透光率。
配制浓度为10mg/mL的实施例3制备的OCCC-3水溶液，取1mL分别滴加入8mL pH＝7.4、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的磷酸盐缓冲溶液中，用Zetasizer 3000HSA粒径电位仪测定空白胶束的粒径。
不同pH缓冲液条件下，溶液的透光率变化见图.1a，OCCC-3在pH 5.5缓冲溶液中透光率就开始急剧下降，溶液的粒径随pH的变化见图.1b，粒径随着pH的降低而逐渐增大，到pH 5.5时明显增加，与透光率法一致。由此实验可知OCCC-3材料具有pH敏感性，pH敏感值为5.5，文献报道的细胞内内涵体和溶酶体的pH要明显低于细胞外pH(pH 5.0～6.0)，因此在此条件下胶束敏感可以使胶束被摄入细胞后加速释放药物，从而提高治疗效果。
绘制透光率和粒径随pH的变化图，见图1。
实施例6
载药性质研究：
将15mg OCCC-2(实施例2中所制备)溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将4.5mg紫杉醇溶解在0.09mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为30.47％，包封产率为42.22％，粒径为150.7nm，多分散指数为0.30。
实施例7
将15mg OCCC-4(实施例4中所制备)溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将4.5mg紫杉醇溶解在0.09mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为32.39％，包封产率为50.11％，粒径为154.3nm，多分散指数为0.32。
实施例8
将15mg OCCC-3(实施例3中所制备)溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将4.5mg紫杉醇溶解在0.09mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为11.95％，包封产率为54.74％，粒径为149.5nm，多分散指数为0.23。
实施例9
将15mg OCCC-3溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将6.75mg紫杉醇溶解在0.135mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为18.55％，包封产率为62.24％，粒径为140.3nm，多分散指数为0.26。
实施例10
将15mg OCCC-3溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将9.0mg紫杉醇溶解在0.18mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为22.43％，包封产率为60.98％，粒径为136.4nm，多分散指数为0.26。
实施例11
将15mg OCCC-3溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将11.25mg紫杉醇溶解在0.225mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为25.95％，包封产率为58.81％，粒径为136.9nm，多分散指数为0.26。
实施例12
将15mg OCCC溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将13.5mg紫杉醇溶解在0.27mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为32.12％，包封产率为66.45％，粒径为136.9nm，多分散指数为0.30。
实施例13
将15mg OCCC-3溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将15.75mg紫杉醇溶解在0.315mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为34.74％，包封产率为66.21％，粒径为130.4nm，多分散指数为0.31。
实施例14
将15mg OCCC-3溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将18mg紫杉醇溶解在0.36mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为33.83％，包封产率为64.06％，粒径为119.3nm，多分散指数为0.5。
实施例15
将15mg OCCC-3溶解在2.5mL蒸馏水中，同时将22.5mg紫杉醇溶解在0.45mL无水乙醇中，搅拌条件下将紫杉醇溶液滴加入载体溶液中，蒸馏水透析12h，0.45μm微孔滤膜过滤，得到紫杉醇聚合物胶束溶液。分装西林瓶中冷冻干燥。用HPLC法测定载药量为32.12％，包封产率为36.71％，粒径为135.5nm，多分散指数为0.46。
实施例16
取1.0mL的紫杉醇胶束溶液放人透析袋中，置于150mL含1.0％吐温80的磷酸盐缓冲液(pH 7.4，pH 6.8，pH 5.5，pH 5.0)中，分别于1、2、4、6、8、24、48h取出1.5ml溶液同时补充同温同量释放介质)过0.22μm滤膜，进样测含量，计算各时间点的平均累积释药百分率，结果得出pH 7.4和6.8的48小时累积释放率分别为22％，27％，两者之间无明显变化(p＞0.05)。而pH 5.5和pH 5.0时48h的累积释放率分别为52％和72％，和pH 7.4时相比两者的均有显著提高(p＜0.05)。说明胶束的pH敏感点是5.5，这与文献报道的内涵体pH环境相符合，因此实验表明酸性环境能大大提高胶束的释药性能，从而实现细胞内涵体靶向释药。绘制释药曲线图，见图2。
实施例17
细胞毒研究
将处于对数生长期的KB细胞和MCF-7细胞按5×104个细胞/孔接种于96孔板中，每孔加100μL，培养24h后吸弃上层培养液后加入含不同浓度的Taxol、OCCC-3载体的DMEM溶液，每组设3个平行孔，KB和MCF-7细胞组分别于37℃继续培养48h和72h后吸弃培养液，每孔加入100μL DMEM培养液和10μL MTT(5mg/ml in PBS)。继续培养4h后吸弃培养液，加入150μL DMSO溶解形成的甲瓒。用微型振荡器振荡混匀后，用酶标仪在参考波长630nm，检测波长570nm的条件下测定光密度值，以空白培养对照处理的肿瘤细胞作对照，计算药物对肿瘤细胞的抑制率，计算得到IC50。对于不同细胞的细胞毒结果如下表2，结果表明OCCC-3空白载体的IC50远高于Taxol对照组，有显著性差异(p＜0.01)，说明载体本身无毒，可以作为一个安全的药用载体。
表2空白载体与对照组IC50值(n＝3)

**p＜0.01，和Taxol对照组相比
实施例18
抗肿瘤药效学研究
取对数生长期的Heps细胞，生理盐水调整细胞浓度至1×107个/mL的细胞悬液接种于Balb-c小鼠腹腔，生长一周后无菌条件下抽取小鼠腹水，用红细胞裂解液去除红细胞后，加生理盐水稀释至成1×107个/mL的细胞悬液。取0.1mL细胞悬液接种至小鼠腹腔皮下为实验动物模型。荷瘤鼠随机分为4组，每组10只，生理盐水组与Taxol组分别为阴、阳性对照组，另外两组分别为紫杉醇胶束制剂组和OCCC-3空白载体组。接种24h后i.v.给药，给药剂量为20mg/kg，每2天一次，共给药4次，每天称小鼠体重，于停药后第3天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重。
胶束制剂、空白载体与对照组在荷瘤鼠模型中的抗肿瘤药效结果见下表，所得数据进行统计学处理(t检验)，紫杉醇胶束组和阳性对照Taxol组对小鼠移植Heps瘤的生长具有明显的抑制作用(p＜0.01)，且胶束制剂对小鼠体重的影响没有影响，空白载体无明显抑瘤活性(p＞0.05)。实验表明胶束制剂有显著抗肿瘤活性且无明显毒副作用。紫杉醇胶束组和对照组相比，肿瘤重量减小，且有显著性差异(p＜0.05)，说明紫杉醇胶束组对于小鼠Heps移植瘤抗肿瘤药效结果优于对照Taxol组。
表3胶束制剂、空白载体与对照组在荷瘤鼠模型中的抗肿瘤药效结果(n＝10)

*p＜0.05，**p＜0.01，和生理盐水组相比。