一种家蚕幼虫的性别鉴定方法.pdf

本发明提供了一种家蚕幼虫的性别鉴定的方法，该方法包括：家蚕DNA的提取；利用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测定核酸；利用与家蚕性别决定有关的基因序列设计引物，进行PCR扩增；将PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳；通过电泳的结果，进行家蚕幼虫性别的鉴定等步骤。采用上述方法，可以很方便地鉴别出家蚕幼虫的性别，提高蚕种场的制种效益。

权利要求书
1、  一种家蚕幼虫性别鉴定的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)家蚕DNA的提取；
(2)利用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测定核酸；
(3)利用与家蚕性别决定有关的基因序列设计引物，进行PCR扩增；
(4)将PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(5)通过电泳的结果，进行家蚕幼虫性别的鉴定。

2、  权利要求1所述的一种家蚕幼虫性别鉴定的方法，其特征在于：所述的与家蚕性别决定有关的基因，是获得限性卵色系的易位到W染色体的白卵基因序列。

3、  权利要求1所述的一种家蚕幼虫性别鉴定的方法，其特征在于：所述的与家蚕性别决定有关的基因，是获得限性皮斑系易位到W染色体含有斑纹基因序列。

4、  权利要求1所述的落地灯，其特征在于：所述的与家蚕性别决定有关的基因，是利用获得了限性黄茧突变系易位到W染色体上的黄血基因Y序列。

说明书一种家蚕幼虫的性别鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种生物体的性别鉴定方法，特别是一种家蚕幼虫的性别鉴定的方法。
背景技术
栽桑养蚕起源于我国，至今已有5000多年的历史。茧丝业一直是我国的优势传统产业，蚕茧生丝年产量和出口量分别占世界总额的70％和80％以上，是世界茧丝业的中心。
但是，在20世纪的一百年中，我国所采取的养蚕技术体系，总体上是基于国外在20世纪三四十年代所建立的，蚕业科技在相当长的一个时期内没有明显突破。
建立在现代科学技术上的，利用生物基因技术开展的养蚕技术体系就成为世界各茧丝业国家的竞争焦点。我国科学家仅用5个月，就完成了“框架图”的绘制工作，家蚕基因组“框架图”的绘制完成，将有助于人们获得家蚕基因结构组织的详细信息和全部基因、，从分子水平上深刻阐明家蚕的生物学特性、吐丝机理，可利用基因研究手段培育出新型高产优质蚕品种等。
已知雄蚕较雌蚕除了具有较高的生命力外，还有食桑少，发育快，茧参率高和茧丝长，解殊丝长，净度好等优点。因而丝茧养育人们都希望专养雄蚕。另一方面为了提高蚕种场的制种效益，人们希望多养雄蚕，因为雄蚕可以利用2次。
现已找到了一些控制桑蚕性别的途径(何克荣，夏建国等，桑蚕的性别控制与专养雄蚕的研究，蚕桑通报，1998年第03期)。把家蚕控制身体特种斑纹颜色的基因和性别基因转接到一起，就可以让雌雄家蚕的身体呈现出不同颜色。一旦搞清家蚕的性别基因序列和分子调控机理，人们就能够最终实现“单养雄蚕”的夙愿。如用辐射诱变，将第10染色体上的第2白卵基因易位到W染色体上，获得限性卵色系；将第2染色体上含有斑纹基因的染色体片断易位到W染色体上，获得限性皮斑系；将第2染色体上的黄血基因Y易位到W染色体上，获得了限性黄茧突变系。由此可以利用这些已知基因序列，设计特定的引物进行PCR扩增检测。
“框架图”的完成是家蚕基因组研究和开发计划的第一步，而“精细图”预计也即将完成。科研人员将利用生物信息学的最新方法，对家蚕所拥有的所有基因进行注释，开展重要功能基因的基础和应用研究。到时候，会对家蚕的特定性别基因等有个更为明晰的了解和定位。
因为家蚕的性别特征在幼虫时期十分模糊，目前还没有很好的鉴别方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用DNA基因方法来对家蚕幼虫的性别进行鉴定的方法，以解决现有家蚕幼虫不能很好鉴别的问题。
本发明的目的可以通过以下方法来实现：
一种家蚕幼虫的性别鉴定的方法，该方法包括如下步骤：
(1)家蚕DNA的提取；
(2)利用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测定核酸
(3)利用与家蚕性别决定有关的基因序列设计引物，进行PCR扩增；
(4)将PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(5)通过电泳的结果，进行家蚕幼虫性别的鉴定。
采用上述方法，可以很方便地鉴别出家蚕幼虫的性别，提高蚕种场的制种效益。
附图说明
图1为本发明提取的家蚕总DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图2本发明用与家蚕性别有关的基因设计特定荧光引物PCR后的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
家蚕DNA的提取与DNA的测定
首先从家蚕取少量的组织进行DNA的提取，将提取物以一定比例稀释后，用紫外分光光度计在260nm波长下测提取物OD，估算大致浓度。然后取1-3μl的提取物进行琼脂糖凝胶电泳图1，条带100是Marker，条带101-117是提取的家蚕总DNA，其中101-112是没有纯化、没有酶解RNA的家蚕总DNA，113-117是经纯化、消化RNA的家蚕总DNA条带。位于101-117加样孔附近的条带120是家蚕的总DNA。位于101-112加样孔远端的弥散状条带121是RNA。
特定基因的PCR扩增与检测
利用控制桑蚕性别的基因，如已知获得限性卵色系的易位到W染色体的白卵基因序列，利用此基因设计引物，取1μ总DNA为模板，用设计好的引物(或荧光引物)进行PCR扩增反应，将取反应物3μl进行琼脂糖凝胶电泳检测鉴定家蚕的性别。如图2，其中CK是阳性对照，CK，5，9，14，，19加入Marker的条带，1-22是与家蚕性别决定有关的基因用荧光引物PCR扩增后的产物，25是与家蚕性别决定有关的基因位点1，26是与家蚕性别决定有关的基因位点2。据已知的基因序列信息可知1-11为雌性，12-22为雄性。
如上所述，还可利用已知获得限性皮斑系易位到W染色体含有斑纹基因序列，设计引物进行性别检测；同法可以利用获得了限性黄茧突变系的易位到W染色体的黄血基因Y。
除了以上所述的三种已知的与家蚕性别基因有关的序列可以应用于本发明的检测方法外，随着对家蚕基因图谱的进一步深入了解，后续发现的决定家蚕性别的基因均可以用本方法检测。