早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法.pdf

早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法，涉及CK19mRNA、CK20mRNA及CEAmRNA检测上皮性消化道肿瘤细胞经外周血微转移方法。提供采用分子生物学手段综合CK19mRNA、CK20 mRNA和CEA mRNA三项指标，微量准确快速检测上皮性消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法。步骤为采血，离心，获取血液中的有核细胞，提取总RNA，RNA检测并鉴定其完整性，要求OD260/OD280比值＞1.8，合成cDNA第一链，对CK19c DNA和CK20c DNA的巢式PCR扩增，再对CEA的cDNA第一链进行巢式PCR扩增，三项指标联合检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移后统计学计算。

权利要求书
1、  早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法，其特征在于具体步骤如下：
1)采血：抽取外周静脉血3～5mL，注入含肝素钠的洁净试管中；
2)准备离心：取步骤1)所得的肝素抗凝静脉血与Hank氏液等量混匀，分别在两支试管中加入2～4mL的淋巴细胞分离液，再将上述混合液5～10mL叠加于淋巴细胞分离液的液面上；
3)获取血液中的有核细胞：将步骤2)中的试管经2000～2500g水平离心15～20min后溶液分为3层，上层为血浆和Hank氏液，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞，在上、中层界面处有一以有核细胞为主的白色狭窄带，用干净毛细管插到该白色狭窄带层，吸出有核细胞，并移入试管中，加入1～5mL Hank氏液，洗涤细胞，1500～2000g水平离心10～15min，弃上清液；
4)提取总RNA：在已经洗涤过的有核细胞沉淀中加入Trizol试剂1～5mL，消化3～5min；将细胞裂解液吸到EP管中，加氯仿0.2～1.0mL，轻摇15～60s，室温静置5～10min，10000～12000g离心10～15min，取上清无色水相液到EP管中，加异丙醇0.5～1.5mL，静置10～20min，10000～12000g离心10～15min，弃上清，在管底见微量白色总RNA沉淀；
5)RNA检测：用无水乙醇洗涤RNA沉淀后，10000～12000g离心5～10min，吸尽上清液，在超净台中以无菌风吹干残余乙醇，加入无菌双蒸水10～20μL，打匀，55～60℃水浴10-20min溶解总RNA，测OD260和OD280值，检测其纯度，在琼脂糖凝胶中电泳，鉴定所提取RNA的完整性；
6)若OD260/OD280比值＞1.8，说明RNA的纯度较高，则进入后续实验；若OD260/OD280比值＜1.8，说明RNA的纯度不够，应重复步骤4)，直至符合要求即OD260/OD280比值＞1.8为止；若在琼脂糖凝胶电泳中至少能见到两条界限分明的RNA带，说明RNA质量较高，降解较少，否则应重新提取总RNA；
7)cDNA第一链的合成：取上述总RNA 1～5μL于EP管中，70℃水浴10min，在冰浴中依次加入：0ligo(dT)15引物1μL，10×缓冲液2μL，dNTPs 2μL，RNasin 0.5μL，AMV反转录酶4.3μL(3.5u/μL)，双蒸水5.2～9.2μL，混匀，整个反应体系移42℃孵育15min，接着95℃ 5min，最后0～5℃ 5min，经反转录获得各种cDNA的第一链；
8)CK19 cDNA的巢式PCR扩增：对CK19的cDNA第一链进行巢式PCR扩增和检测的第一轮扩增体系包括：反转录产物3～5μL，无菌双蒸水11.8～13.8μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 A(5′GAGGTGGATTCCGCTCCGGGCA 3′)和CK19 B(5′ATCTTCCTGTCCCTCGAGCAG 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL；反应条件如下：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环40次；第一轮PCR扩增后立即进行第二轮PCR扩增，反应体系包括：第一轮PCR扩增产物0.5μL，无菌双蒸水16.3μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 C(5′CGAGCAGAACCGGAA3′)和CK19 D(5′TGAGCCG CTGGTACTCCTGAT 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL，第2轮PCR扩增除退火温度为52℃外，其余反应条件同第一轮反应。取上述巢式第二轮PCR扩增产物4～8μL在1.0％～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记阳性或阴性结果并与临床分期和病理结果进行比对；
9)CK20 cDNA的巢式PCR扩增：CK20巢式PCR扩增的体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增，第一轮扩增引物为CK20 A(5′CAGACACACGGTGAACTATGG 3′)和CK20 B(5′GATCAGCTTCCACTGTTAGACG 3′)。反应条件：94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸30s，循环35次；第二轮扩增引物为CK20 C(5′CTGTTTGTTGG CAATGAGAAAATGG 3′)和CK20 D(5′GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT3′)，退火温度为62℃ 1min，72℃延伸30s，循环35次；扩增后取扩增产物4～8μL在1.0％～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
10)对CEA的cDNA第一链进行巢式PCR扩增：CEA巢式PCR扩增的体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增，其第一轮引物为CEA A(5′TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG 3′)和CEA B(5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTAAGGAAGAAGC 3′)，反应条件：先94℃预热5min，接着94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，循环22次；第二轮扩增的引物为CEA B(5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′)和CEA C(5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG 3′)，反应条件同上述第一轮；反应后取扩增产物4～8μL在1.0％～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
11)三项指标联合检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移：对待检者按上述步骤依次检测外周静脉血中有核细胞的CK19 mRNA、CK20 mRNA和CEA mRNA，并将三项结果一并考察，只要其中任何一项为阳性，该待检者体内发生消化道肿瘤细胞微转移的可能性高达91.9％。如果三项检测都为阴性，则提示发生消化道肿瘤细胞微转移的可能性很小；
12)统计学计算：用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，消化道肿瘤按国际抗癌协会UICC的TNM标准进行分期，各期阳性率的比较采用x2检验，以P＜0.05作为显著性差异的判断标准。

2、  如权利要求1所述的早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法，其特征在于在步骤2)中，所述的试管为无菌试管。

3、  如权利要求1所述的早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法，其特征在于在步骤3)中，所述的离心是在温度为4℃的低温离心机中进行；所述的干净毛细管是指新的或高温灭菌过的毛细管。

4、  如权利要求1所述的早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法，其特征在于在步骤4)和步骤7)中，所述的EP管应经DEPC处理过幷灭菌；离心在4℃下试管呈水平状态进行。

5、  如权利要求1所述的早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法，其特征在于在步骤5)中，所述的离心应在4℃下试管呈水平状态进行；所用的无菌双蒸水要经DEPC处理过；所用的琼脂糖凝胶应以甲醛变性处理过。

6、  如权利要求1所述的早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法，其特征在于在步骤8)、9)和10)中，PCR扩增时要使用一次性无菌薄壁EP管，加EB以及电泳后挪动凝胶时要戴手套防护，在紫外灯下观察凝胶时要戴护目镜或直接置成像系统内观察和扫描；所谓巢式PCR指的是先用一对外引物对DNA模板进行PCR扩增，然后再以一对内引物对扩增产物进行PCR扩增的过程。

说明书早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法
技术领域
本发明涉及一种采用分子生物学手段综合三项指标，CK19 mRNA、CK20 mRNA及CEA mRNA，微量、准确、快速检测上皮性消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法。
背景技术
肿瘤转移是一系列具有内在联系的多个步骤相互作用的结果。来源于上皮的恶性肿瘤是临床最常见的恶性肿瘤，其致死的主要原因是肿瘤局部或区域的复发和远处转移。虽然临床可以应用外科手术进行治疗，但许多肿瘤患者，甚至相当部分早期患者仍出现肿瘤复发和转移。
微转移是指用常规临床病理学方法不能检出的非血液系统恶性肿瘤的转移(孙青.肿瘤的微转移及其检测.国外医学肿瘤学分册，1998，23(5)：279-282)，是离开原发病灶的癌细胞逃避免疫系统监控，侵犯血管，且常规检查方法难以发现，最终发展成肉眼可见的病变(张延龄.微转移的生物学行为和临床意义.国外医学外科学分册，2001，28(5)：267-268)。在血液中，因为常规方法不能检测出肿瘤细胞，所以一旦从血循环中检出肿瘤细胞，均可判断发生了肿瘤细胞微转移。
肿瘤细胞外周血微转移是肿瘤复发和转移的重要起始步骤，及时诊断肿瘤微转移有助于选择临床治疗方案及预后判断。当前确定肿瘤转移主要是依据常规病理切片的结果。有些患者虽然进行了根治手术，且淋巴结常规病理切片未见肿瘤细胞转移，但不久后仍出现肿瘤转移。所以仅仅根据常规病理切片来进行预后判断往往不够科学、不够准确。临床诊断亟需更灵敏、更准确的肿瘤细胞检测手段。
近年来科学家陆续发明了免疫组化技术、放射免疫导向手术检测方法、流式细胞术以及免疫磁选法等免疫学方法，都在一定程度上提高了肿瘤细胞检出的灵敏度。但目前最为灵敏的检测手段当推建立在PCR扩增基础上的分子生物学方法。
PCR技术可以在短短数小时内将目的DNA片段扩增几万到上百万倍，因此检测比较方便。PCR检测肿瘤细胞微转移可通过扩增这类细胞特异的异常DNA序列，或将肿瘤细胞特异表达的mRNA反转录成cDNA，再通过PCR的方法将其扩增和检测。
在消化道肿瘤细胞微转移检测时常用的分子生物学指标有：细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)和癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)。CK是一个多基因家族，约由20个成员组成，主要在上皮细胞表达。其中，CK19分子量为40kDa，酸性蛋白质，广泛分布于正常组织表面，如鳞状或层状上皮中。在恶性上皮细胞癌中，激活的蛋白酶加速了细胞的降解，导致大量CK分子进入血液中。因此CK19是诊断肿瘤细胞发生微转移很有价值的标志物，该指标具有较高灵敏度和特异性。
CK20分子量为48.6kDa，也是酸性蛋白质。其编码DNA总长18kb，转录生成的mRNA长1.75kb。CK20在上皮源性的肿瘤细胞中表达，具有严格的上皮特异性分布，主要分布在胃肠道黏膜上皮细胞、泌尿道伞状细胞、表皮Merk细胞以及舌味蕾细胞上，在外周血、骨髓和淋巴组织中无表达。CK20已经成为上皮性肿瘤诊断中一个非常有价值的检测指标。
CEA是一个分子量为180kDa的糖蛋白，由胃肠道肿瘤细胞以及某些低分化细胞合成。CEA作为胚胎性抗原，主要存在于胎儿消化道上皮组织、胰脏和肝脏等组织中。在成人，某些肿瘤细胞可分泌CEA于血液内和腹水内，是一种特异性较高的消化系统恶性肿瘤标记物，但其检出的阳性率偏低。由于CEA的mRNA几乎只存在于某些肿瘤细胞内，因此如果在血循环、骨髓、淋巴结及胸、腹水等处检测到CEA的mRNA，则提示发生了能表达CEA mRNA的肿瘤细胞的转移。
临床统计数字表明，在消化道肿瘤患者中，如果分别仅以患者外周血有核细胞检出CK19mRNA或CK20 mRNA或CEA mRNA阳性作为肿瘤细胞微转移的判别标准，可能会出现31％～45％的漏检率，这是因为多数肿瘤细胞只表达CK19 mRNA或CK20 mRNA或CEA mRNA中的一项或两项的缘故。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用分子生物学手段综合CK19 mRNA、CK20 mRNA和CEA mRNA三项指标，可微量、准确、快速检测上皮性消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法。
本发明同时对被检者的外周血有核细胞中可能存在的CK19 mRNA、CK20 mRNA和CEA mRNA三项指标都进行反转录，再经巢式PCR扩增和电泳分析，只要其中一项检测呈现阳性反应，则提示被检者存在肿瘤细胞微转移的高度风险，从而把肿瘤细胞微转移的检出率提高到91.9％-92.1％。
本发明的具体步骤如下：
1)采血：抽取外周静脉血3～5mL，注入含肝素钠的洁净试管中；
2)准备离心：取步骤1)所得的肝素抗凝静脉血与Hank氏液等量混匀，分别在两支试管中加入2～4mL的淋巴细胞分离液，再将上述混合液5～10mL叠加于淋巴细胞分离液的液面上；
3)获取血液中的有核细胞：将步骤2)中的试管经2000～2500g水平离心15～20min后溶液分为3层，上层为血浆和Hank氏液，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞，在上、中层界面处有一以有核细胞为主的白色狭窄带，用干净毛细管插到该白色狭窄带层，吸出有核细胞，并移入试管中，加入1～5mL Hank氏液，洗涤细胞，1500～2000g水平离心10～15min，弃上清液；
4)提取总RNA：在已经洗涤过的有核细胞沉淀中加入Trizol试剂1～5mL，消化3～5min；将细胞裂解液吸到EP管中，加氯仿0.2～1.0mL，轻摇15～60s，室温静置5～10min，10000～12000g离心10～15min，取上清无色水相液到EP管中，加异丙醇0.5～1.5mL，静置10～20min，10000～12000g离心10～15min，弃上清，在管底见微量白色总RNA沉淀；
5)RNA检测：用无水乙醇洗涤RNA沉淀后，10000～12000g离心5～10min，吸尽上清液，在超净台中以无菌风吹干残余乙醇，加入无菌双蒸水10～20μL，打匀，55～60℃水浴10-20min溶解总RNA，测OD260和OD280值，检测其纯度，在琼脂糖凝胶中电泳，鉴定所提取RNA的完整性；
6)若OD260/OD280比值＞1.8，说明RNA的纯度较高，则进入后续实验；若OD260/OD280比值＜1.8，说明RNA的纯度不够，应重复步骤4)，直至符合要求即OD260/OD280比值＞1.8为止；若在琼脂糖凝胶电泳中至少能见到两条界限分明的RNA带，说明RNA质量较高，降解较少，否则应重新提取总RNA；
7)cDNA第一链的合成：取上述总RNA 1～5μL于EP管中，70℃水浴10min，在冰浴中依次加入：Oligo(dT)15引物1μL，10×缓冲液2μL，dNTPs 2μL，RNasin 0.5μL，AMV反转录酶4.3μL(3.5u/μL)，双蒸水5.2～9.2μL，混匀，整个反应体系移42℃孵育15min，接着95℃5min，最后0～5℃5min，经反转录获得各种cDNA的第一链；
8)CK19 cDNA的巢式PCR扩增：对CK19的cDNA第一链进行巢式PCR扩增和检测的第一轮扩增体系包括：反转录产物3～5μL，无菌双蒸水11.8～13.8μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 A(5′GAGGTGGATTCCGCTCCGGGCA 3′)和CK19 B(5′ATCTTCCTGTCCCTCGAGCAG 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL；反应条件如下：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环40次；第一轮PCR扩增后立即进行第二轮PCR扩增，反应体系包括：第一轮PCR扩增产物0.5μL，无菌双蒸水16.3μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 C(5′CGAGCAGAACCGGAA3′)和CK19 D(5′TGAGCCG CTGGTACTCCTGAT 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL，第2轮PCR扩增除退火温度为52℃外，其余反应条件同第一轮反应。取上述巢式第二轮PCR扩增产物4～8μL在1.0％～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记阳性或阴性结果并与临床分期和病理结果进行比对；
9)CK20 cDNA的巢式PCR扩增：CK20巢式PCR扩增的体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增，第一轮扩增引物为CK20 A(5′CAGACACACGGTGAACTATGG 3′)和CK20 B(5′GATCAGCTTCCACTGTTAGACG 3′)。反应条件：94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸30s，循环35次；第二轮扩增引物为CK20 C(5′CTGTTTGTTGG CAATGAGAAAATGG 3′)和CK20 D(5′GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT3′)，退火温度为62℃ 1min，72℃延伸30s，循环35次；扩增后取扩增产物4～8μL在1.0～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
10)对CEA的cDNA第一链进行巢式PCR扩增：CEA巢式PCR扩增地体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增，其第一轮引物为CEA A(5′TCTGGAACTTCCCTGGTCTCTCAGCTGG 3′)和CEA B(5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTAAGGAAGAAGC 3′)，反应条件：先94℃预热5min，接着94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，循环22次；第二轮扩增的引物为CEA B(5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′)和CEA C(5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG 3′)，反应条件同上述第一轮；反应后取扩增产物4～8μL在1.0％～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
11)三项指标联合检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移：对待检者按上述步骤依次检测外周静脉血中有核细胞的CK19 mRNA、CK20 mRNA和CEA mRNA，并将三项结果一并考察，只要其中任何一项为阳性，该待检者体内发生消化道肿瘤细胞微转移的可能性高达91.9％。如果三项检测都为阴性，则提示发生消化道肿瘤细胞微转移的可能性很小；
12)统计学计算：用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，消化道肿瘤按国际抗癌协会UICC的TNM标准进行分期，各期阳性率的比较采用x2检验，以P＜0.05作为显著性差异的判断标准。
在步骤1)中，所说的洁净试管，指的是山东威高集团医用高分子制品股份有限公司生产的含肝素钠的试管。
在步骤2)中，所说的试管为无菌试管。
在步骤3)中，所说的离心是在温度为4℃的低温离心机中进行；所说的干净毛细管是指新的或高温灭菌过的毛细管。
在步骤4)和步骤7)中，所说的EP管应经DEPC(一种抑制RNA酶的试剂)处理过并灭菌；离心要在4℃下试管呈水平状态进行。
在步骤5)中，所说的离心应在4℃下试管呈水平状态进行；所用的无菌双蒸水要经DEPC处理过；所用的琼脂糖凝胶应以甲醛变性处理过。
在步骤8)、9)和10)中，PCR扩增时要使用一次性无菌薄壁EP管，加EB以及电泳后挪动凝胶时要戴手套防护，在紫外灯下观察凝胶时要戴护目镜或直接置成像系统内观察和扫描；所谓巢式PCR指的是先用一对外引物对DNA模板进行PCR扩增，然后再以一对内引物对扩增产物进行PCR扩增的过程。
本发明首次将CK19 mRNA、CK20 mRNA和CEA mRNA三项指标同时用于消化道肿瘤细胞的微转移检测，结合采用高度灵敏的反转录巢式PCR方法，大大提高了肿瘤细胞微转移诊断的灵敏性和准确性，对临床判断肿瘤患者的病情和制定治疗方案具有重要指导意义，同时将有利于延长患者的生命，提高其生活质量。
附图说明
图1为外周血有核细胞总RNA提取后的电泳图。在图1中，可见清晰的28S和18S两条RNA带以及较模糊的5S RNA带。由于5S RNA分子量小，所结合的EB也较少，因此显得较模糊。由图1说明，采用本发明提取到的RNA分子质量较高，降解较少，符合实验要求。
图2为CK19 cDNA经巢式PCR扩增所得产物的电泳图。在图2中，左侧第一栏为DNA分子量标志物，第1、2、4和5栏可见分子量为319bp的CK19 cDNA带；第3和第6栏样品的反应为阴性，未见cDNA带。
图3为CK20 cDNA经巢式PCR扩增所得产物的电泳图。在图3中，左侧第一栏为DNA分子量标志物，第1、2、3、4和6栏可见分子量为303bp的CK20 cDNA带；第5栏样品的反应为阴性，未见cDNA带。
图4为CEA cDNA经巢式PCR扩增所得产物的电泳图。在图4中，左侧第一栏为DNA分子量标志物，第1、2、4和6栏可见分子量为131bp的CEA cDNA带；第3和第5栏样品的反应为阴性，未见cDNA带。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步说明。
实施例1：以CK19 mRNA、CK20 mRNA及CEA mRNA联合早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的技术体系如下：
1.以锋利的针具从被检者的静脉抽取3mL血液于肝素钠试管中，摇匀；
2.取上述肝素抗凝静脉血3mL与等量Hank氏液混匀；分别在两支10mL试管中加入适量(约2mL)淋巴细胞分离液，再沿试管壁将上述混合液缓慢叠加于淋巴细胞分离液的液面上；
3.以2 000g离心20min。离心后溶液分为三层，上层为血浆和Hank氏液，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞。在上、中层界面处有一以有核细胞为主的白色狭窄带。用毛细血管插到该层，吸出有核细胞，十分小心地吸出并移入5mL试管中，加入1mL Hank氏液洗涤细胞，摇匀，1 500g离心15min，重复一次；
4.在已经洗涤过的有核细胞中沉淀中加入Trizol试剂1mL，摇匀，消化3min。将细胞裂解液吸到1.5mL EP管中，加氯仿0.2mL，轻摇15s。室温静置5min，10 000g离心15min。取上清无色水相到EP管，加0.5mL异丙醇，室温静置10min。10 000g离心15min。弃上清，在管底见少量白色总RNA沉淀；
5.用无水乙醇1.0mL洗涤沉淀后，10 000g，离心10min。吸尽上清，在超净台中以无菌风吹干残余乙醇，加入无菌双蒸水10μL，打匀，55℃水浴10min溶解总RNA，测OD260和OD280值，检测其纯度。在琼脂糖凝胶中电泳，鉴定所提取RNA的完整性。如果OD260/OD280比值＞1.8，说明RNA的纯度较高，可以进入后续实验；如果OD260/OD280比值＜1.8，说明RNA的纯度不够，应重复步骤4，直至符合要求为止；如果在琼脂糖凝胶电泳中至少能见到两条界限分明的RNA带(参见附图1)，说明RNA质量较高，降解较少，可用于以下实验，否则应重新提取；
6.获取各种cDNA的第一链，取RNA 1μL(约1μg)于EP管中，70℃水浴10min，接着立即放入冰水混和液(0℃)中。在冰浴中依次加入：Oligo(dT)15引物1μL，10×缓冲液2μL，dNTPs 2μL，RNasin 0.5μL，AMV 4.3μL(3.5u/μL)，DEPC处理过的双蒸水9.2μL。整个反应体系20μL。反应开始，42℃ 15min，95℃ 5min，最后40℃ 5min。经反转录获得各种cDNA的第一链；
7.对CK19的cDNA第一链进行巢式PCR扩增和检测  本反应第一轮扩增体系包括：3μL反转录产物，无菌双蒸水13.8μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 A(5′GAGGTGGATTCCGCTCCGGGCA 3′)和CK19 B(5′ATCTTCCTGTCCC TCGAGCAG 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，tAq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL；反应条件如下：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环40次；第一轮PCR扩增后立即进行第二轮PCR扩增。反应体系包括：第一轮PCR扩增产物0.5μL，无菌双蒸水16.3μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 C(5′CGAGCAGAACCGGAA 3′)和CK19D(5′TGAGCCG CTGGTACTCCTGAT 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL。第2轮PCR扩增除退火温度为52℃外，其余同第一轮反应。取上述巢式第二轮PCR扩增产物4μL在1％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并扫描成像(参见图2)，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
8.消化道肿瘤患者外周血CK19 mRNA反转录检测结果  113例消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK19 mRNA检测的结果表明，其阳性率为54.9％(62/113)。如果只取前75例患者，则其阳性率降至53.3％；
9.消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK19 mRNA与临床病理之间的关系  经检测(参见表1)，I-II期消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK19 mRNA阳性率为31.5％，III-IV期患者的阳性率提高到76.2％，二者差异显著(P＜0.05)；无淋巴结转移的消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK19mRNA阳性率为24.0％，有淋巴结转移者的阳性率为79.3％，二者有显著性差异(P＜0.05)。可见，中晚期肿瘤患者和有淋巴结转移患者CK19 mRNA阳性的检出率显著提高，但至少还有21-24％的漏检率。
     表1  外周血有核细胞CK19 mRNA表达与消化道肿瘤临床病理的关系       临床病理因素  例数  阳性例数  阳性率(％)  P值  消化道肿瘤  临床分期  I-II  54  17  31.5  ＜0.05  III-IV  59  45  76.2  淋巴结转移  无  50  12  24.0  ＜0.05  有  63  50  79.3
10.CK20 cDNA的巢式PCR扩增：CK20巢式PCR扩增的体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增。第一轮扩增引物为CK20 A(5′CAGACACACGGTGAACTATGG 3′)和CK20 B(5′GATCAGCTTCCACTGTTAGACG 3′)。反应条件：94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸30s，循环35次；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，引物为CK20 C(5′CTGTTTGTTGGCAATGAGAAAATGG 3′)和CK20 D(5′GTATTCCTCTCTCAG TCTCATACT 3′)，退火温度为62℃ 1min，72℃延伸30s，循环35次；扩增后取扩增产物4μL在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
11.消化道肿瘤患者外周血CK20 mRNA反转录检测结果  113例消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK20mRNA检测的结果表明，其阳性率为60.2％(68/113)。如果只取前75例患者，则其阳性率降至57.3％；
12.消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK20 mRNA与临床病理之间的关系  检测结果表明(参见表2)，I-II期消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK20 mRNA阳性率为35.2％，III-IV期阳性率达83.1％，二者有显著性差异(P＜0.05)；无淋巴结转移消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK20 mRNA阳性率为32.0％，有淋巴结转移者的阳性率为82.5％，二者差异显著(P＜0.05)；可见，中晚期肿瘤患者和有淋巴结转移患者CK20 mRNA阳性的检出率显著提高，但至少还有16.9％-17.5％的漏检率；
      表2  外周血有核细胞CK20 mRNA表达与消化道肿瘤临床病理的关系       临床病理因素  例数  阳性例数  阳性率(％)  P值  消化道肿瘤  临床分期  I-II  54  19  35.2  ＜0.05  III-IV  59  49  83.1  淋巴结转移  无  50  16  32.0  ＜0.05  有  63  52  82.5
13.对CEA的cDNA第一链进行巢式PCR扩增  CEA巢式PCR扩增的体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增。其第一轮引物为CEA A(5′TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG 3′)和CEAB(5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC 3′)。反应条件：先94℃预热5min，接着94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，循环22次；第二轮扩增时以第一轮扩增的产物为模板，引物为CEA B(5′TGTAGCTGTTGCAA ATGCTTTAAGGAAGAAGC 3′)和CEAC(5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG 3′)，反应条件同上述第一轮；反应后取扩增产物4μL在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并扫描成像(参见图4)，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
14.消化道肿瘤患者外周血CEA mRNA反转录检测结果  38例消化道肿瘤患者外周血有核细胞CEA mRNA检测的阳性率68.4％(26/38)。本结果提示，本检测体系可能存在约32％的漏检率；
15.消化道肿瘤患者外周血有核细胞CEA mRNA与临床病理之间的关系  检测结果表明(参见表3)，I-II期消化道肿瘤患者外周血有核细胞CEA mRNA阳性率为56.2％，III-IV期阳性率77.3％，二者有显著性差异(P＜0.05)；无淋巴结转移消化道肿瘤患者外周血CEA mRNA阳性率为46.7％，有淋巴结转移其阳性率为82.6％，二者有显著性差异(P＜0.05)。可见，中晚期肿瘤患者和有淋巴结转移患者CEA mRNA阳性的检出率显著提高，但至少还有17.4％-22.7％的漏检率；
        表3  外周血有核细胞CEA mRNA表达与消化道肿瘤临床病理关系      临床病理因素  例数  阳性例数  阳性率(％)  P值  消化道肿瘤  临床分期  I-II  16  9  (56.2％)  ＜0.05  III-IV  22  17  (77.3％)  淋巴结转移  无  15  7  (46.7％)  ＜0.05  有  23  19  (82.6％)
16.三项指标联合检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移  抽取未经治疗的75例消化道肿瘤患者外周血联合检测CK19 mRNA和CK20 mRNA(以其中一项阳性即为阳性，参见表4)，可将对消化道肿瘤微转移诊断的准确性由CK19 mRNA单个指标检测的53.3％和CK20 mRNA单个指标检测的57.3％，提高到80.1％。进一步，在38例未经治疗的消化道肿瘤患者外周血中，CK19 mRNA、CK20 mRNA以及CEA mRNA三项联合检测(以其中一项阳性即为阳性)，可将对消化道肿瘤细胞微转移诊断的准确性进一步提高到91.9％；
          表4.消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK19 mRNA、CK20 mRNA
                        以及CEA mRNA联合检测结果  肿瘤类型        CK19 mRNA        CK20 mRNA      CEA mRNA  +  -  +  -  +  -  食管癌  胃癌  大肠癌  21  18  23  15  17  19  23  20  25  15  14  16  11  5  10  4  2  6  合计          113          113         38  百分数(％)  54.9  45.1  60.2  39.8  68.4  31.6
注：+，阳性结果；-，阴性结果；因为CEA mRNA指标是在试验后期才增加的，所以例数较少。
17.对照组  以健康献血者的外周血为阴性对照，以上述巢式PCR扩增体系分别检测它们的CK19、CK20和CEA反应。检测结果表明，25例健康献血者外周血CK19 mRNA的阳性率为4.0％(1/25)，CK20 mRNA以及CEA mRNA的阳性率均为零，可见本检测体系的假阳性率是很低的(25人的75项检测仅1次为假阳性，约为1.3％)。以消化道肿瘤组织为阳性对照，以上述巢式PCR扩增体系分别检测它们的CK19、CK20和CEA反应。检测结果表明，15例肿瘤组织的CK19 mRNA、CK20 mRNA以及CEA mRNA的阳性率分别为93.3％(14/15)、100％和100％。可见本检测体系的假阴性率是很低的(15例肿瘤组织的45项检测仅1次为假阴性，假阴性率约为2.2％)。因此我们认为，这三项指标本身作为癌细胞特异性检测是可以成立的。不过如果独立地以外周血有核细胞检出CK19 mRNA或CK20 mRNA或CEA mRNA阳性作为肿瘤细胞微转移的判别标准是不够的，可能会出现31-45％的漏检率。
实施例2：
与实施例1类似，其区别在于以CK19 mRNA、CK20 mRNA及CEA mRNA联合早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移时，其技术路线如下：
1.以锋利的针具从被检者的外周静脉抽取5mL血液于肝素钠试管中，摇匀；
2.取上述肝素抗凝静脉血5mL与等量Hank氏液混匀；分别在两支10mL试管中加入适量(约4mL)淋巴细胞分离液，再沿试管壁将上述混合液缓慢叠加于淋巴细胞分离液的液面上；
3.以2500g离心15min，离心后溶液分为三层，上层为血浆和Hank氏液，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞。在上、中层界面处有一以有核细胞为主的白色狭窄带。用毛细血管插到该层，吸出有核细胞，十分小心地吸出并移入5mL试管中，加入5mL Hank氏液洗涤细胞，摇匀，2000g离心10min，重复一次；
4.在已经洗涤过的有核细胞中沉淀中加入Trizol试剂5mL，摇匀，消化5min。将细胞裂解液吸到1.5mL EP管中，加氯仿1.0mL，轻摇60s。室温静置10min，12 000g离心10min。取上清无色水相到EP管，加1.5mL异丙醇，室温静置20min。12 000g离心5min。弃上清，在管底见少量白色总RNA沉淀；
5.用无水乙醇1.0mL洗涤沉淀后，10 000g，离心10min。吸尽上清，在超净台中以无菌风吹干残余乙醇，加入无菌双蒸水20μL，打匀，60℃水浴20min溶解总RNA，测OD260和OD280值，检测其纯度。在琼脂糖凝胶中电泳，鉴定所提取RNA的完整性。如果OD260/OD280比值＞1.8，说明RNA的纯度较高，可以进入后续实验；如果OD260/OD280比值＜1.8，说明RNA的纯度不够，应重复步骤4，直至符合要求为止；如果在琼脂糖凝胶电泳中至少能见到两条界限分明的RNA带，说明RNA质量较高，降解较少，可用于以下实验，否则应重新提取；
6.获取各种cDNA的第一链
取RNA 5μL(约5μg)于EP管中，70℃水浴10min，接着立即放入冰水混和液(0℃)中。在冰浴中依次加入：Oligo(dT)15引物1μL，10×缓冲液2μL，dNTPs 2μL，RNasin0.5μL，AMV 4.3μL(3.5u/μL)，DEPC处理过的双蒸水5.2μL。整个反应体系20μL。反应开始，42℃ 15min，95℃ 5min，最后5℃ 5min。经反转录获得各种cDNA的第一链；
7.对CK19的cDNA第一链进行巢式PCR扩增和检测
本反应第一轮扩增体系包括：5μL反转录产物，无菌双蒸水11.8μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 A(5′GAGGTGGATTCCGCTCCGGGCA 3′)和CK19 B(5′ATCTTCCTGTCCC TCGAGCAG 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL；反应条件如下：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环40次；第一轮PCR扩增后立即进行第二轮PCR扩增。反应体系包括：第一轮PCR扩增产物0.5μL，无菌双蒸水16.3μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 C(5′CGAGCAGAACCGGAA 3′)和CK19 D(5′TGAGCCG CTGGTACTCCTGAT 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL。第2轮PCR扩增除退火温度为52℃外，其余同第一轮反应。取上述巢式第二轮PCR扩增产物8μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
8.消化道肿瘤患者外周血CK19 mRNA反转录检测结果
102例未经治疗的消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK19 mRNA检测的结果表明，其阳性率为53.9％；本结果提示，本检测体系可能存在46.1％的漏检率；
9.消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK19 mRNA检出与临床病理之间的关系
经检测，I-II期消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK19 mRNA阳性率为31.0％，III-IV期患者的阳性率提高到75.8％，二者差异显著(P＜0.05)；无淋巴结转移的消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK19 mRNA阳性率为24.3％，有淋巴结转移者的阳性率为79.1％，二者有显著性差异(P＜0.05)。可见，中晚期肿瘤患者和有淋巴结转移患者CK19 mRNA阳性的检出率显著提高，但至少还有20.9-24.2％的漏检率。
10.CK20 cDNA的巢式PCR扩增
CK20巢式PCR扩增的体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增。第一轮扩增引物为CK20A(5′CAGACACACGGTGAACTATGG 3′)和CK20B(5′GATCAGCTTCCACTGTTAGACG 3′)。反应条件：94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸30s，循环35次；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，引物为CK20 C(5′CTGTTTGTTGGCAATGAGAAAATGG 3′)和CK20 D(5′GTATTCCTCTCTCAG TCTCATACT 3′)，退火温度为62℃ 1min，72℃延伸30s，循环35次；扩增后取扩增产物8μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
11.消化道肿瘤患者外周血CK20 mRNA反转录检测结果
102例未经治疗的消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK20 mRNA检测的结果表明，其阳性率为58.2％；本结果提示，本检测体系可能存在41.8％的漏检率；
12.消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK20 mRNA与临床病理之间的关系
检测结果表明，I-II期消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK20mRNA阳性率为36.1％，III-IV期阳性率达81.9％，二者有显著性差异(P＜0.05)；无淋巴结转移消化道肿瘤患者外周血有核细胞CK20 mRNA阳性率为32.9％，有淋巴结转移者的阳性率为80.4％，二者差异显著(P＜0.05)；可见，中晚期肿瘤患者和有淋巴结转移患者CK20 mRNA阳性的检出率显著提高，但至少还有18.1-19.6％的漏检率；
13.对CEA的cDNA第一链进行巢式PCR扩增
CEA巢式PCR扩增的体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增。其第一轮引物为CEA A(5′TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG 3′)和CEA B(5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′)。反应条件：先94℃预热5min，接着94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，循环22次；第二轮扩增时以第一轮扩增的产物为模板，引物为CEA B(5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC 3′)和CEA C(5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG 3′)，反应条件同上述第一轮；反应后取扩增产物8μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；
14.消化道肿瘤患者外周血CEA mRNA反转录检测结果
102例未经治疗的消化道肿瘤患者外周血有核细胞CEA mRNA检测的阳性率67.8％。本结果提示，本检测体系可能存在约32.2％的漏检率；
15.消化道肿瘤患者外周血有核细胞CEA mRNA检出与临床病理之间的关系
检测结果表明，I-II期消化道肿瘤患者外周血有核细胞CEA mRNA阳性率为55.2％，III-IV期阳性率77.8％，二者有显著性差异(P＜0.05)；无淋巴结转移消化道肿瘤患者外周血CEA mRNA阳性率为45.8％，有淋巴结转移其阳性率为81.5％，二者有显著性差异(P＜0.05)。可见，中晚期肿瘤患者和有淋巴结转移患者CEA mRNA阳性的检出率显著提高，但至少还有18.5-22.2％的漏检率；
16.三项指标联合检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移
联合考察上述102例未经治疗的消化道肿瘤患者外周血CK19 mRNA和CK20 mRNA检出率(其中一项阳性即为阳性)，可将对消化道肿瘤微转移诊断的准确性由CK19 mRNA单个指标检测的53.9％和CK20 mRNA单个指标检测的58.2％提高到78.9％。再进一步，一并考察这102例未经治疗的消化道肿瘤患者外周血中CK19 mRNA、CK20 mRNA以及CEA mRNA三项指标的总检出率(其中一项检测阳性即为阳性)，可将对消化道肿瘤细胞微转移诊断的准确性进一步提高到92.2％。
17.对照组
以健康献血者的外周血为阴性对照，以上述巢式PCR扩增体系分别检测它们的CK19、CK20和CEA反应。检测结果表明，健康献血者外周血CK19 mRNA的阳性率为4.0％，CK20mRNA以及CEA mRNA的阳性率均为零，可见本检测体系的假阳性率是很低的。以消化道肿瘤组织为阳性对照，以上述巢式PCR扩增体系分别检测它们的CK19、CK20和CEA反应。检测结果表明，肿瘤组织的CK19 mRNA、CK20 mRNA以及CEA mRNA的阳性率分别为93.3％、100％和100％。可见本检测体系的假阴性率是很低的。因此可以认为，这三项指标本身作为癌细胞特异性检测是可以成立的。不过如果独立地以外周血有核细胞检出CK19 mRNA或CK20mRNA或CEA mRNA阳性作为肿瘤细胞微转移的判别标准是不够的，可能会出现32.2-46.1％的漏检率。