花生Β酮脂酰ACP合成酶Ⅱ基因及其编码蛋白质.pdf

本发明公开了以花生为材料，通过RACE方法，获得的β-酮脂酰-ACP合成酶IIcDNA序列以及通过生物信息学方法分析及预测其编码蛋白的性质。本发明将为以后研究该基因的表达以及通过提高该基因的表达改良花生品质奠定基础。

权利要求书
1.  一种花生β-酮脂酰-ACP合成酶II基因，其特征在于，它具有SEQ IDNO：1的序列。

2.  一种实现权利要求1的花生β-酮脂酰-ACP合成酶II基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.设计引物：根据NCBI数据库中的序列信息设计目的基因的简并引物Kas-5A(5′-ATGGGTTCTGCTATGCTTGC-3′)和Kas-3A(5′-ACCACCAAACCCGAATGAAT-3′)；
B.花生总RNA的获得：以SPI056花生种子作为实验材料，采用Pbiozol植物组织RNA提取试剂盒提取花生种子中的总RNA，RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；
C.目的基因cDNA片段的获取：以获得的总RNA为模板，采用SMARTTMRACE Amplification Kit(Clontech)，反转录合成5’-和3’-RACE-Ready cDNA，以5’-RACE-Ready cDNA为模板，进行目的基因片段的PCR扩增。反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，53℃复性50s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min；
D.目的基因片段的克隆及测序：PCR产物回收后与pMD18-T simple vector连接，连接产物转化E.coli Top 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序。根据测得的基因基因片段序列设计5’和3’端cDNA片段引物，分别为GSP1(5′-GCAAAACTCCAGCCCCTTCACCCAT-3′)和GSP2(5′-ATGGGTGAAGGGGCTGGAGTTTTGC-3′)，利用SMARTTM RACEAmplification Kit(Clontech)扩增目的基因5’和3’端基因片段。获得的PCR产物按前述进行操作并测序；
E.目的基因全序列的获得：将测得目的基因片段序列及5’和3’端序列进行拼接后得到目的全长基因序列，根据拼接得到的全长基因序列设计全长基因的扩增引物Rkas-5(5′-TGGCTTTCTCTTCTGCCTTTGC-3′)和Rkas-3(5′-CAATCTATGGTCTTCTCCTGG-3′)；扩增反应如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃复性60s，72℃延伸2min，30个循环后，72℃10min，按上述D进行操作并测序，得到目的全长基因及序列。

3.  一种编码权利要求1的花生β-酮脂酰-ACP合成酶II，其特征在于，它具有SEQ ID NO：2的序列。

4.  一种编码权利要求1的花生β-酮脂酰-ACP合成酶II，其特征在于，它含一个Kas II活性位点，分子量为43181.4，等电点为5.69，为非分泌蛋白，呈紧密的球状结构。

5.  如权利要求3所述的β-酮脂酰-ACP合成酶II，其特征在于，其编码序列由DNAssist软件分析所得。

6.  如权利要求4所述的β-酮脂酰-ACP合成酶II，其特征在于，其Kas II活性位点为根据PROSITE数据库分析所得，分子量和等电点由Protparam预测所得，非分泌蛋白和呈紧密的球状结构特点分别由软件SignalP 3.0 Server和TMHMM2 program预测而得。

说明书花生β-酮脂酰-ACP合成酶II基因及其编码蛋白质
技术领域
本发明涉及生物技术，特别涉及花生β-酮脂酰-ACP合成酶II基因及其分离的方法，以及通过生物信息学方法分析和预测其编码蛋白的功能部位和理化性质。
背景技术
β-酮脂酰-ACP合成酶II是催化16:0-ACP到18:0-ACP，即从棕榈酸到硬脂酸转化过程的关键酶，并且在不同植物组织以及不同发育阶段都起着重要的调控作用，也是植物胚胎发育所必需的酶类(Halozaki H.，Park J.，Endo M.et al.Expression and development function of the 3-ketoacyl-ACP synthase2 gene inArabidopsis thaliana[J].Genes Genet.Syst，2008，83：143-152)。目前已从拟南芥、甘蓝型油菜、大豆等多种植物中获得β-酮脂酰-ACP合成酶II基因片段(Carlsson，A.S.，LaBrie，S.T.，Kinney，A.J.，et al.A KAS2 cDNA complements thephenotypes of the Arabidopsis fabl mutant that differs in a single residue borderingthe substrate binding pocket[J].Plant Journal 2002，29(6)，761-770)；Aghoram，K.and Dewey，R.E.A mutation in a 3-Keto-Acyl-Acyl Carrier Protein Synthase II(KASII)Gene is Associated with Elevated Palmitate Levels in SoybeanLines Carrying thefap2 Mutation[J].unpublished；Kinney，A.J.Acyl-ACP condensing enzymes fromcanola[J].unpublished)。但目前国内外对此基因的相关研究很少，花生中尚没有此基因的相关报道。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5′和3’末端的有效方法。本发明采用RACE技术首次获得了花生籽粒中β-酮脂酰-ACP合成酶II全长基因。同时，通过生物信息学方法对其编码蛋白质的性质进行预测，为下一步该基因在花生中的表达研究以及通过提高该基因表达量改良花生品质的研究奠定了基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种花生β-酮脂酰-ACP合成酶II基因及其分离方法。
本发明所提供的β-酮脂酰-ACP合成酶II，从花生(Arachis hypogaea)中克隆，命名为AhKAS II基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
上述花生β-酮脂酰-ACP合成酶II(AhKAS II)的克隆方法，包括如下步骤：
A.设计引物：根据NCBI数据库中的序列信息设计目的基因的简并引物Kas-5A(5′-ATGGGTTCTGCTATGCTTGC-3′)和Kas-3A(5′-ACCACCAAACCCGAATGAAT-3′)。
B.花生总RNA的获得：以SPI056花生种子作为实验材料，采用Pbiozol植物组织RNA提取试剂盒提取花生种子中的总RNA。RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；
C.目的基因cDNA片段的获取：以获得的总RNA为模板，采用SMARTTMRACE Amplification Kit(Clontech)，反转录合成5’-和3’RACE-Ready cDNA。以5’-RACE-Ready cDNA为模板，进行目的基因片段的PCR扩增。反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，53℃复性50s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min；
D.目的基因片段的克隆及测序：PCR产物回收后与pMD18-T simple vector连接，连接产物转化E.coli Top 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序。根据测得的基因基因片段序列设计5’和3’端cDNA片段引物，分别为GSP1(5′-GCAAAACTCCAGCCCCTTCACCCAT-3′)和GSP2(5′-ATGGGTGAAGGGGCTGGAGTTTTGC-3′)。利用SMARTTM RACEAmplification Kit(Clontech)扩增目的基因5’和3’端基因片段。获得的PCR产物按前述进行操作并测序。
E.目的基因全序列的获得：将测得目的基因片段序列及5’和3’端序列进行拼接后得到目的全长基因序列。根据拼接得到的全长基因序列设计全长基因的扩增引物Rkas-5(5′-TGGCTTTCTCTTCTGCCTTTGC-3′)和Rkas-3(5′-CAATCTATGGTCTTCTCCTGG-3′)。扩增反应如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃复性60s，72℃延伸2min，30个循环后，72℃10min。按上述D进行操作并测序，得到目的全长基因及序列。
本发明的第二个目的是提供花生β-酮脂酰-ACP合成酶II编码的氨基酸序列及编码蛋白性质的生物信息学预测。
上述花生β-酮脂酰-ACP合成酶II编码的蛋白质，命名为AhKAS II蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明公开了花生β-酮脂酰-ACP合成酶II(AhKAS II)基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质。β-酮脂酰-ACP合成酶II是催化16:0-ACP到18:0-ACP，即从棕榈酸到硬脂酸转化过程的关键酶，该酶活性的提高可以减少花生中棕榈酸的含量，从而提高花生的品质，增强花生的保健作用。
本发明公开的花生β-酮脂酰-ACP合成酶II(AhKAS II)基因及其所编码的蛋白质来自花生(Arachis hypogaea)，其超量表达，可降低花生中有害脂肪酸—棕榈酸的含量，从而实现对花生品质的改良。
附图说明
图1为位于147-163aa的Kas II活性位点；
图2为AhKAS II蛋白三级结构。
具体实施方式
实施例1
花生β-酮脂酰-ACP合成酶II(AhKAS II)基因的分子克隆
选用SPI056花生种子作为实验材料，采用Pbiozol植物组织RNA提取试剂盒提取花生种子中的总RNA。以获得的总RNA为模板，采用SMARTTMRACE Amplification Kit(Clontech)，反转录合成5’-和3’RACE-Ready cDNA。根据NCBI数据库中的序列信息设计花生AhKAS II基因的简并引物Kas-5A(5′-ATGGGTTCTGCTATGCTTGC-3′)和Kas-3A(5′-ACCACCAAACCCGAATGAAT-3′)。以5’-RACE-Ready cDNA为模板，进行花生AhKAS II基因片段的PCR扩增。PCR产物经回收、连接、转化后，采用蓝白斑法筛选阳性克隆并测序。根据测得的AhKAS II基因片段序列设计5’和3’端基因片段引物，分别为GSP1(5′-GCAAAACTCCAGCCCCTTCACCCAT-3′)和GSP2(5′-ATGGGTGAAGGGGCTGGAGTTTTGC-3′)。利用SMARTTMRACE Amplification Kit(Clontech)扩增AhKAS II基因5’和3’端基因片段并测序。将测得的花生AhKAS II基因片段序列及5’和3’端序列进行拼接后得到花生AhKAS II全长基因序列。根据拼接得到的全长基因序列设计全长基因的扩增引物Rkas-5(5′-TGGCTTTCTCTTCTGCCTTTGC-3′)和Rkas-3(5′-CAATCTATGGTCTTCTCCTGG-3′)。经PCR扩增、克隆及测序得到AhKASII全长基因及序列。
实施例2
AhKAS II的序列信息与特性分析
本发明的AhKAS II基因全长1867bp，开放阅读框为1212bp，位于304-1515aa。DNAssist软件分析表明AhKAS II共编码404个氨基酸。根据PROSITE数据库分析花生AhKAS II基因编码的404个氨基酸，发现此序列含一个Kas II活性位点，位于147-163aa(USERSEQ1，GPNysIStACATSnfCI)(图1)。另外还包含5种其它功能位点，分别蛋白激酶C磷酸化位点(Proteinkinase C phosphorylation site，PS00005)，酰胺化位点(Amidation site，PS00009)，N-端十四烷酰化位点(N-myristoylation site，PS00008)，N-端糖基化位点(N-glycosylation site，PS00001)，酪蛋白激酶II磷酸化位点(Casein kinase IIphosphorylation site，PS00006)。
用Protparam预测编码蛋白的物理化学性质，推测分子式为C1905H3004N518O574S26，分子量为43181.4，等电点为5.69，理论推导半衰期为30h，不稳定参数是38.36，属于稳定蛋白。该蛋白中含量相对较多的氨基酸是Ala(10.4％)，Glu(10.4％)，Leu(8.2％)，Ser(7.2％)，Ile(6.9％)；该蛋白中不含Pyl和Sec。总的带正电荷的残基为(Arg+Lys)：36；总的带负电荷的残基为(Asp+Glu):45。该蛋白亲水性平均数为0.002，预测该蛋白为疏水性蛋白。采用SignalP3.0Server进行信号肽预测，表明该蛋白不含信号肽序列，为非分泌性蛋白。以TMHMM2 program为基础的跨膜结构预测表明该蛋白不含跨膜结构。
采用PredictProtein预测花生AhKAS II蛋白的二级结构，表明该蛋白含有41.58％的-螺旋，8.91％的-折叠以及49.50％的无规则卷曲。利用3D-JIGSAW预测花生AhKAS II蛋白三级结构，结果表明该蛋白呈紧密的球状结构(图2)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
发明涉及的序列及记号分列如下：
(1)SEQ ID NO.1的信息：
    (i)序列特征：
     (A)长度：1867bp，
     (B)类型：核苷酸，
     (C)链性：单链，
     (D)拓扑结构：线性；
    (ii)分子类型：核苷酸；
    (iii)序列描述：SEQ ID NO.1。
(2)SEQ ID NO.2的信息：
    (i)序列特征：
     (A)长度：404a.a，
     (B)类型：氨基酸，
     (C)链性：单链，
     (D)拓扑结构：线性；
    (ii)分子类型：蛋白质；
    (iii)序列描述：SEQ ID NO.2。
序列表
<110>山东省花生研究所
<120>花生β-酮脂酰-ACP合成酶II基因及其编码蛋白质以及基因克隆方法
<160>2
<210>1
<211>1867
<212>DNA
<213>花生
<400>1


<210>2
<211>404
<212>PRT
<213>花生
<400>2