生产紫色杆菌素的方法及重组菌.pdf

本发明公开了生产紫色杆菌素的方法及重组菌。本发明的重组菌，是将紫色杆菌素合成相关基因簇导入大肠杆菌或恶臭假单孢菌中获得的重组菌；所述紫色杆菌素合成相关基因簇编码其氨基酸序列为序列表中序列2、序列3、序列4、序列5和序列6的五种蛋白。本发明生产紫色杆菌素的方法，是以L-色氨酸为底物利用所述的重组菌发酵生产紫色杆菌素。本发明方法生产紫色杆菌素的产率高，可用于工业化生产。

权利要求书
1、  一种重组菌，是将紫色杆菌素合成相关基因簇导入大肠杆菌或恶臭假单孢菌中获得的重组菌；所述紫色杆菌素合成相关基因簇编码其氨基酸序列为序列表中序列2、序列3、序列4、序列5和序列6的五种蛋白。

2、  根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述紫色杆菌素合成相关基因簇为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1；
2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码紫色杆菌素合成相关蛋白的DNA分子；
3)与1)的DNA分子具有90％以上的同源性，且编码紫色杆菌素合成相关蛋白的DNA分子。

3、  根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)或E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL或E.coli Rosetta-gami或DH10B或DH5α。

4、  根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述恶臭假单孢菌为恶臭假单孢菌NCIMB 10432。

5、  一种生产紫色杆菌素的方法，是以L-色氨酸为底物利用权利要求1至4中任一所述的重组菌发酵生产紫色杆菌素。

6、  根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将紫色杆菌素合成相关基因簇导入大肠杆菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到的重组菌发酵生产紫色杆菌素，所述L-色氨酸的浓度为0.4g-1.2/L；所述重组菌的初始细胞浓度为OD600＝0.4-1.2；培养温度为15-20℃；培养时间为30-40h。

7、  根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将紫色杆菌素合成相关基因簇导入恶臭假单孢菌NCIMB 10432得到的重组菌发酵生产紫色杆菌素，所述L-色氨酸的浓度为0.4g-0.8/L；所述重组菌的初始细胞浓度为OD600＝0.8-1.2；培养温度为15-37℃；培养时间为30-40h。

8、  根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵培养中，发酵培养基包含NaH2PO4·2H2O 1.0-2.0g/L、Na2HPO4·12H2O 3.0-4.0g/L、NH4Cl 0.5-1.0g/L、K2HPO4·3H2O 7.0-8.0g/L、100mM MgSO4·7H2O 10-15mL/L、甘油3-4mL/L和酵母提取物0.5-1.5g/L。

9、  根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述发酵培养中，发酵培养基还含有正己烷；所述正己烷的浓度为1-2mL/L。

10、  根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养中，发酵培养基还含有IPTG；所述IPTG的浓度为0.7-1.3mmol/L。

说明书生产紫色杆菌素的方法及重组菌
技术领域
本发明涉及生产紫色杆菌素的方法及重组菌。
背景技术

紫色杆菌素(violacein)、脱氧紫色杆菌素是微生物的代谢产物，它属于吲哚衍生物，由两个色氨酸分子氧化缩合而成。自从19世纪末紫色杆菌素被发现以来，人们对其生物功能进行了大量的探索，发现它具有如下功能：
(1)广谱抗菌性
1945年Lichstein等用51株细菌(包括21个种)对紫色杆菌素粗提物进行抗菌实验，发现紫色杆菌对革兰氏阳性细菌有显著的抑制作用，对革兰氏阴性细菌有较小的抑制性。随后，1983年Duran等用纯化后的紫色杆菌素进行抗菌试验，纯的紫色杆菌素与紫色杆菌素+10％脱氧紫色杆菌素的混合物抗菌效果一样。紫色杆菌素还可以抑制植物真菌病原菌如Rosellinia necatrix，可以抑制桑树根腐病。在体外紫色杆菌素还具有抗分枝杆菌如Mycobacterium tuberculosis H37Ra的活性，其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为64μg/mL和128μg/mL，与对肺结核进行化学疗法中使用吡嗪酰胺(Pyrazinamide)的浓度相当(de Souza，1999)。
(2)抗原生动物活性
紫色杆菌素具有杀锥虫(Caldas，1978；Durán et al.，1994；Haun et al.，1992)和抗利什曼原虫(Leishmania)的活性(Leon et al.，2001)。
(3)抗病毒性
紫色杆菌素和10％脱氧紫色杆菌素的混合物对侵染Hela细胞的单纯性疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)、脊髓灰质炎病毒(Polioviruses)有抵抗活性(Andrighetti-Frohner et al.，2003；Duran et al.，2001；May G.et al.，1991)，当紫色杆菌素混合物浓度为0.25μg/mL和0.063μg/mL时，可以分别抑制62％的单纯性疱疹病毒和56％的脊髓灰质炎病毒。
(4)抗肿瘤细胞
紫色杆菌素对成纤维细胞(V79)系有很高的细胞毒素活性(Blosser et al.，2000；Haun et al.，1992)。紫色杆菌素对白血病细胞(leukemia cells)、淋巴瘤(lymphoma)、肺、结肠(Durán，1997；Melo et al.，2000)以及由艾滋病毒(AIDS)引起的淋巴瘤(Durán，1996)都有很好的细胞毒性作用。
(5)其它功能
紫色杆菌素抗可见光辐射(Antonio et al.，2004)，可代替人工色素作为染料，对天然原料(如丝绸、棉、毛)及合成原料(如尼龙)都有很好的着色效果(Shirata，2000)。
目前，已发现可以合成紫色杆菌素的微生物有Chromobacterium violaceum、C.fluviatile(Moss1978)、Janthinobacterium lividum(Sneath1956)、Alteromonasluteoviolacea(McCarthy SA 1985)、Pseudoalteromonas tunicata(Egan，James etal.2002)。紫色杆菌素的生物合成途径基本清楚，其生物合成受一个操纵元的控制，长约7.3kb，包括5个基因，分别是VioA、VioB、VioC、VioD和VioE。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产紫色杆菌素的方法及重组菌。
本发明所提供的重组菌，是将紫色杆菌素合成相关基因簇导入大肠杆菌或恶臭假单孢菌中获得的重组菌；所述紫色杆菌素合成相关基因簇编码其氨基酸序列为序列表中序列2、序列3、序列4、序列5和序列6的五种蛋白。
所述的紫色杆菌素合成相关基因簇分离自一株产紫色杆菌素的菌株杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2CGMCC №2056，该菌株合成紫色杆菌素能力较强。其紫色杆菌素合成相关基因簇是一个新的基因。
其中，所述紫色杆菌素合成相关基因簇具体为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1；
2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码紫色杆菌素合成相关蛋白的DNA分子；
3)与1)的DNA分子具有90％以上的同源性，且编码紫色杆菌素合成相关蛋白的DNA分子。
所述步骤3)中的DNA分子，与1)的DNA分子最好有95％以上的同源性。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述大肠杆菌具体可为E.coli BL21(DE3)或E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL或E.coli Rosetta-gami或DH10B或DH5α。所述恶臭假单孢菌可以为恶臭假单孢菌属的各种常见菌株如恶臭假单孢菌DSM 1693、恶臭假单孢菌ATCC 17485或恶臭假单孢菌NCIMB 10432。
本发明的重组菌可用来生产脱氧紫色杆菌素。
本发明的另一个目的是提供一种生产紫色杆菌素的方法。
本发明所提供的生产紫色杆菌素的方法，是以L-色氨酸为底物利用所述的重组菌发酵生产紫色杆菌素。
其中，将紫色杆菌素合成相关基因簇导入大肠杆菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到的重组菌发酵生产紫色杆菌素，所述L-色氨酸的浓度为0.4g-1.2/L；所述重组菌的初始细胞浓度为OD600＝0.4-1.2；培养温度为15-20℃；培养时间为30-40h。所述发酵培养中，发酵培养基还含IPTG，所述IPTG的浓度为0.7-1.3mmol/L。
当所述L-色氨酸的浓度为0.4g/L，所述重组菌的初始细胞浓度为OD600＝0.6，所述IPTG的浓度为1.3mmol/L，所述培养温度为25℃，所述培养时间为30h时，最适宜紫色杆菌素的合成。
将紫色杆菌素合成相关基因簇导入恶臭假单孢菌NCIMB 10432得到的重组菌发酵生产紫色杆菌素，所述L-色氨酸的浓度为0.4g-0.8/L；所述重组菌的初始细胞浓度为OD600＝0.8-1.2；培养温度为15-37℃；培养时间为30-40h。所述发酵培养中，发酵培养基还含正己烷，所述正己烷的浓度为1-2mL/L。所述培养基中还可含有碳原子数为7-12的正烷烃，碳原子数为7-12的正烷烃可替代正己烷。
当所述L-色氨酸的浓度为0.4g/L，所述重组菌的初始细胞浓度为OD600＝1.0，所述正己烷的浓度为1mL/L，所述培养温度为20℃，所述培养时间为30h时，最适宜紫色杆菌素的合成。
将紫色杆菌素合成相关基因簇导入恶臭假单孢菌NCIMB 10432得到的重组菌发酵生产紫色杆菌素，所述发酵生产中，发酵培养基主要由如下物质组成：NaH2PO4·2H2O 1.0-2.0g/L、Na2HPO4·12H2O 3.0-4.0g/L、NH4Cl 0.5-1.0g/L、K2HPO4·3H2O 7.0-8.0g/L、100mM MgSO4·7H2O 10-15mL/L、甘油3-4mL/L和酵母提取物0.5-1.5g/L；所述发酵培养基中添加的L-色氨酸，所述L-色氨酸的浓度为0.4g/L；所述重组菌的初始细胞浓度为OD600＝1.0；所述正己烷的浓度为0.5mL/L；培养温度为20℃，培养时间为30h时，合成的紫色杆菌素的量最高。
本发明将合成紫色杆菌素能力较强杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的紫色杆菌素合成相关基因簇导入多个大肠杆菌菌株和恶臭假单孢菌中，使紫色杆菌素合成相关基因簇实现异源表达，构建了多个能合成紫色杆菌素的重组菌。利用本发明构建的重组菌生产紫色杆菌素，其产率很高，以L-色氨酸为底物，在普通的LB培养基中培养，紫色杆菌素的产量平均即可达到0.809g/L和0.827g/L。利用本发明构建的重组恶臭假单孢菌，以L-色氨酸为底物，在E2液体培养基中发酵生产紫色杆菌素，其产量可达到1.5g/L，为工业生产紫色杆菌素奠定了基础。
附图说明
图1为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2为重组菌合成的紫色杆菌素的定量结果。
图3为温度对紫色杆菌素的合成影响。
图4为细胞浓度对E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色杆菌素的影响。
具体实施方式
实施例1、表达紫色杆菌素合成相关基因簇的重组菌
1)紫色杆菌素合成相关基因簇的克隆
将杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2CGMCC 2056转接入液体培养基(淀粉15g/L、硫酸亚铁0.03g/L、硝酸钾1g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁0.5g/L、色氨酸0.5g/L，pH为7.0)，25℃，200rpm培养36小时，按上海生工基因组DNA提取试剂盒说明书提取杜擀氏菌B2 CGMCC 2056基因组DNA。
根据紫色杆菌素合成相关基因簇序列设计引物vioA-for、Vio3054-rev、Vio3046-for和vioE-rev，引物vioA-for、Vio3054-rev、Vio3046-for和vioE-rev的核苷酸序列见表1，以杜擀氏菌B2 CGMCC 2056基因组DNA为模板，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶PCR扩增vio-U片段和vio-L片段，扩增vio-U片段所用引物为vioA-for和vio3054-rev；扩增vio-L片段所用引物为vio3046-for和vioE-rev，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，图1中，“M”代表分子量标准，“U”代表vio-U片段，“L”代表vio-L片段。PCR产物经PCR纯化试剂盒回收。AseI和NotI双酶切vio-U片段，NotI和XhoI双酶切vio-L片段，双酶切后的片段用回收试剂盒回收。
表1.引物序列

用NdeI和XhoI双酶切pET17b，与酶切后的vio-U和vio-L在16℃过夜连接，连接产物用热激法转化入E.coli DH5 α中，转化产物涂于含相应抗生素的LB平板上，挑取转化子培养后采用碱裂解法提取质粒，筛选含插入片段的阳性克隆，插入片段经双向测序验证，测序结果表明插入片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列表中的序列1自5′末端第1-1308位编码序列表中序列2所示的蛋白；自5′末端第1305-4322位编码序列表中序列3所示的蛋白；自5′末端第4323-5612位编码序列表中序列4所示的蛋白；自5′末端第5612-6730位编码序列表中序列5所示的蛋白；自5′末端第6740-7312位编码序列表中序列6所示的蛋白。阳性克隆所含的重组表达载体命名为pET17bVio。同样的方法，将pET32a与vio-U和vio-L连接获得重组表达载体pET32aVio。
用NdeI和Sal双酶切pCOM9(Smits T.H.M.et al.，New alkane-responsiveexpression vectors for E.coli and Pseudomonas.Plasmid 2001.46，16-24.)(清华大学)，与酶切后的vio-U和vio-L在16℃过夜连接，连接产物用热激法转化入E.coli DH5 α中，转化产物涂于含相应抗生素的LB平板上，挑取转化子培养后采用碱裂解法提取质粒，筛选含插入片段的阳性克隆，插入片段经双向测序验证，其核苷酸序列为序列表中的序列1，阳性克隆所含的重组表达载体命名为pCOM9Vio。同样的方法，将pCOM10(Smits T.H.M.et al.，New alkane-responsive expressionvectors for E.coli and Pseudomonas.Plasmid 2001.46，16-24.)(清华大学)与vio-U和vio-L连接获得重组表达载体pCOM10Vio。
2)构建表达紫色杆菌素合成相关基因簇的重组菌
将重组表达载体pET17bVio和pET32aVio分别转入E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL、E.coli Rosetta-gami三个菌株中，得到重组菌E.coliBL21(DE3)-pET17bVio、E.coli BL21(DE3)-pET32aVio、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio、E.coli Rosetta-gami-pET17bVio和E.coli Rosetta-gami-pET32aVio。
将pET17b和pET32a分别转入E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL、E.coli Rosetta-gami三个菌株中，获得的重组菌E.coli BL21(DE3)-pET17b、E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17b、E.coliRosetta-gami-pET17b、E.coli BL21(DE3)-pET32a、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32a和E.coli Rosetta-gami-pET32a作为对照。
将重组表达载体pCOM9Vio和pCOM10Vio分别转入DH10B、DH5α和恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)mt-2NCIMB 10432三个菌株中，获得重组菌DH10B-pCOM9Vio、DH10B-pCOM10Vio、DH5α-pCOM9Vio、DH5α-pCOM10Vio、Pseudomonas putida-pCOM9Vio和Pseudomonas putida-pCOM10Vio。
将pCOM9和pCOM10分别转入DH10B、DH5α和Pseudomonas putidamt-2 NCIMB10432三个菌株中，获得重组菌DH10B-pCOM9、DH10B-pCOM10、DH5α-pCOM9、DH5α-pCOM10、Pseudomonas putida-pCOM9和Pseudomonas putida-pCOM10作为对照。
重组菌E.coli BL21(DE3)-pET17bVio、E.coli BL21(DE3)-pET32aVio、E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio、E.coli Rosetta-gami-pET17bVio、E.coli Rosetta-gami-pET32aVio、DH10B-pCOM9Vio、DH10B-pCOM10Vio、DH5α-pCOM9Vio、DH5α-pCOM10Vio、Pseudomonas putida-pCOM9Vio和Pseudomonas putida-pCOM10Vio以及对照菌株E.coli BL21(DE3)-pET17b、E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17b、E.coliRosetta-gami-pET17b、E.coliBL21(DE3)-pET32a、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32a、E.coli Rosetta-gami-pET32a、DH10B-pCOM9、DH10B-pCOM10、DH5α-pCOM9、DH5α-pCOM10、Pseudomonas putida-pCOM9和Pseudomonas putida-pCOM10的单菌落分别接种至3mL含相应的抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养过夜。次日按1ml/100ml的接种量，接种至新鲜含相应的抗生素的LB培养基中37℃继续培养2-3h至OD600为0.6时加诱导剂，重组菌E.coli BL21(DE3)-pET17bVio、E.coli BL21(DE3)-pET32aVio、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio、E.coli Rosetta-gami-pET17bVio和E.coli Rosetta-gami-pET32aVio以及对照菌E.coli BL21(DE3)-pET17b、E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17b、E.coliRosetta-gami-pET17b、E.coli BL21(DE3)-pET32a、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32a和E.coli Rosetta-gami-pET32a中加入IPTG进行诱导，IPTG浓度为1mmol/L。重组菌DH10B-pCOM9Vio、DH10B-pCOM10Vio、DH5α-pCOM9Vio、DH5α-pCOM10Vio、Pseudomonas putida-pCOM9Vio和Pseudomonasputida-pCOM10Vio以及对照菌DH10B-pCOM9、DH10B-pCOM10、DH5α-pCOM9、DH5α-pCOM10、Pseudomonas putida-pCOM9和Pseudomonas putida-pCOM10加入正己烷进行诱导，正己烷浓度为0.05ml/100ml。20℃诱导培养20h，离心分别收集菌体，菌体中加入无水乙醇5mL，用漩涡混合器将其混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡0.5h，将振荡液9000×g离心5min，保留乙醇溶液。
重组菌E.coli BL21(DE3)-pET17bVio、E.coli BL21(DE3)-pET32aVio、E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio、E.coli Rosetta-gami-pET17bVio、E.coli Rosetta-gami-pET32aVio、DH10B-pCOM9Vio、DH10B-pCOM10Vio、DH5α-pCOM9Vio、DH5α-pCOM10Vio、Pseudomonas putida-pCOM9Vio和Pseudomonas putida-pCOM10Vio的乙醇溶液中都有蓝紫色物质，而对照菌的乙醇溶液中都不含有蓝紫色物质。
分别将含有蓝紫色物质的乙醇溶液减压蒸馏得到色素，将该色素分别溶于甲醇溶液中，进行高效液相色谱分析，使用Agilent-1100高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18，150mm×4mm，5μm；柱温30℃；洗脱剂为70ml/100ml的甲醇水溶液；流速1.0mL/min；检测波长：570nm。
高效液相色谱检测结果表明，所有重组菌合成的色素都包含两种物质，分别与杜擀氏菌属Duganella B2 CGMCC 2056合成的紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素洗脱时间时间一致(分别为3.0min和4.9min)。
紫色杆菌素含量是通过测定蓝紫色物质(色素)的乙醇溶液在最大吸收波长的吸光度值来衡量，Duganella sp B2所产紫色杆菌素测定波长为575nm，以无水乙醇作空白对照，通过吸光度值——色素浓度标准曲线得到相对应的色素浓度值，实验重复3次，实验结果以三次实验的平均值表示。
紫色杆菌素含量的测定结果如图2所示，表明各个重组菌中都有紫色杆菌素合成，紫色杆菌素的合成量不同，重组载体pET17bVio和pET32aVio在宿主E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL中紫色杆菌素合成量较高，分别达0.11g/L和0.27g/L；载体pCOM9Vio和pCOM10Vio在宿主Pseudomonas putida中紫色杆菌素合成量较高。
图2中，“1”代表E.coliRosetta-gami-pET17bVio，“2”代表E.coliBL21(DE3)-pET17bVio，“3”代表E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio，“4”代表E.coli Rosetta-gami-pET32aVio，“5”代表E.coliBL21(DE3)-pET32aVio，“6”代表E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32a Vio，“7”代表DH10B-pCOM9Vio，“8”代表Pseudomonas putida-pCOM9Vio，“9”代表DH5α-pCOM9Vio，“10”代表Pseudomonas putida-pCOM10Vio，“11”代表DH10B-pCOM10Vio，“12”代表DH5α-pCOM10Vio。
实施例2、表达紫色杆菌素合成相关基因簇的重组菌高效生产紫色杆菌素
1)高效生产紫色杆菌素的条件优化
将E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio和Pseudomonasputida-pCOM10Vio分别接种至含相应的抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养过夜。次日按1ml/100ml的接种量，接种至新鲜含相应的抗生素的LB培养基中37℃继续培养2-3h至OD600为0.6时加诱导剂，E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio加入IPTG作为诱导剂，IPTG浓度为1mmol/L；Pseudomonas putida-pCOM10Vio加入正己烷进行诱导，正己烷浓度为0.05ml/100ml。分别在15℃、20℃、25℃、30℃和37℃诱导培养20h后，离心收集菌体，提取紫色杆菌素，定量分析诱导温度对紫色杆菌素合成的影响。
紫色杆菌素含量的测定方法同实施例1。
诱导温度对E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio和Pseudomonasputida-pCOM10Vio合成紫色杆菌素的影响如图3所示，表明诱导培养温度为15-20℃比较适宜E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio中紫色杆菌素的合成，在20℃紫色杆菌素的合成量最高。诱导培养温度为15-37℃比较适宜Pseudomonasputida-pCOM10Vio中紫色杆菌素的合成，在20℃紫色杆菌素的合成量最高。
图3a为温度对BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色杆菌素的影响，图3b为温度对Pseudomonas putida-pCOM10Vio合成紫色杆菌素的影响。
将E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio按照上述方法培养到OD600分别为0.4、0.6、1.0和1.2时在培养液中加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，20℃诱导培养20h后，离心收集菌体，离心收集菌体，提取紫色杆菌素，对紫色杆菌素进行定量分析。
加入诱导剂时菌体浓度对E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色杆菌素的影响如图4所示，表明菌体E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio的OD600为0.4-1.2时加入诱导剂都有利于紫色杆菌素的大量合成，其中在OD600为0.6时达到最高。
以L-色氨酸、诱导剂(IPTG)的量、诱导时间3个因素为试验因素，以紫色杆菌素产量为指标，E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色杆菌素的能力进行3因子3水平的正交试验，E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色杆菌素能力的结果见表2。
表2正交试验结果与分析(BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio)

实验结果表明，在LB培养基中添加L-色氨酸0.4g-1.2/L，诱导剂(IPTG)的量0.7-1.3mmol/L，诱导时间为30-40h，E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色杆菌素的含量均很高。
E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio在含相应的抗生素的LB培养基(LB培养基中添加L-色氨酸，L-色氨酸的终浓度为0.4g/L)培养到菌体的OD600为0.6时加入诱导剂IPTG，IPTG的终浓度为1.3mmol/L，25℃诱导培养30h。实验重复3次。
紫色杆菌素含量的测定结果如表3所示。
                表3.验证结果

上述结果表明，培养基中L-色氨酸的浓度为0.4g/L时，E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio菌体的OD600为0.6时加入诱导剂IPTG，IPTG的终浓度为1.3mmol/L，25℃诱导培养30h，E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色杆菌素平均可达0.809g/L，最高可达0.866g/L。
以L-色氨酸、加诱导剂时细胞浓度(OD600)、诱导剂(正己烷)的量、诱导时间4因素为试验因素，以紫色杆菌素产量为指标，对Pseudomonas putida-pCOM10Vio产紫色杆菌素能力进行4因子3水平的正交试验。Pseudomonas putida-pCOM10Vio合成紫色杆菌素能力的结果见表4。
表4正交试验结果与分析(Pseudomonas putida-DCOM10Vio)

实验结果表明，在LB培养基中添加L-色氨酸0.4-0.8g/L，诱导剂(正己烷)的量1-2mL/L，添加诱导剂时Pseudomonas putida-pCOM10Vio的细胞浓度(OD600)为0.8-1.2，诱导时间为30-40h，Pseudomonas putida-pCOM10Vio合成紫色杆菌素的含量均很高。
Pseudomonas putida-pCOM10Vio在含相应的抗生素的LB培养基(LB培养基中添加L-色氨酸，L-色氨酸的终浓度为0.4g/L)培养到菌体的OD600为1.0加入诱导剂正己烷，正己烷的终浓度为1mL/L，20℃诱导培养30h。实验重复3次。
紫色杆菌素含量的测定结果如表5所示。
          表5.验证结果

上述结果表明，培养基中L-色氨酸的浓度为0.4g/L，Pseudomonasputida-pCOM10Vio菌体的OD600为1.0加入诱导剂正己烷，正己烷的终浓度为1mL/L，20℃诱导培养30h，Pseudomonas putida-pCOM10Vio合成紫色杆菌素平均可达0.827g/L，最高可达0.861g/L。
将Pseudomonas putida-pCOM10Vio转接入E2液体培养基(NaH2PO4·2H2O 1.3g/L，Na2HPO4·12H2O 3.0g/L，NH4Cl 0.9g/L，K2HPO4·3H2O 7.5g/L，100mM MgSO4·7H2O10mL/L，甘油3mL/L，酵母提取物1.0g/L，调节pH为7.0)，E2液体培养基中添加L-色氨酸，L-色氨酸的终浓度为0.4g/L，30℃，200rpm振荡培养过夜。次日按10ml/100ml的接种量，接种至新鲜含相应的抗生素的E2培养基(加入L-色氨酸的浓度为0.4g/L)中30℃继续培养3-4h至OD600为1.0时加入正己烷(0.5ml/100ml)进行诱导，20℃诱导培养30h，离心收集菌体，提取色素，色素经高效液相色谱鉴定为紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素。对紫色杆菌素进行定量分析，实验重复3次。
实验结果表明，Pseudomonas putida-pCOM10Vio在E2培养基中，色素产量较高，最终产量达1.5g/L(三次重复平均值)。
<110>清华大学
<120>生产紫色杆菌素的方法及重组菌
<130>CGGNARW81772
<160>6
<210>1
<211>7312
<212>DNA
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC 2056
<400>1
atgacaaatt attctgacat ttgcatagtt ggcgcaggca tagggggcct cagttgtgcg    60
acccagttga tcaacgccgc cgccggcaag aatttacgga tcagggtgtt cgacatggat    120
acgacggtgg gcgggcgcat ccagtcgcat aaagtagacg aggaggaaat cgccgaactc    180
ggcgccgccc gctactcgcc gcaactccat ccgcatttcg agcaactcat gcaggaatgc    240
gggctggcgc atgcgaccta ccctttcacc caggtggtgt cgctcgatca ggcgcaggag    300
aaactgaagg caactctgct gagcctgagt gcgatgctga aaaaacatcc gaacgattcc    360
ttccttgaat tcgtcagcca gtacctgggc gccgccgaag cgacccgcat gatcaaggcg    420
accggttacg acgccttgct gctgccggtg gtctcggcag cgatggccta cgacatcatc    480
aaaaagcacc cggaaacaca aagctttacc gaaaacgccg ccaacgagtg gcgctatgcc    540
accgacggct acagcgagct gctgcgtcag ttgcagcgcc aggcccagga cgccggcgtg    600
gaattccggc tggggcatcg cttgctgtcg gttgaaaagt ccggcaccga ccatgtcctc    660
gccttccgcc atatgggcga tactcagatg caccgggcgc gccatgtgat cacgaccctc    720
ccgccgaccg ccatgaagcg cctgaacatg gattttccgg ccgccttcag tcccttccag    780
tacgattccc tgcctttgtt caaaggattc ctgaccttcg aaacagcctg gtgggacgcg    840
ctcgggctga ccgacaaagt gctgatggcc gataatcctc ttcggaaaat ctacttcaag    900
ggcgacaaat acctggtgtt ctacaccgac agcgccagcg ccacctattg gcgggagtac    960
ctggagcaag gggaagacgt ttacctggac cgggtccgcc atcacctgaa agaagtgctg    1020
ccgctgaacg gtcagccgct gccgcagatc aaggcgcatttttacaagca ctggccgcat     1080
ggcgtcgagt tcagcctgga gccggaagcc gagcatccag caaccctgctccaccgcgac     1140
ggcatcatct cctgctcgga cgcgtatacc tcgcattgcg gctggatgga aggcagcttg    1200
atcagcgccg ggcacgctac ccgcctgttg ctggaacggc tcagccatcc gccagcacaa    1260
tccgggcacg actttaccct cgccacctct cttactgagc gcgcatgagc attctcgact    1320
ttccccgctt tcattttcgg gggtttgccc gcgctaatgt gcccactgcc aaccgcaata    1380
cgcacggcca tatcgatatc gcgacgaatg cggtatcgat cgcgggcgaa ccattcgacc   1440
tgagccgccc gccgtcggaa ttccatgagc acatgaaaca gcttgctccc aggttcgatg   1500
cggcgggcaa gccggatccg gagggcatct tcagcgaggc ggccggctac aatttttgcg   1560
gcaacaatca cttttcgtgg gaaaacgcca ggatcaccgg cgtccagctg cgcgatggcg   1620
aggtcgatac cgaggacgcg ctggtcggcg ccaagctggc cctgtgggga cattacaacg   1680
actatctgcg caccacggtc aaccgcgcca gatgggtcga caacaacccc gccgagccgg   1740
acaccaccct catttacgcg ggccagttca cgctcagcgg caagcaagcc acgcccaaca   1800
caccgagcct gttcagcgcc gatatcgggc aggcgcattc ggtacgctgg gtcggcagcg   1860
gccatatcag cgagcgcagc gggcattttc tcgacgatga attcggccgt tccaggctgt   1920
tccagttttc cgtggcgaag ctcgatccgc atttcctctt caatccggac acaccgctgc   1980
cggccagcat gcgcgccttg caagaggcgc ttgccgacga ggatgtgctg gggctgacgg   2040
tccagtatgc gctgttcaat atgtcgacgc cgcagaaacc cgattcgccg gtgttctacg   2100
acctggccgg cggcatcggc ctgtggcgcc gcgacgagct ggccacctat ccggccggcc   2160
gtttgctgct gccgcgccag agcagcctgg ggccggtact ggtgaaggtg catgcggacc   2220
gggtgtcggt gaatatgccg acggccatcc cgttcaccac gcgcgaggcc ggcgccgtgt   2280
ccgaacagca tcctacccat gcgctgggcg gcaagcttgc gctgggcgat ctcatgctgc   2340
acggtgccac cggcaagctg atcgcccgca tcccgcaaca gctgtacctc gactactggc   2400
gccatcatgg tgtcttcgat gtgccgctgc tccacccggc cacggcctcg ggttcgctca   2460
gcatgtccag cgcgcaggcg cagtgggacg aagccgactg ggtgctgcag tccgacagca   2520
accatctgta tctggaagcg cccaaccggc aacgacagca ggactttccg cagacgatca   2580
cggtacaaag ccgcttgcgc ggcgagctgg cggcgcatcc ggcgctgacg gcgcaggcgc   2640
aggatggcga gatcgtcggc gtgcgcgtgg cgccatcggc gctgggagtt ggctatgcgg   2700
acctgaccct cacgggccgc cgttcaggcg cgacccgcat catgctgggc gaggcacagg   2760
ggcagcagtt catcggcgcg agggtgctgc ccgacgactg gcatctggac gacataccgg   2820
ccgaacaggt cgattacgcc tttctctacc agcacgtgat gagctactac gagctggtct   2880
atcccttcat gtcggacaag gtgttcagcc tggcggacca ctgcaagtgc gaaacctatt   2940
cgcgcctgat gtggcagatg tgcgatccgc agaaccggga caagagctat tacatgccga   3000
gcacgcgtga actgtcgctg ccgaaatcgc gcctgttcct gaaatacctg acccaggtcg   3060
aagcggccgc caagtccacg cttcctcaag cggtcgcacc gcatgtcatc ggctgcaagg   3120
ccgagtggat cgccgagctg aaaaaggcga tcgacctgga actgtcgctc atgctgcagt   3180
acctgtacgc cgcgtatgcc attcccaact atgcgcaggg agtgaaactg gtcgaggccg   3240
gccgctggct gccggacgag ctggagctgg cctgcggcac cgaggaccgg cgccgcaaca   3300
gcggagcgcg tggcgccctg ctcgaaatcg cccatgaaga aatgattcac tacctgatgg   3360
tcaacaatgt gctgatggcg ctcggcgagc cgttctacgc cggcgccccg gcgctgggag   3420
aacaggcgcg ccagcgcttc ggcctggaca cggaatttgc cttcgaccct ttttccgagc   3480
atgtgctggc cagattcgtg cgtttcgagt ggcccgacta tcttcccacg cccggtaaat   3540
cgatcgccac cttctatgcg gcgatccgcc aggccgtggc cgatctgccc gatctgttcg   3600
acgccgacgg cggcaaacgc ggcggcgagc accacctgtt cctcaaagag ctcaccaacc   3660
gcgcctatcc cgcctatcag ctggaagtta gcgaccgcga cagcgcgctg ttcgcgctcg   3720
acttcgtcac cgaacagggc gaaggggtgg cggtggaatc gccccatttc gccgtgtcgc   3780
atttccagcg gctgcgcgcc ctggccggcc gcttttcggc acgcgaaaaa ccgttcgaac    3840
cggccgtgcc ggcgctgaaa aatccggtac tcgacccacg cgccgactgc accgtggtga   3900
ccgatcccaa ggcccgttcg ctgatgcagc tctaccaggg ctgctatgaa ctgaccttcg    3960
cgctgatggc gcaccacttc gcgcaaaagc cgctgggcag cctgcgccgc tcgcgcctga   4020
tgaatgcctc catcgacatc atgaccggtt tgctgcggcc cttgtcggcc gcgctgatga    4080
acatgccgtc cggcgtaccc gggcgcaacg ccggaccgcc cgtgcccggg ccggccgaca    4140
ccgccatcag cagtgactac agcctgggat gcgagctgct ggcgcagaaa tgcctggccc    4200
tggcgcagta cgcgcgcagc ctggaggccg aggtggccag cacggcgcag atcgacatgt    4260
tggagttctt taatcagcaa ctgaccgatt tatctcgggg aaagatgtca agagaggcct    4320
gaatgcacaa aatcatcatc gtgggcggcg gcctggcggg cagcctgacc gccacttatc    4380
tggcgcagcg cggacatgag gtccacgtta tcgaaaagcg cggcgatccg ctgcgggcgg    4440
agtcagccaa cgccgatccg gtcaactcgc gcgccattgg cgtgagcatg accgtgcgcg    4500
gcatcaaggc agtgctggcg gccggcatca gcaaggagga gctcgatcgg tgcggcgaac    4560
cggtcgtcgg catggcattt tcggtcggcg gcggccacaa ggtgcgcgaa ctgaccccgc    4620
tcgaaggctt gtttcccttg tcgctggacc gcaccgcgtt ccagcgcctg ctgaacaagt    4680
acgccgtcat gcacaaagtg aactattact tcgagcataa atgcctggac ctggacctgg    4740
acaagaaatc cgtgctgatc cagggcccgg acggcgcctt gcggcatctg caaggcgacc    4800
tgatcatcgg ggccgacggc gcccactccg ccgtgcggcg cgccatgcaa gccggcatgc    4860
ggcgcttcca gttcgaacaa tccttcttcc gccacggcta caagaccctg gtactgccga    4920
acgccgcggg actgggcttc cgcaaggatc tgctgtattt cttcggcatg gattccaagg    4980
gccagtttgc cggccgcgca gccaccatcc cggacggcag catcagcttc gccctctgcc   5040
tgccctacac cggcacgccc agcctggcca cgcgcgaccg cgccgccatg ggggagtttt    5100
tcagccgcta cttcggcatc ctgccaccgg ccagccggga agagctggtg aatcagttca    5160
tcgcgctgcc tagcaacgac ctcatcaatg tccgctccag caccttccat tacaagagca    5220
atgtcctgct gatcggcgat gcggcgcatg cgaccgcccc cttcctcggt cagggcatga    5280
acatggcgct ggaagacgtc tacgtcttca tcaccttgct ggaaaagcat cgcgatgacc    5340
tgggcctggt cttgtcggag tttacggggc agcgcaaggt gcaggccgac gccatgcagg    5400
atatggcgat cgccaactac gaaatgctga gcaacccgaa ttttattttc ttcctgcaaa    5460
cccgctacac ccgctacatg cacaagaaat ttcccagtgt ttatccgccc gacatggcgg    5520
agaagctgta cttcacatcg gttccctacg atgtgctgca acaaatccag aagaagcaaa    5580
acgtttggta caaacttgga agggtaaact aatgaaaatc ctcgtcatcg gcgccggacc    5640
agccggactg atctttgcaa gtcaaatgaa gcaagcccaa cccgcttggg atatcagcgt    5700
tgcggaaaaa aatacccagg aagaagtgct gggctggggc gtggtgctgc cgggacgccc    5760
gccgcgccat cccgccaatc cgctgtccta tctggagcag ccggaactgc tcaacccgca   5820
attcctggaa gaattcaagc tggtgcacca cgaccagccg aacctgatga gcaccggcgt    5880
gacgctgtgc ggcgttggtc ggcaagtcct ggtgcaggcg ctgcgcgcca aatgcgtggc    5940
ggccggcatc acggtcagtt acgagacgcc gctggcgagc gtggcgcaac tggaagccga    6000
atacgacctg gtcgtggtgt cgaacggtat caatcacaaa tcgctggaat tgccgccggc    6060
actggccgcg caggttgaat tcggcaagaa caaatacatc tggtacggca ccacccagct    6120
gttcgaccag atgaacctgg tgttccgcga aaacagcaac ggcgtgttcg ccggccatgc    6180
ctacaaatac tcggacacga tgagcacttt catcgtcgag tgcagcgaag agacgtatgc    6240
caaagccgag ctggaattcc gttccgagcg cgacgccgcc gcctatatcg ccaagacgtt    6300
cgcgccagaa ctgggcgaac accgtctggt cagccagccg ggccagggct ggcgcaactt    6360
catgaccctc agccgcgagg tggccagcga cggcaagttc gtgctgatcg gcgatgcgct    6420
gcaatcgggc cacttctcga tcggccatgg caccaccatg gcggtggtgg tggcccagct    6480
gctggtgaaa acgctcagcg ccgaagccgg cacggccgcg gccctggcca gcttcaacgc    6540
ccgcgcgctg ccactggtgc aactgttcaa ggagcatgcc gacgccagcc gcctgtggtt    6600
cgaaaccgtg agcgagcgtg tcgggctggg caacgcggag ctgaccgcca gcttcgatgc    6660
ccgccgcaac catttgccgc cgctgcagga tgcgctgatg gccagcctcg gctacgccct    6720
cggccgctaa ggagacgcca tgccaccgca cgccaccccg ccgctgctgc cgatgcaatg    6780
gagcagcgcc tacatctcgt attggtcgcc gatgcgggaa gacgacgagg tcacttccgg    6840
ctattgctgg ttcgactatg cccgcgacat ttgccgcatc gacggcctgt tcaatccctg    6900
gtcggaaaag gagacgggac accggctctg gatgtcggaa atcggcgacg ccaggcgcgg    6960
acaaagccgc aaacagaaag tcgcttatgc cagggaggcg gagccggccg gcgtgaagct    7020
gtacgagcgg gcgctggccg atgaggtcac gcccttccac gagctgttcc tgccgcaggc    7080
gatcctgatc gacggcgaag cgcgtcatga cggccgccac acggtgctgg gccaggcggc    7140
cgacgcctgg gtggtggagc ggccgggcaa agccgcctcg gtgttctatc tccaggccgg    7200
cggcaatcac ttgctgcgca tggtcaccgg caacgacgcg cagcatcagt cggtacgcga    7260
ctttccgaac ttccttgccg gcgacatcgc ggccagcgtt ttcgtgtcgg aa            7312
<210>2
<211>435
<212>PRT
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC 2056
<400>2
Met Thr Asn Tyr Ser AspIle Cys Ile Val Gly Ala Gly Ile Gly Gly
1              5                10                15
Leu Ser Cys Ala Thr Gln Leu Ile Asn Ala Ala Ala Gly Lys Asn Leu
           20                25               30
Arg Ile Arg Val Phe Asp Met Asp Thr Thr Val Gly Gly Arg Ile Gln
        35                40                45
Ser His Lys Val Asp Glu Glu Glu Ile Ala Glu Leu Gly Ala Ala Arg
    50                55               60
Tyr Ser Pro Gln Leu His Pro His Phe Glu Gln Leu Met Gln Glu Cys
65                70                 75               80
Gly Leu Ala His Ala Thr Tyr Pro Phe Thr Gln Val Val Ser Leu Asp
              85                 90               95
Gln Ala Gln Glu Lys Leu Lys Ala Thr Leu Leu Ser Leu Ser Ala Met
          100               105                110
Leu Lys Lys His Pro Asn Asp Ser Phe Leu Glu Phe Val Ser Gln Tyr
       115                120               125
Leu Gly Ala Ala Glu Ala Thr Arg MetIle Lys Ala Thr Gly Tyr Asp
    130              135               140
Ala Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Ala Ala Met Ala Tyr AspIle Ile
145               150               155               160
Lys Lys His Pro Glu Thr Gln Ser Phe Thr Glu Asn Ala Ala Asn Glu
               165               170               175
Trp Arg Tyr Ala Thr Asp Gly Tyr Ser Glu Leu Leu Arg Gln Leu Gln
           180               185                190
Arg Gln Ala Gln Asp Ala Gly Val Glu Phe Arg Leu Gly His Arg Leu
       195                200               205
Leu Ser Val Glu Lys Ser Gly Thr Asp His Val Leu Ala Phe Arg His
    210               215                220
Met Gly Asp Thr Gln Met His Arg Ala Arg His ValIle Thr Thr Leu
225               230                235               240
Pro Pro Thr Ala Met Lys Arg Leu Asn Met Asp Phe Pro Ala Ala Phe
               245               250                255
Ser Pro Phe Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Leu Phe Lys Gly Phe Leu Thr
           260                265               270
Phe Glu Thr Ala Trp Trp Asp Ala Leu Gly Leu Thr Asp Lys Val Leu
       275                280               285
Met Ala Asp Asn Pro Leu Arg Lys Ile Tyr Phe Lys Gly Asp Lys Tyr
    290               295               300
Leu Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Trp Arg Glu Tyr
305               310                315               320
Leu Glu Gln Gly Glu Asp Val Tyr Leu Asp Arg Val Arg His His Leu
              325               330                335
Lys Glu Val Leu Pro Leu Asn Gly Gln Pro Leu Pro Gln Ile Lys Ala
          340                 345              350
His Phe Tyr Lys His Trp Pro His Gly Val Glu Phe Ser Leu Glu Pro
        355                360               365
Glu Ala Glu His Pro Ala Thr Leu Leu His Arg Asp Gly Ile Ile Ser
   370                375               380
Cys Ser Asp Ala Tyr Thr Ser His Cys Gly Trp Met Glu Gly Ser Leu
385                390               395               400
Ile Ser Ala Gly His Ala Thr Arg Leu Leu Leu Glu Arg Leu Ser His
              405                410               415
Pro Pro Ala Gln Ser Gly His Asp Phe Thr Leu Ala Thr Ser Leu Thr
           420               425                430
Glu Arg Ala
       435
<210>3
<211>1005
<212>PRT
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC 2056
<400>3
Met Ser Ile Leu Asp Phe Pro Arg Phe His Phe Arg Gly Phe Ala Arg
1              5                  10                15
Ala Asn Val Pro Thr Ala Asn Arg Asn Thr His Gly His Ile Asp Ile
           20                 25                30
Ala Thr Asn Ala Val Ser Ile Ala Gly Glu Pro Phe Asp Leu Ser Arg
       35                40                45
Pro Pro Ser Glu Phe His Glu His Met Lys Gln Leu Ala Pro Arg Phe
    50                55                60
Asp Ala Ala Gly Lys Pro Asp Pro Glu Gly Ile Phe Ser Glu Ala Ala
65                 70               75                 80
Gly Tyr Asn Phe Cys Gly Asn Asn His Phe Ser Trp Glu Asn Ala Arg
               85                 90                95
Ile Thr Gly Val Gln Leu Arg Asp Gly Glu Val Asp Thr Glu Asp Ala
           100               105               110
Leu Val Gly Ala Lys Leu Ala Leu Trp Gly His Tyr Asn Asp Tyr Leu
       115               120                125
Arg Thr Thr Val Asn Arg Ala Arg Trp Val Asp Asn Asn Pro Ala Glu
    130               135                140
Pro Asp Thr Thr Leu Ile Tyr Ala Gly Gln Phe Thr Leu Ser Gly Lys
145                150               155               160
Gln Ala Thr Pro Asn Thr Pro Ser Leu Phe Ser Ala Asp Ile Gly Gln
              165               170               175
Ala His Ser Val Arg Trp Val Gly Ser Gly His Ile Ser Glu Arg Ser
           180               185               190
Gly His Phe Leu Asp Asp Glu Phe Gly Arg Ser Arg Leu Phe Gln Phe
       195                200                205
Ser Val Ala Lys Leu Asp Pro His Phe Leu Phe Asn Pro Asp Thr Pro
    210               215                220
Leu Pro Ala Ser Met Arg Ala Leu Gln Glu Ala Leu Ala Asp Glu Asp
225                230               235               240
Val Leu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Ala Leu Phe Asn Met Ser Thr Pro
              245                250               255
Gln Lys Pro Asp Ser Pro Val Phe Tyr Asp Leu Ala Gly Gly Ile Gly
           260                265               270
Leu Trp Arg Arg Asp Glu Leu Ala Thr Tyr Pro Ala Gly Arg Leu Leu
       275                280               285
Leu Pro Arg GlnSer Ser Leu Gly Pro Val Leu Val Lys Val His Ala
    290               295               300
Asp Arg Val Ser Val Asn Met Pro Thr Ala Ile Pro Phe Thr Thr Arg
305               310                315               320
Glu Ala Gly Ala Val Ser Glu Gln His Pro Thr His Ala Leu Gly Gly
              325               330                335
Lys Leu Ala Leu Gly Asp Leu Met Leu His Gly Ala Thr Gly Lys Leu
           340               345               350
Ile Ala Arg Ile Pro Gln Gln Leu Tyr Leu Asp Tyr Trp Arg His His
       355               360                365
Gly Val Phe Asp Val Pro Leu Leu His Pro Ala Thr Ala Ser Gly Ser
    370               375               380
Leu Ser Met Ser Ser Ala Gln Ala Gln Trp Asp Glu Ala Asp Trp Val
385                390               395               400
Leu Gln Ser Asp Ser Asn His Leu Tyr Leu Glu Ala Pro Asn Arg Gln
               405                410              415
Arg Gln Gln Asp Phe Pro Gln Thr Ile Thr Val Gln Ser Arg Leu Arg
           420                425              430
Gly Glu Leu Ala Ala His Pro Ala Leu Thr Ala Gln Ala Gln Asp Gly
       4354               404              45
Glu Ile Val Gly Val Arg Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Val Gly Tyr
    450              455               460
Ala Asp Leu Thr Leu Thr Gly Arg Arg Ser Gly Ala Thr Arg Ile Met
465                470               475              480
Leu Gly Glu Ala Gln Gly Gln Gln Phe Ile Gly Ala Arg Val Leu Pro
              485               490               495
Asp Asp Trp His Leu Asp AspIle Pro Ala Glu Gln Val Asp Tyr Ala
           500              505               510
Phe Leu Tyr Gln His Val Met Ser Tyr Tyr Glu Leu Val Tyr Pro Phe
       515                520              525
Met Ser Asp Lys Val Phe Ser Leu Ala Asp His Cys Lys Cys Glu Thr
    530               535               540
Tyr Ser Arg Leu Met Trp Gln Met Cys Asp Pro Gln Asn Arg Asp Lys
545                550               555               560
Ser Tyr Tyr Met Pro Ser Thr Arg Glu Leu Ser Leu Pro Lys Ser Arg
               565               570                575
Leu Phe Leu Lys Tyr Leu Thr Gln Val Glu Ala Ala Ala Lys Ser Thr
           580               585               590
Leu Pro Gln Ala Val Ala Pro His ValIle Gly Cys Lys Ala Glu Trp
        595              600              605
Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala Ile Asp Leu Glu Leu Ser Leu Met Leu
    610              615                620
Gln Tyr Leu Tyr Ala Ala Tyr Ala Ile Pro Asn Tyr Ala Gln Gly Val
625               630               635               640
Lys Leu Val Glu Ala Gly Arg Trp Leu Pro Asp Glu Leu Glu Leu Ala
              645               650               655
Cys Gly Thr Glu Asp Arg Arg Arg Asn Ser Gly Ala Arg Gly Ala Leu
           660               665               670
Leu Glu Ile Ala His Glu Glu Met Ile His Tyr Leu Met Val Asn Asn
       675               680               685
Val Leu Met Ala Leu Gly Glu Pro Phe Tyr Ala Gly Ala Pro Ala Leu
    690               695               700
Gly Glu Gln Ala Arg Gln Arg Phe Gly Leu Asp Thr Glu Phe Ala Phe
705               710               715               720
Asp Pro Phe Ser Glu His Val Leu Ala Arg Phe Val Arg Phe Glu Trp
               725               730               735
Pro Asp Tyr Leu Pro Thr Pro Gly Lys Ser Ile Ala Thr Phe Tyr Ala
           740               745               750
Ala Ile Arg Gln Ala Val Ala Asp Leu Pro Asp Leu Phe Asp Ala Asp
       755               760               765
Gly Gly Lys Arg Gly Gly Glu His His Leu Phe Leu Lys Glu Leu Thr
    770              775                780
Asn Arg Ala Tyr Pro Ala Tyr Gln Leu Glu Val Ser Asp Arg Asp Ser
785               790               795               800
Ala Leu Phe Ala Leu Asp Phe Val Thr Glu Gln Gly Glu Gly Val Ala
              805                810              815
Val Glu Ser Pro His Phe Ala Val Ser His Phe Gln Arg Leu Arg Ala
           820              825                830
Leu Ala Gly Arg Phe Ser Ala Arg Glu Lys Pro Phe Glu Pro Ala Val
       835               840                845
Pro Ala Leu Lys Asn Pro Val Leu Asp Pro Arg Ala Asp Cys Thr Val
    850               855               860
Val Thr Asp Pro Lys Ala Arg Ser Leu Met Gln Leu Tyr Gln Gly Cys
865               870                875              880
Tyr Glu Leu Thr Phe Ala Leu Met Ala His His Phe Ala Gln Lys Pro
               885               890               895
Leu Gly Ser Leu Arg Arg Ser Arg Leu Met Asn Ala Ser Ile Asp Ile
           900               905                910
Met Thr Gly Leu Leu Arg Pro Leu Ser Ala Ala Leu Met Asn Met Pro
        915               920               925
Ser Gly Val Pro Gly Arg Asn Ala Gly Pro Pro Val Pro Gly Pro Ala
    930               935               940
Asp Thr Ala Ile Ser Ser Asp Tyr Ser Leu Gly Cys Glu Leu Leu Ala
945               950                955              960
Gln Lys Cys Leu Ala Leu Ala Gln Tyr Ala Arg Ser Leu Glu Ala Glu
               965              970               975
Val Ala Ser Thr Ala GlnIle Asp Met Leu Glu Phe Phe Asn Gln Gln
           980              985               990
Leu Thr Asp Leu Ser Arg Gly Lys Met Ser Arg Glu Ala
       995                1000              1005
<210>4
<211>429
<212>PRT
<213>杜擀氏菌属(Duganellasp.)B2 CGMCC 2056
<400>4
Met His Lys Ile IleIle Val Gly Gly Gly Leu Ala Gly Ser Leu Thr
1          5                    10               15
Ala Thr Tyr Leu Ala Gln Arg Gly His Glu Val His Val Ile Glu Lys
           20                 25               30
Arg Gly Asp Pro Leu Arg Ala Glu Ser Ala Asn Ala Asp Pro Val Asn
       35                 40                45
Ser Arg Ala Ile Gly Val Ser Met Thr Val Arg GlyIle Lys Ala Val
    50                55                60
Leu Ala Ala Gly Ile Ser Lys Glu Glu Leu Asp Arg Cys Gly Glu Pro
65                70                75                80
Val Val Gly Met Ala Phe Ser Val Gly Gly Gly His Lys Val Arg Glu
              85                 90               95
Leu Thr Pro Leu Glu Gly Leu Phe Pro Leu Ser Leu Asp Arg Thr Ala
           100               105                110
Phe Gln Arg Leu Leu Asn Lys Tyr Ala Val Met His Lys Val Asn Tyr
       115                120               125
Tyr Phe Glu His Lys Cys Leu Asp Leu Asp Leu Asp Lys Lys Ser Val
   130                135                140
Leu Ile Gln Gly Pro Asp Gly Ala Leu Arg His Leu Gln Gly Asp Leu
145               150               155              160
Ile Ile Gly Ala Asp Gly Ala His Ser Ala Val Arg Arg Ala Met Gln
              165               170               175
Ala Gly Met Arg Arg Phe Gln Phe Glu Gln Ser Phe Phe Arg His Gly
          180                185               190
Tyr Lys Thr Leu Val Leu Pro Asn Ala Ala Gly Leu Gly Phe Arg Lys
        195               200               205
Asp Leu Leu Tyr Phe Phe Gly Met Asp Ser Lys Gly Gln Phe Ala Gly
    210                215               220
Arg Ala Ala Thr Ile Pro Asp Gly Ser Ile Ser Phe Ala Leu Cys Leu
225               230                235               240
Pro Tyr Thr Gly Thr Pro Ser Leu Ala Thr Arg Asp Arg Ala Ala Met
               245               250                255
Gly Glu Phe Phe Ser Arg Tyr Phe Gly Ile Leu Pro Pro Ala Ser Arg
           260                265               270
Glu Glu Leu Val Asn Gln Phe Ile Ala Leu Pro Ser Asn Asp Leu Ile
        275               280               285
Asn Val Arg Ser Ser Thr Phe His Tyr Lys Ser Asn Val Leu Leu Ile
    290                295               300
Gly Asp Ala Ala His Ala Thr Ala Pro Phe Leu Gly Gln Gly Met Asn
305               310               315               320
Met Ala Leu Glu Asp Val Tyr Val PheIle Thr Leu Leu Glu Lys His
              325               330               335
Arg Asp Asp Leu Gly Leu Val Leu Ser Glu Phe Thr Gly Gln Arg Lys
           340               345               350
Val Gln Ala Asp Ala Met Gln Asp Met AlaIle Ala Asn Tyr Glu Met
       355               360              365
Leu Ser Asn Pro Asn Phe Ile Phe Phe Leu Gln Thr Arg Tyr Thr Arg
    370               375               380
Tyr Met His Lys Lys Phe Pro Ser Val Tyr Pro Pro Asp Met Ala Glu
385                390               395               400
Lys Leu Tyr Phe Thr Ser Val Pro Tyr Asp Val Leu Gln Gln Ile Gln
               405               410               415
Lys Lys Gln Asn Val Trp Tyr Lys Leu Gly Arg Val Asn
           420               425
<210>5
<211>372
<212>PRT
<213>杜擀氏菌属(Duganellasp.)B2 CGMCC 2056
<400>5
Met Lys Ile Leu Val Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Ile Phe Ala
1              5                 10               15
Ser Gln Met Lys Gln Ala Gln Pro Ala Trp Asp Ile Ser Val Ala Glu
           20                25                30
Lys Asn Thr Gln Glu Glu Val Leu Gly Trp Gly Val Val Leu Pro Gly
        35               40                45
Arg Pro Pro Arg His Pro Ala Asn Pro Leu Ser Tyr Leu Glu Gln Pro
   50                  55                60
Glu Leu Leu Asn Pro Gln Phe Leu Glu Glu Phe Lys Leu Val His His
65                 70                75               80
Asp Gln Pro Asn Leu Met Ser Thr Gly Val Thr Leu Cys Gly Val Gly
               85                 90                95
Arg Gln Val Leu Val Gln Ala Leu Arg Ala Lys Cys Val Ala Ala Gly
           100               105               110
Ile Thr Val Ser Tyr Glu Thr Pro Leu Ala Ser Val Ala Gln Leu Glu
        115               120               125
Ala Glu Tyr Asp Leu Val Val Val Ser Asn Gly Ile Asn His Lys Ser
    130            135                   140
Leu Glu Leu Pro Pro Ala Leu Ala Ala Gln Val Glu Phe Gly Lys Asn
145                150               155              160
Lys TyrIle Trp Tyr Gly Thr Thr Gln Leu Phe Asp Gln Met Asn Leu
              165               170                175
Val Phe Arg Glu Asn Ser Asn Gly Val Phe Ala Gly His Ala Tyr Lys
           180               185               190
Tyr Ser Asp Thr Met Ser Thr Phe Ile Val Glu Cys Ser Glu Glu Thr
       195                200               205
Tyr Ala Lys Ala Glu Leu Glu Phe Arg Ser Glu Arg Asp Ala Ala Ala
    210               215               220
TyrIle Ala Lys Thr Phe Ala Pro Glu Leu Gly Glu His Arg Leu Val
225               230               235               240
Ser Gln Pro Gly Gln Gly Trp Arg Asn Phe Met Thr Leu Ser Arg Glu
               245              250                255
Val Ala Ser Asp Gly Lys Phe Val Leu Ile Gly Asp Ala Leu Gln Ser
           260               265               270
Gly His Phe Ser Ile Gly His Gly Thr Thr Met Ala Val Val Val Ala
       275                280               285
Gln Leu Leu Val Lys Thr Leu Ser Ala Glu Ala Gly Thr Ala Ala Ala
    290               295               300
Leu Ala Ser Phe Asn Ala Arg Ala Leu Pro Leu Val Gln Leu Phe Lys
305               310                315               320
Glu His Ala Asp Ala Ser Arg Leu Trp Phe Glu Thr Val Ser Glu Arg
              325                330               335
Val Gly Leu Gly Asn Ala Glu Leu Thr Ala Ser Phe Asp Ala Arg Arg
           340               345               350
Asn His Leu Pro Pro Leu Gln Asp Ala Leu Met Ala Ser Leu Gly Tyr
        355               360               365
Ala Leu Gly Arg
  370
<210>6
<211>191
<212>PRT
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC 2056
<400>6
Met Pro Pro His Ala Thr Pro Pro Leu Leu Pro Met Gln Trp Ser Ser
1              5                  10                 15
Ala Tyr Ile Ser Tyr Trp Ser Pro Met Arg Glu Asp Asp Glu Val Thr
           20                 25                30
Ser Gly Tyr Cys Trp Phe Asp Tyr Ala Arg AspIle Cys ArgIle Asp
       35                 40                45
Gly Leu Phe Asn Pro Trp Ser Glu Lys Glu Thr Gly His Arg Leu Trp
    50                 55                60
Met Ser GluIle Gly Asp Ala Arg Arg Gly Gln Ser Arg Lys Gln Lys
65                70                75                80
Val Ala Tyr Ala Arg Glu Ala Glu Pro Ala Gly Val Lys Leu Tyr Glu
           85                   90                 95
Arg Ala Leu Ala Asp Glu Val Thr Pro Phe His Glu Leu Phe Leu Pro
           100               105               110
Gln Ala Ile Leu Ile Asp Gly Glu Ala Arg His Asp Gly Arg His Thr
       115               120               125
Val Leu Gly Gln Ala Ala Asp Ala Trp Val Val Glu Arg Pro Gly Lys
   130               135               140
Ala Ala Ser Val Phe Tyr Leu Gln Ala Gly Gly Asn His Leu Leu Arg
145                150              155               160
Met Val Thr Gly Asn Asp Ala Gln His Gln Ser Val Arg Asp Phe Pro
            165                 170                175
Asn Phe Leu Ala Gly Asp Ile Ala Ala Ser Val Phe Val Ser Glu
           180                185               190