已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒及制备方法.pdf

本发明公开了一种已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒，属于一种含酶的葡萄糖检测方法的试剂盒。本发明试剂盒包括有：4瓶试剂I、1瓶试剂II及1支葡萄糖标准液，在试剂I中包括有浓度为8.0mmol/L的草酸盐。本发明通过草酸盐抑制内源性乳酸脱氢酶、α-羟丁酸脱氢酶的活性来控制干扰反应的进行，增加反应的特异性，提高检测结果的准确度。而且本发明的试剂盒检测时受样品试剂体积比、反应时间的设置影响小，线性范围可达37.4mmol/L。其使用方法和范围与原有己糖激酶法相同，不会增加实验人员的负担，几乎不增加试剂成本，经济方便易行，是一种准确性更高的用己糖激酶法测定葡萄糖的试剂盒。

权利要求书
1.  一种己糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒，包括有：4瓶试剂I、1瓶试剂II及1支葡萄糖标准液，其特征在于试剂I中包含有50.0mmol/L浓度的三乙醇胺盐酸缓冲液、8.0mmol/L浓度的草酸盐、4.38mmol/L浓度的三磷酸腺苷、2500U/L浓度的已糖激酶、1.88mmol/L浓度的无水硫酸镁及适量的防腐剂；试剂II中含有10.0mmol/L浓度的辅酶I、1800U/L浓度的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及适量的防腐剂。

2.  根据权利要求1所述的已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒，其特征在于试剂I中草酸盐为分析纯的草酸钠、草酸钾。

3.  根据权利要求1或2所述的已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒，其特征在于葡萄糖标准液的浓度为5.55mmol/L。

4.  根据权利要求1至3任意一项所述的已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒，其特征在于防腐剂为ProClin300。

5.  一种已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒的制备方法，其特征在于：
a.三乙醇胺盐酸缓冲液的制备方法：在蒸馏水中溶解三乙醇胺形成三乙醇胺缓冲液，25℃时用盐酸调节缓冲液的pH至7.5±0.2；
b.试剂I的制备方法：将已糖激酶加入制备好的三乙醇胺盐酸缓冲液中，依次溶解草酸盐、三磷酸腺苷、无水硫酸镁，充分混匀，使各成分的浓度达到使用要求；
c.试剂II的制备方法：将辅酶I(NAD+)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解在三乙醇胺盐酸缓冲液中，混合均匀，使各成分的浓度达到使用要求；
d.葡萄糖标准液的制备方法：称取葡萄糖(分析纯)溶解在蒸馏水中，使其浓度为5.55mmol/L，混匀后静置30分钟，分装备用。

说明书已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒及制备方法
技术领域
本发明属于一种含有酶的葡萄糖检测方法的试剂盒，特别是涉及一种已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒及制备方法。
背景技术
葡萄糖的测定方法已知的就有12种之多，在这些方法中，有的方法易受反应液中还原性物质、其它糖类干扰而产生伪阴性与伪阳性偏差而很少应用。目前，国内外检测葡萄糖最常用的方法是酶法，以酶为试剂可以提高特异性，临床实验室常使用葡萄糖氧化酶(GOD)法和己糖激酶(HK)法测定葡萄糖。葡萄糖氧化酶法易受维生素C、尿酸、尿素、胆红素、肌酐的干扰，而以上各物质对己糖激酶法无干扰。己糖激酶法测定血液中的葡萄糖因其特异性强、精密度和准确度非常高是目前国际上公认测定葡萄糖的参考方法而被广大实验室采用。
目前各实验室使用的已糖激酶法试剂盒，虽由多家单位生产，但其中各种试剂盒的试剂基本相似，缓冲液PH都在7.5±0.2，可使还原型辅酶I(NADH)或还原型辅酶II(NADPH)活性最高；差异在于已糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、三磷酸腺苷(ATP)、辅酶I(NAD+)或辅酶II(NADP+)加入浓度不同。
下面是几种厂家己糖激酶法试剂盒配方
《全国临床检验操作规程》中配方：
三乙醇胺盐酸缓冲液(PH7.5)50mmol/L
MgSO4             2.0mmol/L
ATP               2.0mmol/L
NADP+             2.0mmol/L
HK                ≥1500U/L
G6PD              2500U/L
使用方法：样品∶试剂＝1∶100，混匀后10分钟检测。
日本OLYPUS配方：
PIPES缓冲液           24.0mmol/L
Mg2+                  2.37mmol/L
ATP                   2.0mmol/L
NAD+                  1.32mmol/L
HK                    600U/L
G6PD                  1600U/L
稳定剂                   适量
使用方法：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶100∶20，混匀后5分钟检测。
德国LEADMEN生化技术有限公司配方：
缓冲液                100mmol/L(PH7.6)
ATP                   4.0mmol/L
NAD+                  3.0mmol/L
HK                    >100U/mL
G6PD                  >300U/mL
叠氮钠                0.09％
使用方法：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶100∶20，混合后5分钟检测。
上海丰汇医学科技有限公司配方：
三乙醇胺盐酸缓冲液         50mmol/L
ATP                        1.5mmol/L
NAD+                       0.7mmol/L
HK                         2000U/L
G6PD                       3000U/L
使用方法：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶120∶30，混匀后3分钟检测。
上海长征-康仁医学科学有限公司配方：
三乙醇胺盐酸缓冲液          50mmol/L(PH7.5±0.2)(25℃)
ATP                         1.3mmol/L
NAD+                        0.65mmol/L
HK                          ≥1500U/L
G6PD                        ≥2500U/L
使用方法：样品∶试剂＝1∶150，混匀后3分钟检测。
己糖激酶(HK)法检测葡萄糖的过程包括两步偶联反应，己糖激酶催化葡萄糖与ATP之间的反应，生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖与NAD+(或NADP+)在G6PD的催化下反应生成NADH(或NADPH)与等摩尔的6-磷酸葡萄糖酸。
把ATP的磷酸基团转移给葡萄糖的反应是由HK催化，并需要镁离子参加，使HK被充分激活，己糖激酶对葡萄糖的米氏常数Km为0.01mmol。
《全国临床检验操作规程》中报道，己糖激酶法测定葡萄糖所用的G6PD是从哺乳动物中提取的NADP+作底物，而目前多数实验室都采用细菌产生的G6PD作为底物。细菌酶的优点在于，因为红细胞中以NADP+和葡萄糖-6-磷酸作底物，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下的反应不影响葡萄糖测定结果，这样就减少了溶血的干扰，目前的试剂盒多是以NAD+为底物的配方。
从己糖激酶法的反应机制看，在健康人群血清检测时，各种检测方法的数值相差不大。如图2、图3为检测正常对照组血清，使用本发明己糖激酶法试剂盒单一试剂和上海丰汇公司己糖激酶法试剂盒单一试剂测定同一标本，其乳酸脱氢酶(LDH)为136.0U/L，α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)为107.0U/L，葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖值为5.87mmol/L。现有己糖激酶法试剂盒测定值为5.78mmol/L，本发明己糖激酶法试剂盒测定值为5.82mmmol/L，均为正常反应曲线，准确度和精密度都很高。
但现有的己糖激酶法测定葡萄糖时，易受内源性心肌酶及有机酸的干扰而使检测结果偏低。特别是测定在肝转移癌、恶性贫血、急性心肌梗塞等患者血液中LDH、α-HBDH活性高的葡萄糖时，易导致误诊误治。
在肝转移癌、恶性贫血、急性心肌梗塞患者中，血液中LDH、α-HBDH活性都很高，同时伴有丙酮酸、α-酮丁酸升高，用己糖激酶法测定其葡萄糖时，一旦有NADH生成，它将会产生干扰反应：在LDH催化下，NADH与丙酮酸反应，生成L-乳酸和NAD+；在α-HBDH催化下，NADH与α-酮丁酸反应生成α-羟丁酸和NAD+，见图1。干扰指示反应不同程度地消耗了NADH，有时甚至会耗尽生成的NADH，使反应曲线下降或变为平坦，使NADH的生成与葡萄糖不成等量关系。干扰反应的结果使葡萄糖测定结果偏低。LDH、α-HBDH活性越高，干扰反应速度越快，偏差越大。己糖激酶法测定急性心肌梗塞(急性心肌梗死、肝转移癌、恶性贫血等)患者的葡萄糖，内源性干扰可通过与葡萄糖氧化酶法或其它血糖测定方法比较而被发现，己糖激酶法测定葡萄糖结果明显偏低。也可以通过在自动化分析仪上查看实时反应曲线获知，心肌酶活性越高，样品体积分数增加，反应时间延长，内源性干扰越大，反应曲线下降越陡，葡萄糖结果偏差越大，准确度越低。
在测定肝转移癌、恶性贫血、急性心肌梗死病人血清时，随着样品体积分数(SVF，样品与试剂使用比例)的改变，反应液中LDH及丙酮酸、α-HBDH及酮丁酸浓度随着改变。SVF增大，准确度下降(内源性干扰反应)精密度也下降(因反应尚未达到终点，反应持续进行)，特别是在测定血清中LDH、α-HBDH酶活性高的患者葡萄糖时，其结果偏低。SVF降低，对低葡萄糖标本，仪器分析中的信噪比(噪音/信号)增大，会导致结果重复性下降，精密度CV下降。因此急需一种既能适应各种患者的血液葡萄糖测定，提高己糖激酶法测定葡萄糖的准确度、精密度，又能适应一定的检测仪器，不增加检测成本，使检测人员容易掌握使用方法的己糖激酶法试剂盒。
发明内容
本发明为了解决现有技术中己糖激酶法测定葡萄糖存在内源性干扰的问题，提供一种能抗内源性干扰，提高临床实验室采用已糖激酶法测定葡萄糖的准确性的已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒及制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明的已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒包括：4瓶试剂I、1瓶试剂II及1支葡萄糖标准液，试剂I中包含有50.0mmol/L浓度的三乙醇胺盐酸缓冲液，8.0mmol/L浓度的草酸盐、4.38mmol/L浓度的三磷酸腺苷、2500U/L浓度的已糖激酶、1.88mmol/L浓度的无水硫酸镁及防腐剂适量；试剂II中含有10.0mmol/L浓度的辅酶I、1800U/L浓度的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及防腐剂适量。
所述的草酸盐为分析纯的草酸钠、草酸钾。
所述的葡萄糖标准液浓度为5.55mmol/L。
所述的防腐剂为ProClin 300。
一种已糖激酶法检测葡萄糖的试剂盒的制备方法：
a.三乙醇胺盐酸缓冲液的制备方法：在蒸馏水中溶解三乙醇胺形成三乙醇胺缓冲液，25℃时用盐酸调节缓冲液的pH至7.5±0.2；
b.试剂I的制备方法：将已糖激酶加入制备好的三乙醇胺盐酸缓冲液中，依次溶解草酸盐、三磷酸腺苷、无水硫酸镁，充分混匀，使各成分的浓度达到使用要求；
c.试剂II的制备方法：将辅酶I、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解在三乙醇胺盐酸缓冲液中，混合均匀，使各成分的浓度达到使用要求；
d.葡萄糖标准液的制备方法：称取葡萄糖(分析纯，分子量为180.16)溶解在蒸馏水中，使其浓度为5.55mmol/L，混匀后静置30分钟，分装备用。
在本发明试剂盒的试剂中，草酸盐为抑制剂，NAD+为指示酶，无水硫酸镁为己糖激酶的激活剂，HK、G6PD为工具酶。ATP参与葡萄糖磷酸化反应。防腐剂为ProClin 300，成分主要为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)。加入ProClin 300为解决生物样本处理过程中保存期短的问题，可以有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长。当浓度达到0.02％条件下，ProClin系列防腐剂具有广谱抗菌活性，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长；同时，它又能保持体系中酶的活性。
草酸盐对乳酸脱氢酶、α-羟丁酸脱氢酶活性有明显抑制作用，却不影响己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性，本发明采用将适宜浓度的草酸钠加入到己糖激酶法所用的试剂中，起到抑制干扰反应的效果。所用的草酸钠、草酸钾、均为试剂纯产品，纯度在99.97％。
在本发明试剂盒的试剂中加入草酸盐，其对试剂中的其他成分的影响、对自动化仪器的检测的影响、其最佳浓度、其检测结果的精确性、准确性都需要进行验证，下面以草酸钠为代表通过对草酸钠浓度选择、有关检测数据的选择，已有的己糖激酶法试剂盒与本发明的己糖激酶法试剂盒的检测结果等一些实验来进一步对本发明进行说明。
实验仪器：
OLYMPUS AU 2700全自动分析仪           日本
电热恒温水浴箱                       上海医用仪器二厂
DDS-11AW酸度计                       上海理达仪器厂
分析天平                             上海分析仪器二厂
试剂：
三乙醇胺                (美国Sigma公司批号T1377)
ATP                     (美国Sigma公司批号A7699)
HK                      (美国Sigma公司批号EC0025)
G6PD                    (美国Sigma公司批号G7750)
辅酶I                   (美国Sigma公司批号：117809)
草酸钠            (分析纯，纯度99.97％，北京市通广精细化工公司)
无水MgSO4         (分析纯，纯度99.97％，北京市通广精细化工公司)
ProClin 300             (上海闪晶生物公司批号P050817)
盐酸                    (分析纯，北京市通广精细化工公司)
实验条件：
温度       37℃           试剂用量    3.0ml
波长       340nm          样品用量    0.02ml
比色光径   1.0cm          反应时间    3min
样品试剂比为1：150
在反应曲线图中，横轴为反应时间，纵轴为吸光度。测定时间每点间隔18秒，测定时间180秒(第10点)。
实验内容及结果：
1.草酸钠对Mg2+的影响：三乙醇胺盐酸缓冲液被测定的pH值为7.5±0.2，G6PD活性3.0±0.2KU/L，该试剂在加入草酸钠试剂前，测Mg2+浓度为1.32mmol/L，加入草酸钠试剂经离心后，取上清液检测，试剂中Mg2+浓度未发生改变，证明无草酸镁形成。G6PD活性仍为3.0±0.2KU/L，因此草酸钠对G6PD活性没有影响。同时，换为草酸钾抑制剂的己糖激酶法试剂盒其检测的反应曲线都正常，准确度和精确度提高，都能达到草酸钠的同等功效。
2.草酸钠浓度的选择：在试剂中分别加入浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0mmol/L的草酸钠，分别测定标本1和标本2的葡萄糖值，每点各测10次，取其平均值，标本1：英国RANSDOX公司350UN/5定制血清，血糖值范围6.16+0.62mmol/L；标本2：LDH 3862U/L，葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖值为7.85±0.75mmol/L。结果见表1。
表1.不同浓度的草酸纳对葡萄糖检测结果的影响
 草酸浓度2.04.06.08.010.012.014.0标本16.186.176.176.176.156.126.08标本26.816.987.447.837.517.327.22
从表1看出，标本1为定值血清，测定的血糖值在误差范围之内，但随着草酸浓度的增加，葡萄糖值呈下降的趋势。标本2为异常血清，从表1中可看出：草酸纳浓度低时不足以完全抑制干扰反应，测得的数值偏低，当草酸钠浓度高时会抑制工具酶活性，也会析出结晶，葡萄糖测定数值呈下降趋势。为了使该试剂达到准确度要求，即不影响葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和己糖激酶的活性，又能抑制LDH、HBDH的干扰，因此选择了8.0mmol/L的浓度，以使检测更完善。在己糖激酶法工作液中使用与未使用草酸钠抑制剂工作液中LDH、HBDH活性见表2
表2.己糖激酶法工作液中LDH、HBDH活性的比较

在己糖激酶法工作液中使用草酸钠抑制剂的工作液中LDH、α-HBDH活性得到明显抑制，两组有高度显著性差异p<0.05，减弱了干扰反应。
3.体积分数的选择：体积分数的选择在检测中很重要，我们选择了己糖激酶法不同样品体积分数测定葡萄糖，测定结果比较见表3
表3.本方法不同样品体积分数测定急性心肌梗死患者葡萄糖结果比较

从表3中可看出，各种样品试剂比测定结果间无显著性的差异，t＝0.5879，p>0.05，n＝22，为了能适应多种仪器，本发明选择样品试剂比为1：150。
4.反应时间和线性范围的选择：本试剂盒的试剂反应时间分别设置为3分钟与4.5分钟测得心肌梗死组病人葡萄糖测定结果比较见表4，统计学分析为：t＝2.01，P＝0.5039，n＝24，不同反应时间设置测定急性心肌梗死患者葡萄糖结果无显著性差异。因此，该试剂受反应时间设置影响小。将一高值葡萄糖血清分别稀释成1/12、2/12、3/12、4/12、5/12、6/12、7/12、8/12、9/12/、10/12、11/12、12/12倍测得的葡萄糖最高值为37.4mmol/L因此，本试剂线性范围在37.4mmol/L。
表4.本发明不同反应时间设置测定急性心肌梗死患者葡萄糖结果比较

5.血清指数的干扰实验：经实验，溶血、乳糜混浊、黄疸对本试剂的干扰与现有己糖激酶法试剂相同。所以血清指数的设置与原方法一样。
6.本发明单、双试剂使用效果实验：
使用急性心肌梗塞患者血液做标本，其LDH为2300.2U/L，HBDH为2271.4U/L；葡萄糖氧化法测得血糖为5.67mmol/L；用本发明的己糖激酶法试剂盒单试剂和双试剂与上海汇丰公司的己糖激酶法试剂盒的单试剂和双试剂同测一个标本进行比较。在实时反应曲线图中，横轴为反应时间，测定时间每点间隔18秒，测定时间180秒，纵轴为吸光度，样品：试剂I：试剂II＝1:120:30。本发明己糖激酶法试剂盒单试剂和双试剂均为正常反应曲线如图4，6，与葡萄糖氧化法测得的葡萄糖无明显差异，由此可见本发明己糖激酶法试剂盒准确度、精确度都很高。现有的己糖激酶法试剂盒为异常反应曲线，准确度降低，如图5，7。
7.临床应用情况：
研究对象：健康查体成人26名，男14名，女12名，平均年龄42.5岁。经B超检查肝、胆、胰、脾、肾均正常，其LDH平均值为129.8±31.5U/L，α-HBDH平均值为101.3±40.13U/L；恶性贫血组18名，其中男10名，女8名，平均年龄41.5岁，其LDH平均值为2544.3±1869.5U/L，α-HBDH平均值为2347.7±994.6U/L；急性心肌梗塞组22名，其中男12名，女10名，平均年龄52.5岁，其LDH平均值为4348.9±1320.7U/L，α-HBDH平均值为3887.6±1246.5U/L；肝转移癌组13名，其中男7名，女6名，平均年龄61.5岁，其LDH平均值为2577.2±1690.4U/L，α-HBDH平均值为2014.2±1296.6U/L。均在清晨空腹采血。通过表5可看出，正常人葡萄糖用三种试剂盒测得数据无明显差别，其他三组数据，葡萄糖氧化酶试剂盒与本发明己糖激酶试剂盒测得数据无明显差别而用现有己糖激酶法试剂盒测得的数据却普遍比另两种试剂盒低。
直线回归实验：用本发明试剂盒和上海丰汇公司葡萄糖氧化酶试剂盒、现有己糖激酶试剂盒测试肝转移癌组、恶性贫血组、急性心肌梗塞组与对照组的葡萄糖。结果见表5。
表5.几种测试方法的比较

从表5可以看出，1.正常对照组：Y本发明法＝1.002XGOD-0.4659；R2＝0.9993本发明与葡萄糖氧化酶两试剂盒相关性良好；经配对t检验，t＝0.23，p>0.05，无显著性差异。Y本发明＝0.9978XHK+0.2429；R2＝0.99974本发明与现有己糖激酶两试剂盒相关性良好，经配对t检验，t＝0.25，p>0.05，无显著性差异。三种试剂盒准确性均较高。2.肝转移癌组：Y本发明＝0.9938XGOD+0.3835；R2＝0.9994本发明与葡萄糖氧化酶两试剂盒相关性良好，经配对t检验，t＝0.93，p>0.05，无显著性差异。本发明的试剂盒与现有己糖激酶法试剂盒有显著性差异，t＝7.29，p<0.05。本发明己糖激酶法试剂盒准确性高于现有的己糖激酶法试剂盒。3.恶性贫血组：Y本发明＝0.9985XGOD+0.2182；R2＝0.9995本发明与葡萄糖氧化酶两试剂盒相关性良好，经配对t检验，t＝1.63，p>0.05，无显著性差异。本发明试剂盒与现有己糖激酶法试剂盒有显著性差异，t＝8.02，p<0.05。本发明己糖激酶法试剂盒的准确性高于现有己糖激酶法试剂盒。4.急性心肌梗死组：Y本发明＝1.001XGOD-0.2791；R2＝0.9996本发明与葡萄糖氧化酶两试剂盒相关性良好，经配对t检验，t＝0.51，p>0.05，无显著性差异。本发明试剂盒与现有的己糖激酶法试剂盒有显著性差异，t＝11.06，p<0.05。本发明己糖激酶法试剂盒测出的数据与葡萄糖氧化酶法试剂盒相近，准确性高于现有的己糖激酶法试剂盒。
精密度试验：取恶性贫血组、急性心肌梗塞组、肝转移癌组及对照组的血样，用三种方法测试血糖，连续测20次求出批内精密度。每份血样测一次连续测20天得出批间精密度。结果见表6。葡萄糖氧化酶法试剂盒数值批内(CV％)为1.99-2.74，批间(CV％)为3.12-3.33；现有己糖激酶法试剂盒数值批内为2.66-8.11，批间为3.03-10.01；本发明的己糖激酶法试剂盒数值批内(CV％)为2.00-2.88，批间(CV％)为3.04-3.23。现有的己糖激酶法试剂盒数值差别最大，精确度最低。
表6.精密度实验比较

本发明具有的优点和积极效果是：
本发明的己糖激酶法试剂盒，通过草酸盐抑制内源乳酸脱氢酶、α-羟丁酸脱氢酶的活性，来控制干扰反应的进行，增加反应的特异性，提高检测结果的准确度。而且本发明的试剂盒检测时受样品试剂体积比、反应时间设置影响小，线性范围可达37.4mmol/L。其使用方法和范围与原有己糖激酶法相同，不会增加实验人员的负担，几乎不增加试剂成本，经济方便易行，是一种准确性更高的用己糖激酶法测定葡萄糖的试剂盒。
附图说明
图1是现有己糖激酶法测定反应和干扰反应示意图，
图2是本发明己糖激酶法试剂盒测定正常对照组血清葡萄糖实时反应曲线图，
图3是上海丰汇公司己糖激酶法试剂盒测定正常对照组血清葡萄糖实时反应曲线图，
图4是本发明己糖激酶法试剂盒使用单一试剂检测急性心肌梗塞患者血清葡萄糖实时反应曲线图，
图5上海丰汇公司己糖激酶法试剂盒使用单一试剂检测急性心肌梗塞患者血清葡萄糖反应曲线图，
图6是本发明己糖激酶法试剂盒使用双试剂检测急性心肌梗塞患者血清葡萄糖反应曲线图，
图7上海丰汇公司己糖激酶法试剂盒使用双试剂检测急性心肌梗塞患者血清葡萄糖反应曲线图。
具体实施方式
1.试剂盒的组成
4瓶试剂I(100ml/瓶)；1瓶试剂II(100ml)；葡萄糖标准液1支(浓度：5.55mmol/L，2ml)；试剂盒使用说明书1份。
2.试剂的配制：
三乙醇胺盐酸缓冲液(浓度50mmol/L)的配制：
将14.92g三乙醇胺溶解在2L蒸馏水中，然后将40mg ProClin 300加入溶液中混合均匀，25℃时用1mol/L的盐酸将三乙醇胺盐酸缓冲液pH值调节到7.5±0.2。
试剂I的配制：
将10.0gHK溶解在1L制备好的三乙醇胺盐酸缓冲液中，将1.07g草酸钠、2.22g ATP、226.28mg无水MgSO4分别加入上述三乙醇胺盐酸缓冲混合液中，混合均匀，制得试剂I。
b.试剂II的制备：
将6.63mgNAD+与3.60mgG6PD溶解在另外1L制备好的三乙醇胺盐酸缓冲液中，制得试剂II。
c.标准液的配制：
称取100mg葡萄糖(分析纯)溶解在100ml蒸馏水中，混匀静置30分钟，其浓度为5.55mmol/L，分装备用。
本发明的试剂盒在4-8℃冷藏、闭光保存，有效期：1年。
3.试剂盒的使用方法
a单试剂：按试剂I∶试剂II等于4∶1的比例，混合配成应用液。将样品2μl倒入300μl应用液中，混合均匀，37℃孵育3分钟，应用全自动分析仪在340nm波长处检测。
b.双试剂：将2μl样品加入240μl试剂I中混匀，37℃孵育5分钟，加入60μl试剂II混匀，37℃孵育3分钟，应用全自动分析仪在340nm波长处检测。