新型高转移膀胱癌细胞株及其建立方法 本发明属肿瘤生物学领域，具体涉及一种导入GFP基因的新型高转移膀胱癌细胞株及其建立方法。
肿瘤是危害人类健康的主要疾病，在所有因疾病造成人类死亡的原因中占第二位。临床观察发现因肿瘤原发病灶不断生长造成其所在器官结构破坏或功能损害引起患者死亡的仅占少数。而肿瘤的全身播散，在肺、肝、脑、肾等重要器官形成转移病灶，进而引起肺、肝、脑、肾等功能损害及全身衰竭才是恶性肿瘤致死的主要原因。因此深入研究肿瘤转移过程及其机理，特别是早期阶段肿瘤细胞是如何在靶器官中存活并生长的，对于防止肿瘤转移病灶形成，或将肿瘤转移病灶扼杀在萌芽阶段，达到防止肿瘤转移或抑制转移病灶生长，提高肿瘤治愈率，延长病人生命等均十分重要。
目前人们对肿瘤转移过程，特别是早期过程的认识和了解仍十分欠缺，只从肿瘤病人临床观察中积累资料或寻找线索是相当有限的。要想了解肿瘤转移早期阶段所发生的各种改变及其分子机理，从而有效地进行干预非常困难。而任何新的肿瘤防治方法和措施包括新的抗癌药物、手术方法、射线剂量及投照部位和方法等未经动物实验便在肿瘤病人身上试用是不道德的甚至是违法的。因此，肿瘤动物模型在肿瘤转移机理的基础研究及抗癌新方法的疗效观察和评估中是绝对不可缺少的。
膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其中以移行上皮细胞来源的恶性肿瘤最为常见。武文森等于1993年建立了T739系小鼠膀胱移行细胞癌可移植模型。又从T739小鼠膀胱癌移植癌模型分离肿瘤细胞，命名为高转移膀胱癌细胞株，简称BTT(Bladder TransitionalEpithelium Tumor)。
在临床工作中医生主要通过各种影像学检查辨认和判断肿瘤转移病灶，包括X-光摄片、CT、磁共振及B超、同位素显影等。通常CT、磁共振的分辨能力最高，在选择最佳扫描序列及应用增强剂等情况下，CT、磁共振能分辨直径2mm以上的肿瘤病灶。而在基础研究中科学家则主要根据肉眼观察和病理组织切片观察确定实验动物模型肿瘤转移病灶。在常规病理切片中肿瘤细胞及转移病灶主要根据细胞大小、形态、核/浆比例、核的形态、染色质的疏密、染色深浅等与所在器官组织中的细胞比较来确定。通过病理学检查搜寻全身主要脏器和组织有无转移病灶费时、费工，连续切片困难，无法对肝、肺、脑、肾等器官进行全面检查尤其是对活组织器官内肿瘤生长与转移作动态观察分析并作出正确判断。为了区别肿瘤细胞与宿主体内的正常细胞，人们努力寻找肿瘤细胞特异的标志，通过制备特异的抗体作免疫组织化学染色进行区别，但迄今能找到的肿瘤标志非常有限，建立简便、敏感、易观察和判断地肿瘤细胞标记方法，对于准确判断肿瘤转移特别是微转移具有显著的临床意义。
有报道利用放射性同位素或荧光染料标记肿瘤细胞，由于同位素自身衰减、荧光染料自身淬灭，以及细胞在增殖分裂过程中同位素及荧光染料稀释，因此，标记维持时间不长，不适合作长期体内观察。另有报道利用基因转移技术将大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ)转入肿瘤细胞，通过筛选可获得稳定转导LacZ基因的肿瘤细胞。由于LacZ基因可整合到肿瘤细胞DNA中，因此，可随肿瘤细胞分裂而进入子细胞，持续不断在肿瘤细胞内表达，表达LacZ的肿瘤细胞经固定和染色后使无色的底物变为蓝色，很容易与宿主正常细胞区别。但是，显色必须固定、染色，因此，仍然不能作活组织及体内动态观察。
本发明的目的是提供一种新型的BTT细胞株其特征必须是：1)十分稳定，在肿瘤细胞生长、增殖及分裂过程中不会丢失和减弱。2)无毒、无害，并不因新的特征明显改变原来细胞的生物学特性。3)容易观察，只需通过常规手段和工具便可将新的BTT细胞与原来的BTT细胞及同系小鼠体内各种正常细胞区分开来。4)不需固定、染色等，操作简便。5)适合活细胞状态及体内动态观察。本发明的另一目的是提供新型BTT细胞株的建立方法，本发明的进一步目的是对新的BTT细胞株在同系小鼠体内的生长、浸润、转移等的瞬时状况和进展过程进行实时显示和跟踪，同时通过现有的方法对各种重要器官中肿瘤细胞的数量作出准确的测量和计算，本发明还有一个目的是在此基础上建立一种新的简便、准确、客观判断肿瘤转移的方法，以便动态观察移植瘤生长，以及在移植瘤生长过程中新生血管形成过程。
本发明以BTT细胞株为宿主细胞，将绿色荧光蛋白(简称GFP)基因转导入BTT细胞株，建立新型高转移膀胱癌细胞株，简称BTT-GFP细胞。
本发明通过下述方法建立导入GFP基因的新型BTT细胞株
(1)选择新的BTT细胞株独特标志物：在为BTT细胞选择独特标志物时，原则是新的标志物必须满足稳定，无毒无害，容易观察，不需固定、染色，适合作活细胞及体内动态观察等条件。要满足这些条件标志物最好在基因水平——即遗传标记。本发明选择GFP基因作为新的BTT细胞的标记。GFP来源于海洋中可自发荧光的水母。由GFP基因cDNA编码的蛋白质在受到蓝光或紫外光照射时可自发发出绿色荧光。通过基因改造产生的突变型GFP能发出更强的绿色荧光称增强型GFP(EGFP)。将EGFP表达质粒导入哺乳动物细胞内，GFP可在哺乳动物细胞内表达。表达GFP的细胞不需任何染色及其它处理，也不需要底物及辅助因子，即可通过荧光显微镜进行观察或被流式细胞仪所检测。研究工作表明GFP适量表达对宿主细胞没有毒性，也不明显改变宿主细胞的生物学行为。
(2)BTT细胞培养：BTT肿瘤细胞采用我国用BBN饮养T739小鼠诱导的膀胱癌中分离到的新的小鼠膀胱移行细胞癌细胞株(上海市第一人民医院)。BTT细胞培养采用含10％胎牛血清的1640培养基，培养条件为37C，5％CO2，隔天换液一次，每4天传代一次。
(3)将GFP基因转导入BTT细胞内：采用阳离子脂质体介导GFP基因转移。GFP编码基因采用真核表达质粒pEGFP-N1(clontech公司产品)，GFP的表达由人巨细胞病毒CMV基因启动子所调控，此外，该质粒还有药物抗性编码基因，由猴肉瘤病毒SV40抗原基因启动子调控，使被转染的细胞具有抗新霉素的能力。GFP质粒转染采用Gibco公司的阳离子脂质体，转染方法参照厂家推荐的条件，具体方法为，于转染的前一天将1×105BTT细胞接种于细胞培养盘内，培养过夜。转染前先将5μL脂质体及1.5μg质粒DNA分别加入500μL无血清培养基Opti-MEN I内，轻轻混匀后再将脂质体与质粒DNA混合，轻弹管壁混匀，室温放置30分钟。转染时先将培养基吸去，再用无血清培养基漂洗一次，加入脂质体-质粒混合物，37℃培养5小时，5小时后加入等体积含20％胎牛血清的Opti-MEN I培养基，37℃培养过夜。
(4)筛选持续、稳定、高水平表达GFP的BTT细胞：用荧光显微镜观察GFP表达情况，挑选阳性细胞，然后用胰蛋白酶消化，接种于细胞培养盘内，并按200-400μg/ml加入G418。第一周换液一次，第二周换液二次，第三周起隔天换液一次，每次换液均加入G418。G418筛选三周后出现抗性克隆，在荧光显微镜观察下标记GFP表达水平高并且十分均匀的抗性克隆。将所标记的克隆分离，加入50μL0.25％胰蛋白酶及25mM EDTA消化液，然后将细胞转入细胞培养板内培养，待长满后荧光显微镜观察并再次挑选GFP表达水平高并且均匀的克隆，消化后计数。按每孔2个细胞加入96孔培养板中进一步亚克隆。荧光显微镜观察挑选GFP表达水平高并且均匀的克隆，扩增后选择细胞生长方式、速度等无明显改变的细胞克隆大量扩增，然后便停用G418，隔天换液一次，每4天传代一次。每隔一代均用流式细胞仪检查，测GFP阳性表达细胞数与GFP表达水平，选择GFP表达水平高且阳性数高的克隆持续培养。
(5)作动物体内肿瘤生长与转移实验。
按常规方法将上述BTT-GFP细胞液对T739小鼠分别进行皮下接种、膀胱原位接种、角膜袋肿瘤模型制作和肿瘤耳窗模型制备，分别观察肿瘤生长及血尿、新生血管形成情况。T739小鼠是由昆明鼠与615系小鼠杂交形成的新品系，已成为我国公认的实验动物品系
本发明动物实验结果如下：
观察肿瘤血行与淋巴道播散及肺、肝、肾。脾引流淋巴结转移病灶，后腿皮下接种1×106肿瘤细胞后一周，接种部位肿瘤生长至直径0.5cm大小，同侧腹股沟淋巴结轻度肿大；二周后肿瘤直径达1.0cm大小，同侧腹股沟淋巴结明显肿大，直径约为3mm大小；三周时肿瘤直径达1.5cm大小，同侧腹股沟淋巴结长至5mm大小，并可见同侧锁骨下淋巴结及对侧腹股沟淋巴结肿大；4周时肿瘤直径达2.0-2.5cm，同侧腹股沟淋巴结长至6-7mm直径大小，同侧锁骨下淋巴结长至3-5mm直径大小，对侧腹股沟淋巴结长至2-3mm直径大小。大多数小鼠接种肿瘤细胞后4-5周死亡。解剖发现肺体积、重量明显增加，表面可见散在的点片状出血区，双侧肺门淋巴结轻度增大，偶尔可见散在的肿瘤结节。三周时肝脏体积有的无明显变化，有的轻度增加，四周时肝脏表面可见散在的黄白色肿瘤结节，五周时肿瘤结节数量明显增加，肾脏早期外观、颜色、形态、大小等无明显变化。四、五周时体积轻度增加，脾脏体积轻度至中等程度增加，形态与颜色无明显变化。
荧光显微镜观察肿瘤细胞接种部位及其后长出的整个肿瘤发出明显的绿色荧光与周围正常组织明显不同，切面中肿瘤呈绿色，其周边部肿瘤细胞生长活跃的区域绿色荧光比中央区域强。引流淋巴结表面及切面呈较均一的绿色荧光，肺组织表面及切面中可见发出绿色荧光的肿瘤细胞。早期肿瘤细胞数量较少，单个或3-5个肿瘤细胞弥散分布于整个肺组织中，偶尔可见血管内游离的单个肿瘤细胞。晚期肿瘤细胞数量明显增加，以弥漫扩散为主，除散在的单个细胞外，肿瘤细胞团体积增加，由数十个肿瘤细胞组成，偶尔可见明显的肿瘤结节，大小不一，大的直径可达1mm。肝脏的肿瘤细胞浸润与微转移早期表现为散在的单个或小团肿瘤细胞浸润，晚期则主要表现为明显的肿瘤结节，大小不等，大的直径超过2mm大小。有的既有散在的肿瘤细胞浸润，也有明显的肿瘤结节。晚期肾和脾表面及切面中有少量散在的肿瘤细胞浸润转移。多表现为单个或3-5个顶多十余个肿瘤细胞弥散浸润，较少观察到明显的肿瘤结节。膀胱原位接种肿瘤细胞后一周，下腹部可扪及肿大的膀胱，有的出现血尿，二周时下腹肿块更明显，血尿加重，大多数动物三周时死亡。解剖发现膀胱壁增厚，膀胱肿大约1.2×1.0×0.8cm大小，但表面光滑，双侧输尿管增粗，双肾体积明显增大。荧光显微镜观察整个膀胱表面及切面呈绿色。肾脏包膜下及实质内大量绿色肿瘤细胞浸润，肾门淋巴结肿大呈绿色，高倍镜下肾包膜、肾实质及肾门内均可见发绿色荧光的肿瘤细胞及明显的肿瘤结节或转移病灶。此外，荧光显微镜见肠系膜上无数增大的淋巴结、并有散在的肿瘤细胞围绕血管生长浸润等。
角膜袋肿瘤细胞移植后2-3周见角膜缘有明显的新生血管长入并可见发绿色荧光的肿瘤细胞生长，3-4周后眼球明显突出。双耳皮下接种肿瘤细胞，可见在大血管旁的肿瘤细胞可存活并继续生长，远离大血管的肿瘤细胞可向大血管附近迁徙。同时见大血管增粗及血管出芽及新生血管网形成等。
本发明含绿色荧光蛋白新型高转移膀胱癌细胞株利用GFP技术标记的BTT肿瘤细胞株结合皮下、膀胱原位、角膜袋及耳窗接种方法和技术可非常简便、直观、实时观察肿瘤细胞生长、浸润与转移，能全面、准确客观确定转移病灶的数量、大小，以及肿瘤块大小、边缘及肿瘤新生血管网等。从而对于研究肿瘤转移过程及其调控机理，为判断肿瘤预防与治疗新方法的效果等提供了一种十分简便，可靠的工具。
图面说明：
图1为体外培养的经GFP基因转导的小鼠膀胱癌细胞BTT-GFP荧光显微镜观察。(200倍放大)
图2为经GFP基因转导的小鼠膀胱癌细胞BTT-GFP皮下接种后3周，肺荧光显微镜观察，可见肺组织内有较多的散在的肿瘤细胞浸润。(200倍放大)
图3为经GFP基因转导的小鼠膀胱癌细胞BTT-GFP皮下接种4周后肝脏荧光显微镜观察。肝脏表面可见散在的发绿色荧光的肿瘤细胞和肿瘤微转移病灶。(50倍放大)
图4为肝脏血管内单个的发绿色荧光的肿瘤细胞。(400倍放大)
图5为转导基因的小鼠膀胱癌细胞BTT-GFP在小鼠耳部皮下生长过程的动态观察(荧光显微镜，接种后立即、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天照像)