糖基化血红蛋白的选择性测定方法.pdf

提供可以高精度且容易地测定样品中的血红蛋白的糖基化率的方法。用蛋白酶选择性地分解全血样品中的糖基化血红蛋白，使该糖基化血红蛋白分解物的糖基化部分与糖基化氨基酸氧化还原酶反应，通过测定该氧化还原反应可确定血红蛋白的糖基化率。另外，如图1所示，在全血样品中，由该方法得出的糖基化血红蛋白的测定值与HbAlc浓度之间存在相互关系，从而无需测定作为HbAlc的特征结构的α－氨基的糖基化部分，即可高精度且简便地由糖基化血红蛋白的测定值求出HbAlc量。

权利要求书
1.  血红蛋白糖基化量的测定方法，该方法通过用蛋白酶选择性地分解全血中的糖基化血红蛋白，使该糖基化血红蛋白分解物的糖基化部分与糖基化氨基酸氧化还原酶反应，通过测定该氧化还原反应来确定血红蛋白的糖基化量。

2.  权利要求1的测定方法，其中所述蛋白酶是选择性地分解糖基化血红蛋白的蛋白酶。

3.  权利要求2的测定方法，其中所述蛋白酶是选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的蛋白酶的至少一种蛋白酶。

4.  权利要求1的测定方法，其中所述与糖基化氨基酸氧化还原酶反应的糖基化血红蛋白分解物的糖基化部分是氨基酸残基侧链的糖基化氨基。

5.  权利要求4的测定方法，其中所述氨基酸残基侧链的糖基化氨基是赖氨酸残基以及精氨酸残基的至少一方的侧链的糖基化氨基。

6.  权利要求1的测定方法，其中所述氧化还原反应的测定是测定所述反应产生的过氧化氢量，或测定所消耗的酶量。

7.  权利要求6的测定方法，其中所述过氧化氢的测定使用了过氧化酶和因氧化而发色的底物。

8.  权利要求7的测定方法，其中所述因氧化而发色的底物是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲氨基)联苯胺钠。

9.  权利要求1的测定方法，其中相对于1mL全血，按1,000-10,000,000U的范围添加蛋白酶。

10.  权利要求1的测定方法，其中所述糖基化氨基酸氧化还原酶是催化下述生成过氧化氢的反应的酶，所述反应以选自糖基化蛋白、糖基化肽以及糖基化氨基酸的至少一种糖基化胺为底物，作用于所述糖基化胺的α-氨基糖基化部分和侧链氨基糖基化部分的至少一方，生成过氧化氢。

11.  权利要求1的测定方法，其中相对于1mL全血，按500-40,000U的范围添加糖基化氨基酸氧化还原酶。

12.  权利要求1的测定方法，其中所述测定样品是经过溶血处理的全血。

13.  HbAlc的测定方法，该方法通过准备根据权利要求1-12中任一项的测定方法得出的血红蛋白糖基化量与HbAlc量之间的相互关系作出的校准曲线，将由所述测定方法得出的全血样品中的血红蛋白糖基化量代入所述校准曲线，求出所述全血样品中的HbAlc量。

14.  权利要求13的测定方法，其中所述校准曲线是由标准样品的已知HbAlc量与根据权利要求1-12中任一项的测定方法得出的所述标准样品的血红蛋白糖基化量之间的相互关系作出的。

15.  用于测定血红蛋白糖基化量的测定试剂盒，它包含区别于其他蛋白和肽、选择性分解糖基化血红蛋白的蛋白酶。

16.  权利要求15的测定试剂盒，其中所述蛋白酶是选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶的至少一种蛋白酶。

17.  权利要求15的测定试剂盒，它还包含糖基化氨基酸氧化还原酶。

18.  权利要求17的测定试剂盒，其中所述糖基化氨基酸氧化还原酶是催化下述生成过氧化氢的反应的酶，所述反应以选自糖基化蛋白、糖基化肽以及糖基化氨基酸的至少一种糖基化胺为底物，作用于所述糖基化胺的α-氨基糖基化部分和侧链氨基糖基化部分的至少一方，生成过氧化氢。

19.  权利要求18的测定试剂盒，它还包含过氧化酶和因氧化而发色的底物。

20.  权利要求19的测定试剂盒，其中所述因氧化而发色的底物是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲氨基)联苯胺钠。

21.  用于测定血红蛋白糖基化量的测定试剂，它包含区别于其他蛋白和肽、选择性分解糖基化血红蛋白的蛋白酶。

22.  权利要求21的测定试剂，其中所述蛋白酶是选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶的至少一种蛋白酶。

23.  权利要求21的测定试剂，它还包含糖基化氨基酸氧化还原酶。

24.  权利要求23的测定试剂，其中所述糖基化氨基酸氧化还原酶是催化下述生成过氧化氢的反应的酶，所述反应以选自糖基化蛋白、糖基化肽以及糖基化氨基酸的至少一种糖基化胺为底物，作用于所述糖基化氨基的α-氨基糖基化部分和侧链氨基糖基化部分的至少一方，生成过氧化氢。

25.  权利要求24的测定试剂，它还包含过氧化酶和因氧化而发色的底物。

26.  权利要求25的测定试剂，其中所述因氧化而发色的底物是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲氨基)联苯胺钠。

说明书糖基化血红蛋白的选择性测定方法
技术领域
本发明涉及测定存在于全血中的血红蛋白的糖基化量的方法。
背景技术
血液中的糖基化血红蛋白由于反映生物体内血糖值的过去的情况，因此被作为糖尿病的诊断、治疗等的重要指标。
这类糖基化血红蛋白通过例如高效液体色谱(HPLC)法、微型柱法、免疫法等，测定血红蛋白的糖基化量或糖基化率。最近，开发了可以通过采用糖基化氨基酸氧化还原酶(FAOD)的酶法测定糖基化蛋白质的方法，尝试应用该酶法进行血红蛋白糖基化量(糖基化血红蛋白)的测定。
发明的公开
但是，该方法有如下问题：糖基化血红蛋白是血细胞内成分，因此测定时血细胞的溶血处理是不可缺的。但是，在以全血为样品的情况下，若以全血的状态使血细胞溶血，则血细胞成分与血浆成分呈混合状态。因此，进行了溶血处理的全血样品中，不只存在作为血细胞中成分的糖基化血红蛋白，特别是还存在作为血浆中成分的、含有率高的白蛋白，以及其糖基化物糖基化白蛋白，这样上述糖基化白蛋白也同样受到FAOD的作用，与糖基化血红蛋白共同被测定。因而，为了消除上述糖基化白蛋白等其他糖蛋白的影响，无疑要从全血样品中分离血浆与血细胞，操作也很繁杂。
因此，本发明的目的是提供可以不进行全血样品的分离、不受其他糖蛋白的影响、正确且容易地测定上述全血样品中的血红蛋白糖基化量的血红蛋白糖基化量测定方法。
为了达到上述目的，本发明的血红蛋白糖基化量测定方法使用蛋白酶选择性地将全血中的糖基化血红蛋白分解，使该糖基化血红蛋白分解物的糖基化部分与FAOD反应，通过测定该氧化还原反应来决定血红蛋白的糖基化量。本发明中，“血红蛋白糖基化量”也包括血红蛋白糖基化率。
这样，如果与其他蛋白质、肽区别开，只将糖基化血红蛋白通过蛋白酶选择性(特异性)地分解，由于FAOD难以与蛋白质以及长的多肽链作用，因此无需对全血进行血细胞分离操作，即可不受其他糖基化蛋白质、特别是糖基化白蛋白的影响，测定血红蛋白糖基化量。从而，测定样品也可使用例如溶血处理过的全血样品。
在本发明的测定方法中，选择性地分解糖基化血红蛋白时，例如只要使用选择性地分解糖基化血红蛋白的蛋白酶作为上述蛋白酶即可。本发明对于使用选择性地分解糖基化血红蛋白的蛋白酶的方法并无特别限定，也可以通过其他手段选择性地分解糖基化血红蛋白。另外，也可以将一般的蛋白酶与选择性地分解糖基化血红蛋白的蛋白酶并用。
上述蛋白酶优选菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的蛋白酶。上述来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶有例如商品名プロテア一ゼN(シグマ·アルドリツチ社制造)、商品名プロテア一ゼN“アマノ”(天野エンザイム(株)制造)等。上述金属蛋白酶有来源于芽孢杆菌(Bacillus)属的金属蛋白酶(EC3.4.24.4)(例如，东洋纺织(株)制造：商品名トヨチ一ム)等。其中更优选金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，特别优选金属蛋白酶。
本发明的测定方法中，优选上述FAOD是催化下述生成过氧化氢的反应的酶；所述反应以选自糖基化蛋白质、糖基化肽以及糖基化氨基酸中的至少一种糖基化胺为底物，与上述糖基化胺中的α-氨基糖基化部分和侧链氨基糖基化部分的至少一方作用，生成过氧化氢。
本发明的测定方法中，与上述FAOD反应的糖基化血红蛋白分解物的糖基化部分因使用的FAOD的催化反应的不同而不同，但优选例如氨基酸残基侧链的糖基化氨基、糖基化α-氨基。其中，因后面叙述的具有催化功能的FAOD容易作用，因此优选上述氨基酸残基侧链的糖基化氨基，例如赖氨酸残基侧链的糖基化氨基、精氨酸残基侧链的糖基化氨基等。
本发明的测定方法中，上述蛋白酶优选相对于1ml全血以1,000-10,000,000U的范围添加。另外，上述FAOD优选相对于1ml全血以500-40,000U的范围添加。
本发明地测定方法中，上述氧化还原反应的测定优选是对由上述反应生成的过氧化氢量的测定，或者上述反应所消耗的氧气量的测定。
本发明的测定方法中，上述过氧化氢量的测定优选使用过氧化酶(以下称为“POD”)以及因氧化而发色的底物。
本发明的测定方法中，作为上述因氧化而发色的底物，并无特别限定，有例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)联苯胺钠、邻苯二胺(OPD)、トリンダ一试剂和4-氨基安替比林组合而成的底物。上述トリンダ一试剂有例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除上述4-氨基安替比林之外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在这样的发色底物中，特别优选N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)联苯胺钠。
本发明的HbAlc的测定方法为以下测定方法：根据上述本发明的血红蛋白糖基化量测定方法，准备由血红蛋白糖基化量与HbAlc量的相互关系作成的校准曲线，将按照上述本发明的血红蛋白糖基化量测定方法得出的全血样品中的血红蛋白糖基化量代入上述校准曲线，从而求出上述全血样品中的HbAlc的量。
本发明的发明者们进行了更深入的研究，结果发现：根据上述本发明的血红蛋白糖基化量测定方法求得的全血样品中的血红蛋白糖基化量与上述全血样品中的HbAlc的量相互关系较大。HbAlc是指血红蛋白的β-链N末端的α-氨基被糖基化的糖基化血红蛋白，在糖基化血红蛋白中也被作为特别重要的糖尿病诊断等的指标。根据以往的方法，HbAlc的测定需要使FAOD与糖基化部分中HbAlc的特征性结构部位β-链N末端的α-氨基糖基化部分进行特异性作用，测定其氧化还原反应。这种情况下，要求使用的FAOD对于例如α-氨基糖基化部位的底物特异性高，以及对上述α-氨基糖基化部位要充分作用等，因此只好采取特别的方法。而根据本发明的HbAlc测定方法，则可以准确且简单地测定作为糖尿病诊断的重要指标的HbAlc，使HbAlc测定应用于临床检验等成为可能。
本发明的HbAlc测定方法中，上述校准曲线优选是由标准样品的已知HbAlc量与根据上述本发明的血红蛋白糖基化量测定方法测得的上述标准样品的血红蛋白糖基化量之间的相互关系作出的校准曲线。
本发明的测定试剂盒是血红蛋白糖基化量的测定所使用的测定试剂盒，内含区别于其他蛋白质以及肽、选择性分解糖基化血红蛋白的蛋白酶。使用该试剂盒，可以容易地实施上述本发明的测定方法。
优选本发明的测定试剂盒中的蛋白酶是选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶中的至少一种蛋白酶。另外，优选本发明的测定试剂盒还含有糖基化氨基酸氧化还原酶。优选上述糖基化氨基酸氧化还原酶是催化下述生成过氧化氢的反应的酶，所述反应以选自糖基化蛋白质、糖基化肽以及糖基化氨基酸中的至少一种糖基化胺为底物，与上述糖基化胺中的α-氨基糖基化部分以及侧链氨基糖基化部分的至少一方作用，生成过氧化氢。优选本发明的测定试剂盒还包含过氧化酶以及因氧化而发色的底物。优选上述因氧化而发色的底物是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲氨基)联苯胺钠。
本发明的测定试剂是血红蛋白糖基化量的测定所使用的测定试剂，内含区别于其他蛋白质以及肽、选择性地分解糖基化血红蛋白的蛋白酶。使用该试剂，可以容易地实施上述本发明的测定方法。
优选本发明的测定试剂中的蛋白酶是选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶中的至少一种蛋白酶。另外，优选本发明的测定试剂中还含有糖基化氨基酸氧化还原酶。优选上述糖基化氨基酸氧化还原酶是催化下述生成过氧化氢的反应的酶；所述反应以选自糖基化蛋白质、糖基化肽以及糖基化氨基酸中的至少一种糖基化胺为底物，与上述糖基化胺中的α-氨基糖基化部分以及侧链氨基糖基化部分的至少一方作用，生成过氧化氢。优选本发明的测定试剂还包含过氧化酶以及因氧化而发色的底物。优选上述因氧化而发色的底物是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲氨基)联苯胺钠。

附图简述
图1是表示本发明测定方法的一个实施例中HbAlc浓度与吸光度的相互关系的图。
图2是表示本发明测定方法的其他实施例中从校准曲线求出的HbAlc(％)与用自动测定仪器测定的HbAlc(％)的相互关系的图。
实施发明的最佳方式
优选本发明的测定方法中可以使用的FAOD是催化下式(1)所示反应的FAOD。

                         ...(1)
上述式(1)中，R1-CO-CH2-NH-R2为例如糖基化蛋白质、糖基化肽以及糖基化氨基酸。上述式(1)中，R1表示羟基或来源于糖基化反应前的糖的残基(糖残基)。当糖基化反应前的糖为醛糖时，上述糖残基(R1)是醛糖残基；当糖基化反应前的糖为酮糖时，则是酮糖残基。例如，糖基化反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多利重排，糖基化反应后的结构为果糖结构，这种情况下，糖残基(R1)成为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R1)可以用例如
-[CH(OH)]n-CH2OH
表示，n为0-6的整数。
上式(1)中，对R2并无特别限定，但α-氨基被糖基化的情况与α-氨基之外的氨基被糖基化的情况不同。
上式(1)中，α-氨基被糖基化时，R2为下式(2)所表示的氨基酸残基或者肽残基。
-CHR3-CO-R4                        ...(2)
上式(2)中，R3表示氨基酸侧链基，R4表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如，可以用下式(3)表示。下式(3)中，n是至少为0的整数，R3与上述同样，表示氨基酸侧链基。
-(NH-CR3H-CO)n-OH                  ...(3)
另外，上式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖基化(氨基酸侧链基被糖基化)时，R2可以用下式(4)表示。

上式(4)中，R5表示氨基酸侧链基中被糖基化的氨基以外的部分。例如，当被糖基化的氨基酸为赖氨酸时，R5为
-CH2-CH2-CH2-CH2-
例如，当被糖基化的氨基酸为精氨酸时，R5为
-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-
上式(4)中，R6为氢、氨基酸残基或肽残基，例如可用下式(5)表示。下式(5)中，n是至少为0的整数，R3与上述同样，表示氨基酸侧链基。
-(CO-CR3H-NH)n-H             ...(5)
上式(4)中，R7为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可用下式(6)表示。下式(6)中，n是至少为0的整数，R3与上述同样，表示氨基酸侧链基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH            ...(6)
只要使用的FAOD的催化反应是如上述的反应，则并无特别限定，但优选是作用于糖和上式(1)中α-氨基以外的氨基结合的糖基化部位(上述R2为上式(4)中所表示的结构)的催化反应。另外，上述FAOD不只限于这种催化功能，还可以同时具有作用于糖和α-氨基结合的糖基化部位(上述R2为上式(2)中所表示的结构)的催化功能。
这样的FAOD有例如来源于镰孢属、赤霉属、曲霉属的，也可以使用市售的商品名フルクトシル·アミノ酸オキシダ一ゼ(旭化成社制造)、商品名ケトアミンオキシダ一ゼ(ジエンザイム社制造)等。
下面，就本发明的血红蛋白糖基化量测定方法的一个例子进行说明。
首先，进行全血溶血。该溶血方法并无特别限定，可以使用例如使用表面活性剂的方法、超声波法、利用渗透压差的方法等。其中，从操作简便等理由来看，优选使用表面活性剂的方法。
上述表面活性剂可以使用例如聚氧乙烯-对-叔辛基苯基醚(Triton系表面活性剂等)、聚氧乙烯脱水山梨醇烷基酯(Tween系表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij系表面活性剂等)等非离子表面活性剂。具体来说，有例如商品名TritonX-100、商品名Tween-20、商品名Brij35等。上述表面活性剂的处理条件，通常在处理溶液中的血细胞浓度为1-10％体积的情况下，添加上述表面活性剂，使上述处理溶液中的浓度为0.1-1％重量，在室温下搅拌5秒-1分钟左右即可。
另外，在上述利用渗透压差的情况下，例如相对于全血的体积，添加2-100倍体积的精制水，使其溶血。
接着，用上述蛋白酶对上述溶血样品进行蛋白酶处理，选择性地分解上述样品中的糖基化血红蛋白。上述蛋白酶处理通常在缓冲液中进行，其处理条件根据例如使用的蛋白酶的种类、糖基化血红蛋白的量等适当决定。
在使用木瓜蛋白酶作为上述蛋白酶，处理上述溶血样品时，通常，反应液中的蛋白酶浓度为100-30,000U/L、反应液中的血红蛋白浓度为0.1-40g/L、反应温度为15-60℃、反应时间为10分钟-40小时、pH值范围为5-9。另外，上述缓冲液的种类也无特别限定，例如：可以使用Tris盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液、磷酸缓冲液、ADA缓冲液、枸橼酸缓冲液、乙酸缓冲液等。
另外，在使用金属蛋白酶作为上述蛋白酶，处理上述溶血样品时，例如可以使反应液中的蛋白酶浓度为10-10,000KU/L、反应液中的血红蛋白浓度为0.02-40g/L、反应温度为15-60℃、反应时间为2分钟-40小时、pH值范围为6-11，优选反应液中的蛋白酶浓度为100-8,000KU/L、反应液中的血红蛋白浓度为0.1-10g/L、反应温度为15-60℃、反应时间为2分钟-1小时、pH值范围为7-10。上述缓冲液可以使用与上述同样的缓冲液。另外，也可同样使用其他的蛋白酶。
接着，将经过上述蛋白酶处理得到的糖基化血红蛋白分解物用FAOD处理。通过该FAOD处理催化以上式(1)所表示的反应。具体来说，FAOD作用于例如上述糖基化血红蛋白分解物的赖氨酸残基侧链以及精氨酸残基侧链的糖基化氨基。另外，根据FAOD种类的不同，通过其催化功能，还可以作用于糖基化α-氨基。
优选该FAOD处理与上述蛋白酶处理同样在缓冲液中进行。上述缓冲液并无特别限定，可以使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。
处理条件例如可以是反应液中的FAOD浓度为200-30,000U/L、反应液中的血红蛋白浓度为0.02-30g/L、反应温度为15-37℃、反应时间为1-20分钟、pH值范围为7-9；或者是反应液中的FAOD浓度为1,000-20,000U/L、反应液中的血红蛋白浓度为0.1-5g/L、反应温度为15-37℃、反应时间为1-5分钟、pH值范围为7-9。
接着，用由上述POD以及因氧化而发色的底物，利用氧化还原反应测定上述FAOD处理产生的过氧化氢的量。
通过该POD的氧化还原反应通常在缓冲液中进行，其条件由例如过氧化氢浓度等因素适当决定。通常，反应液中的POD浓度为1-100,000IU/L、底物浓度为0.0001-1mmol/L、反应温度为20-37℃、反应时间为1-5分钟、pH值为6-9，优选反应液中的POD浓度为1,000-50,000IU/L、底物浓度为0.0002-0.1mmol/L、反应温度为20-37℃、反应时间为1-5分钟、pH值为6-9。另外，上述缓冲液并无特别限定，可以使用与上述FAOD处理等同样的缓冲液等。
另外，除上述使用POD等的酶法外，也可以通过例如电气方法测定上述过氧化氢量。
在使用上述因氧化而发色的底物时，可以通过用分光光度计测定其发色(反应液的吸光度)来测定过氧化氢的浓度，由此测定上述样品中的血红蛋白糖基化量。
该测定的各处理步骤可以如上所述分别进行，也可以例如按如下所示的组合同时进行。
1：溶血处理+蛋白酶处理
2：蛋白酶处理+FAOD处理
3：FAOD处理+POD处理
另外，上述FAOD、POD以及上述底物的添加顺序也无特别限定。
下面，就本发明的HbAlc的测定方法举例进行说明。
首先，与上述同样测定全血样品的血红蛋白糖基化量。另一方面，准备糖基化血红蛋白中HbAlc量已知的糖基化血红蛋白标准液，与上述同样测定其血红蛋白糖基化量，并作出表示该标准液的测定值与已知HbAlc量之间关系的校准曲线。如上所述，上述血红蛋白糖基化量的测定值与HbAlc量存在相互关系，因此将根据本发明测定方法测定的上述全血样品中的血红蛋白糖基化量值代入该校准曲线，可以求出上述全血样品中的HbAlc量。制作校准曲线时，作为上述血红蛋白糖基化量的测定值，不仅可以是最终求出的血红蛋白糖基化量，也可以是上述血红蛋白糖基化量测定中由POD处理得到的反应液的吸光度值，也可以使用由上述吸光度求出的过氧化氢量。这样，根据本发明的HbAlc测定方法，发明者们利用新发现的相互关系，可以由血红蛋白糖基化量的测定值高精度且简便地测定出全血中的HbAlc量。
实施例
(实施例1)
将含有糖基化血红蛋白以及糖基化白蛋白的样品用木瓜蛋白酶处理，再通过FAOD进行氧化还原反应，对产生的过氧化氢进行测定。测定所使用的样品、试剂以及方法如下所示。
(样品)
糖基化率22.5％的人血清白蛋白(シグマ社制造)
糖基化率14％的人血红蛋白
该人血红蛋白样品按照以下的方法进行配制，其糖基化率通过使用了离子交换柱的HPLC法求得。
(人血红蛋白的配制)
将健康者的全血进行离心分离(1500G、10分钟)，回收血细胞，将其用生理盐水清洗数次后，添加几乎等量的精制水，使血细胞溶血。将该溶血溶液进行离心分离，除去血细胞膜，之后加入到商品名GLYCO·GELII(ピアス社制造)中，按照通常方法制备分离含有糖基化蛋白的流分，将其作为人血红蛋白样品。
(氧化还原反应液A的组成)
FAOD(旭化成工业社制造，下同)                        2.09KU/L
POD(TypeIII：东洋纺织社制造，下同)                  730U/L
N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲氨基)联苯胺钠
(商品名DA64：和光纯药工业社制造，下同)              1.46mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)                              73mmol/L
(方法)
向1ml的上述各样品(人血清白蛋白、人血红蛋白)中添加1ml的1KU/L木瓜蛋白酶(シグマ·アルドリツチ社制造)，在40℃下反应24小时。向0.018ml的这些溶液中分别添加0.15ml上述氧化还原反应液A，开始氧化还原反应。用生化自动分析装置(商品名JCA-BM8：日本电子社制造，下同)测定反应开始5分钟后各反应液在主波长694nm、副波长884nm下的吸光度。结果示于下表1中。
(实施例2)
除用1ml的1g/L菠萝蛋白酶(天野エンザイム株式会社，下同)代替木瓜蛋白酶之外，与实施例1同样对上述各样品(人血清白蛋白、人血红蛋白)进行处理，测定吸光度。结果示于下表1中。
(比较例1)
除用1ml的1g/Lα-胰凝乳蛋白酶代替木瓜蛋白酶之外，与上述实施例1同样对上述各样品(人血清白蛋白、人血红蛋白)进行处理，测定吸光度。结果示于下表1中。
(表1)
            蛋白酶               人血清白蛋白        人血红蛋白
                                 (吸光度)            (吸光度)
实施例1     木瓜蛋白酶           0.014               0.090
实施例2     菠萝蛋白酶           0.0008              0.037
比较例1     α-胰凝乳蛋白酶      0.063               0.042
如上表1所示，由实施例1及2的木瓜蛋白酶及菠萝蛋白酶在人血红蛋白样品中可见较高的吸光度，并且，在人血清白蛋白样品中只可见微弱的吸光度，因此得知这些蛋白酶几乎不分解糖基化白蛋白，而可以选择性地分解糖基化血红蛋白。而比较例1的α-胰凝乳蛋白酶对于上述两种样品均可见同样高的吸光度，可知其不只对糖基化血红蛋白，对糖基化白蛋白也发生作用，不具选择性。
(实施例3以及比较例2)
分别以全血、血浆、血细胞作为样品，用各种蛋白酶处理，进行糖基化血红蛋白的测定。
(全血样品的配制)
用加入了肝素钠的采血管从健康人体采集全血，向其中加入精制水稀释8倍，将使上述全血中的血细胞溶血后的样品作为全血样品。
(血浆样品的配制)
将上述健康者的全血进行离心分离(1500G、10分钟)，分离除去血细胞，向得到的上清液中添加精制水，稀释8倍后作为血浆样品。
(血细胞样品的配制)
向由上述离心分离得到的血细胞中添加精制水，稀释到16倍。将使上述血细胞中溶血后的样品作为血细胞样品。
(蛋白酶)
将菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶(ロツシユ社制造)、弹性蛋白酶(和光纯药工业社制造)、α-胰凝乳蛋白酶(和光纯药工业社制造)、蛋白酶K(和光纯药工业社制造)溶解于精制水中，分别配制为浓度4g/L的各种蛋白酶溶液。
(氧化还原反应液B的组成)
POD                                     20KU/L
商品名DA64                              0.04mmol/L
磷酸钾缓冲液(pH 7.0)                    0.1mol/L
(氧化还原反应液C的组成)
FAOD                                    14.3KU/L
磷酸钾缓冲液(pH 7.0)                    0.1mol/L
(测定方法)
将0.2mL的上述各样品、0.1mL上述蛋白酶溶液以及0.7mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0)混合，使其在37℃反应24小时。反应后，将各反应液加入商品名ウルトラフリ一4ユニツト5K(ミリポア社制造)中进行离心分离，回收滤液。向25μL的上述各滤液中添加45μL上述氧化还原反应液B，5分钟后再添加20μL上述氧化还原反应液C，开始反应。用上述生化自动分析装置测定反应开始5分钟后各反应液在主波长694nm、副波长884nm下的吸光度。结果示于下表2中。其中，菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶为实施例3，弹性蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K为比较例2。
(表2)
样品
蛋白酶               血浆          血细胞        全血
                     (吸光度)      (吸光度)      (吸光度)
实施例3
菠萝蛋白酶           0.0           0.009         0.002
木瓜蛋白酶           0.001         0.021         0.015
比较例2
弹性蛋白酶           0.012         0.019         0.015
α-胰凝乳蛋白酶      0.015         0.016         0.013
蛋白酶K              0.036         0.027         0.034
如上表2所示，在实施例3中几乎不能确认血浆样品的吸收。由此可知，实施例3使用的蛋白酶可以选择性地分解糖基化血红蛋白，几乎不分解例如来源于血浆的糖基化白蛋白等。而在比较例2中，确认在应该不存在糖基化血红蛋白的血浆样品也有吸收。认为这是由于比较例使用的蛋白酶无选择性地分解糖基化血红蛋白和其他糖基化蛋白，例如血浆样品中的糖基化白蛋白等被分解，结果看到了吸收。
(实施例4)
(糖基化血红蛋白标准液的配制)
将HbAlc标准试剂(SRL社制造)溶解于精制水，配制HbAlc浓度分别为4.3％、7.8％、11.2％、14.7％且血红蛋白浓度为10g/L的糖基化血红蛋白标准液。另外，将HbAlc标准试剂(国际试药社制造)溶解于精制水，配制HbAlc浓度分别为5.5％、10.8％且血红蛋白浓度为10g/L的糖基化血红蛋白标准液。
(各种蛋白酶溶液的配制)
将各种蛋白酶溶解于精制水，配制浓度2g/L的菠萝蛋白酶F(天野エンザイム株式会社制造)溶液以及浓度1g/L的木瓜蛋白酶(ロツシユ社制造)溶液。
(测定方法)
将0.5mL各浓度的糖基化血红蛋白标准液、0.4mL 蛋白酶溶液以及0.1mL的1.0mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)混合，使其在37℃反应24小时。反应后，将上述反应液加入商品名ウルトラフリ一MC分子量5000(ミリポア社制造，下同)中进行离心分离，回收滤液。将25μL上述滤液用精制水稀释2倍后，向该稀释液中添加45μL上述氧化还原反应液B，5分钟后，再添加20μL上述氧化还原反应液C，开始反应。之后用上述生化自动分析装置测定反应开始5分钟后各反应液在主波长694nm、副波长884nm下的吸光度。结果示于下表3及图1中。
(表3)
                                   HbAlc(％)
蛋白酶          4.3       5.5      7.8      10.8     11.2     14.7
木瓜蛋白酶      0.010     0.016    0.026    0.043    0.041    0.059
菠萝蛋白酶      0.002     0.004    0.005    0.014    0.008    0.010
图1表示糖基化血红蛋白标准溶液中的HbAlc浓度与吸光度的相互关系。对于木瓜蛋白酶的相关式是y＝210x+2.2，其相关系数是r＝0.998；对于菠萝蛋白酶的相关式是y＝1321x+1.0，其相关系数是r＝0.968。
如上表3以及图1所示，伴随着糖基化血红蛋白标准液中HbAlc浓度的增加，吸光度也增加，由此得知HbAlc浓度与吸光度(相当于根据本发明的测定方法测得的糖基化血红蛋白的值)的相互关系较大。因而，如果事先准备好该HbAlc浓度与上述吸光度之间的校准曲线，如上所述测定全血样品中的糖基化血红蛋白，则可以由该测定值与上述校准曲线间接地求出全血样品中的HbAlc量。
(实施例5)
将溶血样品用金属蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶进行处理，根据本发明的测定方法测定血红蛋白的糖基化量，再从中求出HbAlc量。测定中所用的样品、试剂以及方法如下所示。
(样品的配制)
将采集的健康者以及糖尿病患者的全血(合计12份检样)分别静置约6小时，使红细胞沉淀，向0.1mL这些血细胞部分中添加1.4mL的0.05％重量TritonX-100水溶液使其溶血，以此作为溶血样品。
(标准液的配制)
将HbAlc标准试剂(国际试药社制造)溶解于0.05％重量的TritonX-100水溶液中，配制HbAlc浓度(％)分别为5.5％、10.5％且血红蛋白浓度为200g/L的糖基化血红蛋白标准液。
(蛋白酶溶液的配制)
将金属蛋白酶(东洋纺织社制造)、商品名プロテア一ゼN“アマノ”(天野エンザイム株式会社制造)以及木瓜蛋白酶(ロシユ社制造)溶解于精制水中，配制成浓度1g/L的各种蛋白酶溶液。
(氧化还原反应液D)
POD                                         20KU/L
商品名DA-64                                 0.04mmol/L
磷酸缓冲液(pH 8.0)                          0.8mol/L
(氧化还原反应液E)
FAOD                                     14.3KU/L
磷酸钾缓冲液(pH 8.0)                     0.1mmol/L
(血红蛋白糖基化量的测定方法)
将0.2mL样品、0.16mL蛋白酶溶液以及0.04mL的0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)混合，使其在37℃反应36小时。反应后，将上述反应液加入上述商品名ウルトラフリ一MC分子量5000中进行离心分离，回收滤液。将25μL上述滤液用精制水稀释2倍后，向该稀释液中添加45μL氧化还原反应液D，5分钟后添加20μL氧化还原反应液E，开始反应。测定反应开始2分钟后反应液在主波长751nm、副波长884nm下的吸光度。该测定值即为相当于血红蛋白的糖基化量的吸光度。
(血红蛋白浓度的测定方法)
用商品名ヘモグロビンテストワコ一(和光纯药工业社制造)，根据氰化正铁血红蛋白法测定样品的血红蛋白浓度。
(制作校准曲线)
对于上述各标准液，用自动测定仪器(商品名HA-8150：ア一クレイ株式会社制造)测定HbAlc浓度(％)。一方面，根据本发明的上述血红蛋白糖基化量的测定方法，测定上述各标准液的相当于血红蛋白糖基化量的吸光度，另一方面，根据上述血红蛋白浓度测定方法测定血红蛋白浓度。然后，用相当于上述血红蛋白糖基化量的吸光度除以血红蛋白浓度，由所得百分率(％)和上述自动测定仪器得出的测定值(％)作出一元回归方程，以此作为校准曲线。上述百分率与血红蛋白的糖基化率(％)成比例。下面表示的是使用上述各蛋白酶时校准曲线的方程。
(校准曲线)
蛋白酶一元回归方程
金属蛋白酶                        y＝15846x+3.2
プロテア一ゼN“アマノ”                        y＝16659x+3.3
木瓜蛋白酶                        y＝17258x+3.4
(HbAlc的测定方法)
根据上述血红蛋白糖基化率的测定方法测定上述各溶血样品的相当于血红蛋白的糖基化量的吸光度，根据上述血红蛋白浓度的测定方法测定血红蛋白浓度。然后，将用相当于上述糖基化量的吸光度除以上述血红蛋白浓度所得的百分率作为血红蛋白糖基化率，通过将该百分率代入上述各校准曲线，求出上述样品中的HbAlc量。另外，由上述自动测定仪器测定上述各样品的HbAlc量作为对照。将这些结果表示在图2中。图2表示根据本发明的测定方法从校准曲线求出的HbAlc量与上述自动测定仪器测定的HbAlc量之间的相互关系。
由图示可以看出：根据本发明的测定方法从校准曲线求出的HbAlc(％)与上述自动测定仪器测定的HbAlc(％)测定值之间的相关系数非常高，金属蛋白酶为0.9937、プロテア一ゼN为0.993、木瓜蛋白酶为0.9941，可以与上述自动测定仪器同样的测定精度求出HbAlc量。
(实施例6)
将添加了血浆样品的溶血样品用金属蛋白酶处理，测定血红蛋白的糖基化量，来研究添加上述血浆样品而引起的上述糖基化量的变化。
(样品的配制)
将采集的健康者(1份检样)以及糖尿病患者的全血(总检样：患者检样、患者检样2)离心分离(1000g、约15分钟)，回收各检样的血细胞部分及血浆部分。然后，对每个检样，向0.01mL的血细胞部分中添加规定量(0mL、0.005mL、0.010mL、0.015mL、0.020mL)的血浆部分，向该混合液中分别加入0.3mL下述溶血试剂使其溶血，以此作为溶血样品。
然后，向0.01mL上述各溶血样品中加入0.065mL下述金属蛋白酶试剂，在37℃温育5分钟。再添加0.045mL下述氧化还原反应液F，于37℃温育2分钟，之后测定上述反应液在主波长751nm、副波长805nm下的吸光度。该测定值是相当于血红蛋白的糖基化量的吸光度。由于反应液量根据血浆部分添加量的不同而不同，将各反应液的经补正的吸光度表示在下表4中。
(溶血试剂)
聚氧乙烯月桂基醚                          9g/L
CHES缓冲液(pH 9.4)                        100mmol/L
(金属蛋白酶试剂：pH 5.5)
金属蛋白酶(东洋纺织社制造)                4000KU/L
WST-3(同仁化学社制造)                     2mmol/L
MES                                       5mmol/L
CaCl2                                    5mmol/L
NaCl                                      50mmol/L
※WST-3：2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓一钠盐
(氧化还原反应液F)
FAOD                                      30KU/L
POD                                       90KU/L
DA-64                                     0.06mmol/L
磷酸缓冲液(pH 7.0)                        200mmol/L
(表4)
血浆部分添加量    健康者检样      糖尿病         糖尿病
(mL)                              患者检样1      患者检样2
0                 0.0215          0.0283         0.0348
0.005             0.0216          0.0278         0.343
0.010             0.0196          0.0283         0.350
0.015             0.0204          0.0289         0.354
0.020             0.0212          0.0288         0.359
由上表4所示可以看出即使按各种浓度向血细胞部分添加血浆部分，所得到的吸光度也几乎不发生变化。由此可知，根据本发明的测定方法，则血浆中的糖基化蛋白对于糖基化血红蛋白的糖基化量的测定不产生影响。
产业上的可利用性
如上所述，按照本发明的测定方法，无需进行血细胞分离，即可简便且高精度测定全血样品中的糖基化血红蛋白的糖基化率。另外，由本发明的测定方法得到的血红蛋白糖基化量的测定值与HbAlc量之间存在大的相互关系，因此如果由该相互关系作出校准曲线，则只需测定全血样品中糖基化血红蛋白的糖基化量，即可高精度且简便地确定HbAlc量。因而，如果将本发明的测定方法应用于例如临床检验等领域，则可以容易地测定大量的检样，进一步提高糖基化血红蛋白，特别是HbAlc作为糖尿病诊断等的指标物质的可靠性以及重要性。