新的抗IGF－IR抗体及其应用.pdf

本发明涉及能够与人胰岛素样生长因子I受体IGF－IR特异结合，特别是鼠源、嵌合和人源化的单克隆抗体，以及编码这些抗体的氨基酸和核酸序列。本发明还涉及应用这些抗体作为过度表达IGF－IR的癌症或任何与所述受体过度表达有关的病理状况的预防和/或治疗癌症的药物，以及用于诊断与IGF－IR受体过度表达有关的试剂盒。发明进一步包括这种抗体与抗EGFR抗体和/或化合物和/或抗癌剂或毒素共轭药剂联合的产物和/或组合物，及其预防和/或治疗某些癌症的应用。

权利要求书
1.  一种分离的抗体，或其功能片段之一，所述的抗体或其所述片段之一能够与人胰岛素样生长因子I受体IGF-IR结合，如果需要，能够抑制其配基IGF1和/或IGF2的自然附着，和/或能特异地抑制所述IGF-IR受体的酪氨酸激酶活性，其特征是它含有包括至少一个互补决定区CDR的轻链，CDR选自序列SEQ ID No.2、4或6，或其序列在最优排列后与序列SEQ ID No.2、4或6具有至少80％同一性的至少一个CDR，或其特征是含有包括至少一个CDR的重链，CDR选自SEQ ID No.8、10和12序列，或其序列在最优排列后与序列SEQID No.8、10和12具有至少80％同一性的至少一个CDR。

2.  如权利要求1所要求的抗体或其功能片段之一，其特征是它含有一个重链，它包括至少一个序列SEQ ID No.12的CDR或在最优排列后与序列SEQ IDNo.12具有至少80％同一性的序列。

3.  如权利要求1或2所要求的抗体或其功能片段之一，其特征是它含有一个重链，包括序列SEQ ID No.8、10和12的三个CDR中的至少两个或三个CDR，或在最优排列后分别与序列SEQ ID No.8、10和12具有至少80％同一性的序列的三个CDR中的至少两个或三个CDR。

4.  如权利要求1至3之一所要求的抗体或其功能片段之一，其特征是它含有一个轻链，包括选自SEQ ID No.2、4或6序列的至少一个CDR，或其序列在最优排列后与序列SEQ ID No.2、4或6具有至少80％同一性的CDR。

5.  如权利要求1至4之一所要求的抗体或其功能片段之一，其特征是它含有一个轻链，包括序列SEQ ID No.2、4和6的三个CDR中的至少两个或三个CDR，或在最优排列后与序列SEQ ID No.2、4和6分别具有至少80％同一性的三个CDR中的至少两个或三个CDR。

6.  如权利要求1至5之一所要求的抗体或其功能片段之一，其特征是它不以显著的方式与人胰岛素受体IR附着。

7.  如权利要求1至6之一所要求的抗体，其特征是所述的功能片段选自Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc和完整体，或任何其半衰期已经被增加的片段，如pegylated片段。

8.  能够分泌如权利要求1至6之一所要求的抗体的鼠杂交瘤。

9.  如权利要求8所要求的鼠杂交瘤存放在CNCM，法国巴斯德学院，巴黎，2001年9月19日，编号1-2717。

10.  一种抗体或其功能片段之一，其特征是所述的抗体由权利要求9所要求的杂交瘤分泌。

11.  如权利要求1至7之一所要求的抗体或其功能片段之一，其特征是所述的抗体含有一个包括氨基酸序列SEQ ID No.54的轻链序列，或包括在最优排列后与序列SEQ ID No.54具有至少80％同一性的序列，或/和它含有一个包括氨基酸序列SEQ ID No.69的重链序列，或包括在最优排列后与序列SEQID No.69具有至少80％同一性的序列。

12.  如权利要求11所要求的抗体或其功能片段之一，其特征是所述的抗体是嵌合抗体，而且含有来自与鼠不同种属的抗体轻链和重链恒定区。

13.  如权利要求12所要求的嵌合抗体或其功能片段之一，其特征是所述的不同种属是人。

14.  如权利要求13所要求的嵌合抗体或其功能片段之一，其特征是来自人抗体的轻链和重链恒定区分别是κ和γ-1、γ-2或γ-4区。

15.  如权利要求1至7之一所要求的抗体或其功能片段之一，其特征是所述的抗体是人源化抗体，包含一个轻链和/或一个重链，其中所述轻链和/或重链的骨架节段FR1至FR4分别来自人抗体轻链和/或重链的骨架节段FR1至FR4。

16.  如权利要求15所要求的人源化抗体或其功能片段之一，其特征是所述的抗体含有一个轻链，它包括氨基酸序列SEQ ID No.61或65，或在最优排列后与序列SEQ ID No.61或65具有至少80％同一性的序列，或/和其特征是含有一个重链，它包括氨基酸序列SEQ ID No.75、79或83，或在最优排列后与序列SEQ ID No.75、79或83具有至少80％同一性的序列。

17.  如权利要求15或16所要求的人源化抗体或其功能片段之一，其特征是所述的抗体包含包括氨基酸序列SEQ ID No.65的轻链，并含有包括氨基酸序列SEQ ID No.79或83，优选SEQ ID No.83的重链。

18.  一种分离的核酸，其特征是它选自下列核酸：
a)编码如权利要求1至7和10至17之一所要求的抗体或其功能片段之一的核酸，DNA或RNA；
b)如a)所定义的核酸的互补核酸；和
c)在最严格条件下能够与序列SEQ ID No.1、3、5、7、9或11的至少一个CDR杂交，或与在最优排列后与序列SEQ ID No.1、3、5、7、9或11具有至少80％同一性的序列杂交的至少18个核苷酸的核酸。

19.  含有如权利要求18所要求的核酸的载体。

20.  含如权利要求19所要求的载体的宿主细胞。

21.  除人以外的转基因动物，含有至少一种细胞被如权利要求19所要求的载体转化。

22.  产生如权利要求1至7和10至17所要求的抗体或其功能片段之一的过程，其特征是包括以下阶段：
a)在培养基和合适的条件下培养如权利要求20所要求的细胞；和
b)回收所述的抗体或其功能片段之一，它的产生是从培养基或所述培养的细胞开始。

23.  能够通过如权利要求22所要求的过程获得的抗体或其功能片段之一。

24.  如权利要求1至7、10至17和23之任一所要求的抗体或其功能片段之一，其特征是还能特异地附着于人表皮生长因子受体，和/或能特异地抑制所述EGFR受体的酪氨酸激酶活性。

25.  如权利要求24所要求的抗体，其特征是它含有一个双特异性抗体，以及含有特异地抑制EGF和人表皮生长因子受体EGFR附着和/或特异地抑制所述EGFR受体酪氨酸激酶活性的第二个基序，。

26.  如权利要求25所要求的抗体，其特征是它是二价的或四价的。

27.  如权利要求25或26之一所要求的抗体，其特征是所述的第二个基序选自片段Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fab’PEG、scFv、scFv-Fc和完整体，或任何其半衰期已被增加的形式。

28.  如权利要求25至27之任一所要求的抗体，其特征是所述的第二个抗EGFR基序来自鼠单克隆抗体225，其鼠-人嵌合衍生物C225，或来自此抗体225的人源化抗体。

29.  如权利要求1至7、10至17和23至27之一所要求的抗体或其功能片段之一作为一种药物。

30.  含有一种化合物作为有效成分的组合物，该化合物由如权利要求1至7、10至17和23至29之一所要求的抗体或其功能片段之一组成。

31.  如权利要求30所要求的组合物，其特征是含有第二个化合物，后者选自能够特异地抑制EGF与人表皮生长因子受体EGFR的附着、和/或能够特异地抑制所述EGFR受体酪氨酸激酶活性的化合物。

32.  如权利要求31所要求的组合物，其特征是所述的第二个化合物选自分离的抗EGFR抗体，或其功能片段，能够通过竞争EGF与EGFR的附着而产生抑制作用。

33.  如权利要求32所要求的组合物，其特征是所述的抗EGFR抗体选自单克隆、嵌合或人源化的抗EGFR抗体，或其功能片段。

34.  如权利要求32或33任一条所要求的组合物，其特征是所述的抗EGFR抗体的功能片段选自片段Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc和完整体，或任何其半衰期已被增加的片段，如pegylated片段。

35.  如权利要求32至34之一所要求的组合物，其特征是所述的抗EGFR抗体是鼠单克隆抗体225、其鼠-人嵌合衍生物C225、或来自此抗体225的人源化抗体。

36.  如权利要求30至35之任一所要求的组合物，其特征是它还含有细胞毒性/细胞生长抑制剂和/或IGF-1受体和/或EGF受体各自的酪氨酸激酶活性抑制剂，作为同时、单独或连续使用的联合产物。

37.  如权利要求36所要求的组合物，其特征是所述的细胞毒性/细胞生长抑制剂选自与DNA相互作用的药剂、抗代谢物、拓扑异构酶I或II抑制剂、或纺锤体抑制剂或稳定剂或任何能用于化疗的药剂。

38.  如权利要求36或37所要求的组合物，其特征是所述的细胞毒性/细胞生长抑制剂与所述组合物的至少一个成分化学性偶联以同时使用。

39.  如权利要求37或38所要求的组合物，其特征是所述的细胞毒性/细胞生长抑制剂选自纺锤体抑制剂或稳定剂，优选长春瑞宾、长春氟宁或长春新碱。

40.  如权利要求36至39之一所要求的组合物，其特征是所述的IGF-1和/或EGF受体各自的酪氨酸激酶活性抑制剂选自衍生的天然药剂、二苯胺酞酰亚胺、吡唑基或吡咯吡啶嘧啶或喹唑啉。

41.  如权利要求30至40之任一所要求的组合物，其特征是它还含有另一个针对HER2/neu受体细胞外结构区的抗体化合物，作为同时、单独或连续使用的联合产物，准备用于预防和治疗癌症。

42.  如权利要求41所要求的组合物，其特征是所述的针对HER2/neu受体细胞膜外结构区的抗体是贺赛汀(Trastuzumab)或其功能片段之一。

43.  如权利要求30至42之任一所要求的组合物，其特征是所述抗体的至少之一或其功能片段之一与细胞毒素和/或放射性元素共扼。

44.  如权利要求30至43之一所要求的组合物作为一种药物。

45.  使用如权利要求1至7、10至17和23至29之一所要求的抗体或其功能片段之一，和/或权利要求30至44之任一所要求的组合物，来制备准备用于预防或治疗疾病的药物，所述疾病与IGF-IR和/或EGFR受体的过度表达和/或异常活化有关，和/或与由IGF1或IGF2与IGF-IR的相互作用和/或EGF与EGFR的相互作用介导的信号转导通路的过度活化有关。

46.  如权利要求45所要求的使用，其特征是所述药物的使用不诱导或仅轻微诱导与胰岛素受体IR抑制有关的继发效应。

47.  如权利要求45或46所要求的使用药物制剂，所述药物准备用于抑制正常细胞向具有肿瘤特征细胞的转化，优选IGF依赖性的，特别是IGF1-和/或IGF2依赖性的和/或EGF依赖性的和/或HER2/neu依赖性的细胞。

48.  如权利要求45至47之任一所要求的使用药物制剂，所述药物准备用于抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖，优选IGF依赖性的，特别是IGF1-和/或IGF2-依赖性和/或EGF依赖性和/或HER2/neu依赖性的细胞。

49.  使用如权利要求45至48之一所要求的药物制剂，所述的药物准备用于预防或治疗癌症。

50.  如权利要求49所要求的使用，其特征是所述的癌症选自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌或结肠癌。

51.  使用如权利要求45至48之一所要求的药物制剂，所述药物准备用于预防或治疗牛皮癣。

52.  体外诊断由IGF-IR和/或EGFR受体的过度表达或表达下调诱导的疾病的方法，始于怀疑有IGF-IR和/或EGFR受体异常存在的生物标本，其特征是所述的生物标本与权利要求1至7、10至17和23至29中之一所要求的抗体接触，如果需要，所述抗体可能被标记。

53.  实施疾病诊断方法的试剂盒或装置，所述疾病由IGF-IR和/或EGFR受体过度表达或表达下调而诱导，或进行一个过程以检测和/或定量生物标本中IGF-IR和/或EGFR受体的过度表达或表达下调，优选所述受体的过度表达，其特征是所述试剂盒或装置含有下列元件：
a)如权利要求1至7、10至17和23至29之一所要求的抗体或其功能片段之一；
b)可选择地，可形成有助于免疫反应的介质的试剂；
c)可选择地，可显示由免疫反应产生的IGF-IR/抗体和/或EGFR/抗体复合物的试剂。

54.  使用如权利要求1至7、10至17和23至29之一所要求的抗体或其功能片段之一，制备药物，所述药物准备用来特异地将生物学活性化合物靶向至表达或过度表达IGF-IR和/或EGFR受体的细胞上。

说明书新的抗IGF-IR抗体及其应用
本发明涉及能够与人胰岛素样生长因子I受体IGF-IR特异结合，和/或能够特异地抑制所述IGF-IR受体的酪氨酸激酶活性的新的抗体，特别是鼠源、嵌合和人源化的单克隆抗体，以及编码这些抗体的氨基酸和核酸序列。同样本发明包括应用这些抗体作为过度表达IGF-IR的癌症或任何与所述受体过度表达有关的病理状况的预防和/或治疗性药物，以及在与IGF-IR受体过度表达有关的疾病的诊断过程或试剂盒中使用。最后，发明包括了这种抗体与抗EGFR抗体和/或化合物和/或抗癌剂或毒素共轭药剂联合的产物和/或组合物，及其预防和/或治疗某些癌症的应用。
称为IGF-IR的胰岛素样生长因子I受体是具有酪氨酸激酶活性的受体，与胰岛素受体IR具有70％的同源性。IGF-IR是分子量大约为350,000的糖蛋白。它是杂-四聚受体，每一半均由二硫键桥接，由一个细胞外α-亚单位和跨膜β-亚单位构成(见图1)。IGF-IR以很高的亲合力(Kd #1 nM)与IGF I和IGFII结合，但同样能够以100至不到1000倍的亲合力与胰岛素结合。相反地，尽管IGF仅能与胰岛素受体以低于100倍的亲合力结合，IR与胰岛素以很高的亲合力结合。尽管同源性较弱的区带分别与位于α-亚单位和β-亚单位的C末端部分上的富含半胱氨酸的区域有关，IGF-IR和IR的酪氨酸激酶结构区具有很高的序列同源性。在α-亚单位上观察到的序列差异位于配体的结合区带中，因此对于IGF和胰岛素，分别是IGF-IR和IR相对亲合力的根源。B-亚单位C末端部分的差异引起了两种受体信号传导通路的分歧；IGF-IR介导有丝分裂、分化和抗凋亡效应，而IR的活化主要参与代谢通路水平上的效应(Baserga等人，Biochim.Biophys.Acta，1332：F105-126，1997；Baserga R.，Exp.Cell.Res.，253：1-6，1999)。
细胞质酪氨酸激酶蛋白是通过配体与受体的细胞外结构区结合而被活化。激酶的活化又涉及不同细胞内底物的刺激，包括IRS-1、IRS-2、Shc和Grb 10(Peruzzi F.等人，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，125：166-173，1999)。IGF-IR的两个主要底物是IRS和She，它们通过激活大量下游效应器而介导与IGF与其受体附着有关的大多数生长和分化效应(图2)。因此底物的可利用性决定了与IGF-IR活化有关的最终生物学效应。当IRS-1占优势时，细胞趋向于增殖和转化。当Shc占优势时，细胞趋向于分化(Valentinis B.等人，J.Biol.Chem.274：12423-12430，1999)。看起来涉及抗凋亡效应的通路主要是磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)通路(Prisco M.等，Horm.Metab.Res.，31：80-89，1999；Peruzzi F.等人，J.CancerRes.Clin.Oncol.，125：166-173，1999)。
IGF系统在癌症发生中的作用成为最近十年中深入研究的主题。这种兴趣是基于以下的发现，即除了促有丝分裂和抗凋亡特性外，IGF-IR似乎是建立和维持转化表现型所需要的。实际上，已经很详细地了解IGF-IR的过度表达或结构性活化在绝大多数细胞中可引起细胞的生长，而不依赖于无胎牛血清培养基的支持，并在裸鼠中形成肿瘤。这本身并不是一种独特的特性，因为过度表达基因的大多数产物可转化细胞，包括很多生长因子的受体。但是，清楚证明IGF-IR在转化作用中扮演的主要地位的重要发现显示，IGF-IR编码基因被灭活的R细胞对通常能够转化细胞的不同药剂的转化作用完全没有反应，这些药剂如牛乳头状瘤病毒E5蛋白、过度表达的EGFR或PDGFR、SV40的T抗原、活化的ras或这后两种因子的联合(Sell C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：11217-11221，1993；SellC.等人，Mol.Cell.Biol.，14：3604-3612，1994；Morrione A.J.，Virol.，69：5300-5303，1995；Coppola D.等人，Mol.Cell.Biol.，14：4588-4595，1994；DeAngelis T等人，J.Cell.Physiol.，164：214-221，1995)。
IGF-IR在大量的肿瘤和肿瘤细胞系中表达，IGF通过其与IGF-IR的附着而增强肿瘤的生长。其他赞成IGF-IR在癌症发生中地位的说法来自采用针对受体的鼠单克隆抗体或采用IGF-IR的功能失活物的研究。事实上，针对IGF-IR的鼠单克隆抗体抑制大量的培养细胞系的增殖和体内肿瘤细胞的生长(Arteaga C.等人，Cancer Res.，49：6237-6241，1989；Liet al.，Biochem.Biophys.Res.Com.，196：92-98，1993；Zia F等人，J.Cell.Biol.，24：269-275，1996；Scotlandi K等人，Cancer Res.，58：4127-4131，1998)。而且在Jiang等人的工作中已经显示(Oncogene，18：6071-6077，1999)IGF-IR的功能失活物能够抑制肿瘤的增殖。
本发明的目的是能够获得鼠单克隆抗体，优选嵌合地或人源化的抗体，它能够特异地识别IGF-IR，并具有很高的亲合力。这种抗体与胰岛素上的IR受体将很少作用或根本不起作用。在体外其附着将能够抑制表达IGF-IR的肿瘤的生长，主要是与IGF1/IGF-IR和IGF2/IGF-IR相互作用的过程中活化的信号转导通路发生作用。在体内这种抗体在所有类型表达IGF-IR的肿瘤上都将是有活性的，这些肿瘤包括雌激素依赖性乳腺肿瘤和前列腺肿瘤，它们不是目前可获得的抗IGF-IR单克隆抗体(书写为MAb或MAB)可以作用的。实际上，αIR3是指IGF-IR的结构区，可在体外完全抑制雌激素依赖性乳腺肿瘤的生长(MCF-7)，但对相应的体内模型却没有效果(Arteaga C.等人，J.Clin.Invest.84：1418-1423，1989)。相同的方式，来自鼠单克隆1H7的scFv-Fc片段在乳腺肿瘤MCF-7上仅有微弱的活性，在雄激素非依赖性前列腺肿瘤上完全是无活性的(Li S.L.等人，Cancer Immunol.Immunother.，49：243-252，2000)。
发明者以一种令人惊讶的方式证明了一种嵌合抗体(记为C7C10)和两种人源化抗体，分别称为h7C10人源化型1和h7C10人源化型2，鼠单克隆抗体7c10的衍生物，可识别IGF-IR，并对应于上述的所有标准，也就是说，不识别胰岛素上的受体，体外可阻断诱导的IGF1和/或IGF2增殖，但同样在体内可抑制不同的表达IGF-IR的肿瘤的生长，其中有骨肉瘤和非小细胞肺肿瘤，更特别的是雌激素依赖性乳腺肿瘤MCF-7和雄激素非依赖性前列腺肿瘤DU-145。同样以令人惊讶的方式，体内抗体7c10抑制肿瘤MCF-7细胞生长的强度与他莫西芬所观察到的结果是可以相对比的，甚至是明显优于后者，他莫西芬是治疗雌激素依赖性乳腺肿瘤中的一个参考化合物。而且，已经显示这些抗体可抑制IGF-IR和IRS1的β链的酪氨酸的磷酸化，受体的第一个底物。而且，同样也已经明确的是这些抗体可引起所述受体的内化及其降解，这与通常天然配体所观察的是相反的，后者可使受体在细胞表面上迅速再循环。通过其肽和核酸序列，特别是决定其与IGF-IR互补性(CDR)的区域的序列已经可能来定性这些抗体。
因此，根据第一个实施例，本发明的一个主题是分离的抗体，或其功能片段之一，所述的抗体或其片段之一能特异与人胰岛素样生长因子I受体结合，如果需要，更优选能抑制IGF-IR的配体IGF1和/或IGF2的自然附着和/或，能够特异地抑制所述IGF-IR受体的酪氨酸激酶活性，该抗体或其片段的特征是它所包含的轻链含有选自氨基酸序列SEQ ID No2，4或6的CDR的至少一个互补决定区CDR，或至少一个在序列最优排列后与序列SEQ ID NO 2、4或6具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％同一性的CDR，或者特征是含有的重链含有选自氨基酸序列SEQ ID NO 8、10、12的CDR的至少一个CDR，或至少一个在序列最优排列后与序列SEQ ID NO 8、10和12具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％同一性的CDR。
在本发明描述中，术语“结合”和“附着”具有相同的含义，可互换。
在本发明描述中，术语多肽、多肽序列、附着于抗体化合物或其序列的肽和蛋白是可以互换的。
在此必须理解的是发明不涉及天然形式的抗体，也就是说，它们并不处在其自然环境下，但它们已经能被分离或通过从天然来源中纯化获得，或通过基因重组获得，或通过化学合成，然后它们将如进一步要描述的那样可含有非天然的氨基酸。
通过CDR区或CDR，要指出的是如Rabat等人所定义的免疫球蛋白的重链和轻链的超变区(Rabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，5th Ed.，U.S.Department of Health and Human Services，NIH，1991，和后续的版本)。存在3个重链CDR和3个轻链CDR。根据情况，在此术语CDR或CDR用来表示这些区域之一或几个，或甚至全部这些区域，它们含有结合作用所需要的大多数氨基酸残基，所述结合作用是通过抗体与抗原或它识别的抗原决定簇的亲合力实现的。
就本发明而言，通过两条核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”，要指出的是在最佳排列(最优排列)后获得的，要比较的两条序列之间的核苷酸或相同氨基酸残基的百分比，这个比例是纯统计学数字，要随机分布的两条序列之间的差异和在其整个长度上。两条核酸或氨基酸序列之间序列的比较一般是通过在以最优方式排列后比较这些序列来进行的，所述的比较能够通过片段或通过“比较窗”来执行。除了人工操作以外，比较所需要的序列最优排列可通过Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法[Ad.App.Math.2：482]，Neddleman和Wunsch(1970)的局部同源性算法[J.Mol.Biol.48：443]，Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)，采用这些算法的计算机软件(Wisconsin Genetics软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI，或通过BLAST N或BLAST P比较软件)来执行。
两条核酸或氨基酸序列之间同一性的百分比可通过比较以最优方式排列的两条序列来确定，其中要比较的核酸或氨基酸序列可根据两条序列之间的这些最优排列的参考序列可含有一些添加和缺失。同一性百分比的计算可通过确定相同位点的数目，对于此位点两条序列之间核酸或氨基酸残基是相同的，通过在比较窗中将此相同位点的数目除位点的总数，将获得的结果乘100，获得两条序列之间的同一性百分比。
例如，可使用BLAST程序，“BLAST 2序列”(Tatusova等人，“Blast 2序列-一种新的比较蛋白和核酸序列的新工具”，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)，它在站点http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html上可获得，参数使用缺省参数(特别是参数“开放间隙补偿”：5，和“扩展间隙补偿”：2；选择的矩阵，是例如，程序所建议的″BLOSUM 62″)，要比较的两条序列之间的同一性百分比通过程序直接计算。
对与参考氨基酸序列具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％同一性的氨基酸序列，就参考序列而言，优选那些具有某些修饰作用，特别是缺失，添加或取代至少一个氨基酸，截断或延伸的序列。在一个或多个连续或非连续氨基酸取代的情况下，取代作用优选被取代的氨基酸由“等效”的氨基酸替换。在此“等效氨基酸”的表述是指能被基本结构的氨基酸之一取代，但实质上不影响相应抗体生物学活性的任何氨基酸，这将在后面详述，特别是在实例中。
这些等效氨基酸可根据其与它们替换的氨基酸的结构同源性，或根据能被实施的不同抗体之间生物学活性对比试验的结果来确定。
通过实例，要注意能进行而不引起相应修饰的抗体的生物学活性发生复杂的修饰作用的取代作用的可能性。因此可能用缬氨酸替换亮氨酸，谷氨酸替换天冬氨酸，天冬酰胺替换谷氨酰胺，赖氨酸替换精氨酸等，在相同条件下相反的取代作用自然也是可行的。
根据本发明的抗体优选特异的单克隆抗体，特别是鼠，嵌合或人源化来源的，可根据本领域专业技术人员所熟知的标准方法获得。
通常，对于单克隆抗体或其功能片段的制备，特别是鼠源性的，可能要提到特别是在手册“抗体”(Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor NY，726页，1988)中所描述的技术或Kohler和Milstein所描述的来自杂交瘤的制备技术(Nature，256：495-497，1975)。
根据本发明单克隆抗体的获得，例如可来自IGF-IR受体或含有根据本发明由所述单克隆抗体特异识别的抗原决定簇的其片段之一免疫的动物细胞。所述的IGF-IR受体，或其所述片段之一，根据通常的工作方法，可特别地通过基因重组产生，由包含在编码IGF-IR受体的cDNA序列中的核酸序列起始，或通过肽合成产生，由IGF-IR受体的肽序列中包含的氨基酸序列起始。
例如，根据本发明，单克隆抗体可在亲合柱上被纯化，柱上以前已经固定了IGF-IR受体或其片段之一，根据本发明该片段含有由所述单克隆抗体特异识别的抗原决定簇。更特殊的是，所述单克隆抗体可通过蛋白A和/或G层析纯化，然后进行或不进行离子交换层析，主要是为了消除残留的蛋白污染物以及DNA和LPS，由于二聚体或其他多聚体的存在，其本身在Sepharose凝胶上进行或不进行排除层析以消除潜在的聚集物。以更为优选的方式，整体这些技术可同时使用或连续使用。
根据本发明，嵌合或人源化抗体也包括在抗体中。
对于嵌合抗体，要指出的是抗体含有来自指定物种抗体的天然可变区(轻链和重链)，以及与所述指定物种不同的物种抗体的轻链和重链恒定区。
根据本发明抗体或其嵌合型片段可采用基因重组技术来制备。例如，嵌合抗体可通过克隆重组DNA而产生，该DNA含有一个启动子，和编码根据本发明的非人、特别是鼠源单克隆抗体可变区的序列，和编码人抗体恒定区的序列。由这样一种重组基因编码的发明的嵌合抗体，例如，将是一个鼠-人的嵌合体，这种抗体的特异性由来自鼠DNA的可变区确定，其同种型则由来自人DNA的恒定区确定。对于制备嵌合抗体的方法，例如可能是指Verhoeyn等人的文章(BioEssays，8：74，1988)。
对于人源化抗体，要指出的是抗体含有来自非人来源抗体的CDR区，抗体分子的其他部分来自一个(或几个)人抗体。而且，骨架片段的一些残基(称为FR)可被修饰以保留结合的亲合力(Jones等人，Nature，321：522-525，1986；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536，1988；Riechmann等人，Nature，332：323-327，1988)。
根据本发明人源化抗体或其片段可通过本领域专业技术人员已知的技术来制备(例如，在Singer等人，J.Immun.150：2844-2857，1992；Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10：1-142，1992；或Bebbington等人，Bio/Technology，10：169-175，1992等文章中所描述的)。根据本发明这些人源化抗体优选用于体外诊断方法中，或体内预防和/或治疗性的处理。
对于根据本发明的功能性片段，要特别指出的是抗体片段，如Fv，scFv(单链为sc)，Fab，F(ab’)2＞Fab’，scFv-Fc片段或双抗体，或任何可通过化学修饰作用增加半衰期的片段，如添加聚(烯基)乙二醇如聚(乙烯)乙二醇(“PEGylation”)(pegylated片段称为Fv-PEG，scFv-PEG，Fab-PEG，F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG)(对聚(乙烯)乙二醇为“PEG”)，或掺入进一个脂质体，根据本发明所述的片段具有至少一个序列SEQ ID NO 2，4，6，8，10或12的特征性CDR，特别是因为这样能够以普通的方式发挥它所来源的抗体的部分活性，如特别是识别和结合IGF-IR受体的能力，如果需要，可抑制IGF-IR受体的活性。
优选地，所述的功能片段将组成或含有它所来源抗体的重或轻可变链的部分序列，就IGF-IR受体而言，所述的部分序列足以保持与它所来源抗体相同的结合特异性，足够的亲合力，优选至少等于它所来源抗体的1/100，更优选的是至少1/10。
这样一种功能性片段将含有它所来源抗体的最小5个氨基酸，优选10，15，25，50和100个连续氨基酸序列。
优选地，这些功能片段是Fv，scFv，Fab，F(ab’)2，F(ab’)，scFv-Fc型片段或一个完整体，后者通常与它所来源的抗体具有相同的结合特异性。根据本发明，发明的抗体片段可从如上所述的抗体通过如酶消化的方法，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶和/或通过化学还原切断二硫键而获得。另一种方式是，本发明中包含的抗体片段可通过本领域专业技术人员所熟知的基因重组技术获得，或通过肽合成，使用例如自动肽合成仪，如由Applied Biosystems等公司供应的仪器。
以更优选的方式，发明包含抗体，或其功能片段，根据本发明，特别是通过基因重组或化学合成获得的嵌合或人源化抗体。
在一个优选的实施例中，发明的主题是一种抗体或其功能片段之一，根据本发明，其特征是它含有一条重链，含有序列SEQ ID NO 12的一个CDR，或在最优排列后与序列SEQ ID NO 12具有至少80％同一性的序列。
在六个短的CDR序列中，重链(CDRH3)的第三个CDR具有更大的大小可变性(根本上是由于赋予其的基因排列机制获得更大的多样性)。尽管最长的大小已知为26，但可短至2个氨基酸。从功能上说，CDRH3在决定抗体的特异性中具有很重要的地位(Segal等人，PNAS，71：4298-4302，1974；Amit等人，Science，233：747-753，1986；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901-917，1987；Chothia等人，Nature，342：877-883，1989；Caton等人，J.Immunol.，144：1965，1968，1990；Sharon等人，PNAS，87：4814-4817，1990；Sharon等人，J.Immunol.，144：4863-4869，1990；Rabat等人，J.Immunol.，147：1709-1719，1991)。
已知CDR的氨基酸中仅有很少比例能参与构建抗体的结合位点，但这些残基必须保持非常特殊的三维构型。
以更优选的方式，本发明涉及一种抗体或其功能片段之一，根据本发明其特征是它含有一条重链，含有序列SEQ ID NO 8，10和12中的三个CDR或三个CDR中的至少两个，或在最优排列后分别与序列SEQ ID NO 8，10和12具有至少80％同一性的序列中的三个CDR或三个CDR中的至少两个。
同样在一个优选的实施例中，本发明的主题是一种抗体或其功能片段之一，根据本发明，其特征是它含有一条轻链，含有选自序列SEQ ID NO 2，4或6中CDR的至少一个CDR，或一个CDR，其序列经最优排列后与序列SEQ ID NO 2，4或6具有至少80％同一性。
在一个更优选的实施例中，发明的主题是一种抗体或其功能片段之一，其特征是它含有一条轻链，含有序列SEQ ID NO 2，4和6中的三个CDR或三个CDR中的至少两个，或在最优排列后分别与序列SEQ ID NO 2，4和6具有至少80％同一性的序列中的三个CDR或三个CDR中的至少两个。
以更优选的方式，根据本发明的抗体或其功能片段之一的特征是它含有一条重链，含有序列SEQ ID NO 8，10和12中的三个CDR，或在最优排列后分别与序列SEQ ID NO 8，10和12具有至少80％同一性的序列中的三个CDR，而且它含有一条轻链，含有序列SEQ ID NO 2，4和6中的三个CDR，或在最优排列后分别与序列SEQ ID NO 2，4和6具有至少80％同一性的序列中的三个CDR。
根据另一个方面，本发明的一个主题是一种抗体或其功能片段之一，根据本发明其特征是它不能附着或它不能以显著的方式附着于人胰岛素受体IR。
以一种优选的方式，根据本发明所述的功能片段将选自片段Fv，scFv，Fab，(Fab’)2，Fab’，scFv-Fc或双抗体，或任何通过化学修饰可增加半衰期的功能片段，特别是通过PEGylation，或掺入进脂质体中。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及能够分泌一种单克隆抗体的鼠杂交瘤，特别是鼠源性杂交瘤如Centre National de Culture De Microorganisms(CNCM，National Center of Microorganism Culture)(Institut Pasteur，Paris，France)在2001年9月19日存放的，序号1-2717。
在此称为7C10的单克隆抗体，或其功能片段之一，其特征是所述抗体由2001年9月19日在CNCM存放，序号为1-2717的杂交瘤分泌，当然它也是本发明的一部分。
在一个特殊的实施例中，本发明涉及一种鼠抗体，或其功能片段之一，根据本发明，其特征是所述抗体含有一条轻链的序列，后者包含氨基酸序列SEQ IDNO：54，或在最优排列后与序列SEQ ID NO：54具有至少80％同一性的序列，或/和它含有一条重链序列，后者包含氨基酸序列SEQ ID NO：69，或在最优排列后与SEQID NO：69具有至少80％同一性的序列。
同样根据一个特殊的方面，本发明涉及一种嵌合抗体，或其功能片段之一，根据本发明，其特征是所述抗体进一步含有来自与鼠不同物种，特别是人抗体的轻链和重链恒定区，优选地来自人抗体的轻链和重链恒定区分别是κ和γ-1，γ-2或γ-4区。
同样根据一个特殊的方面，本发明涉及人源化抗体或其功能片段之一，根据本发明，其特征是所述抗体包含一条轻链和/或一条重链，其中所述轻链和/或重链的骨架节段FR1至FR4(such as defined below in examples 12 and 13，intables 5 and 6)分别来自人抗体轻链和/或重链骨架节段FR1至FR4。
根据一个优选的实施例，人源化抗体或其功能片段之一，根据本发明，其特征是所述人源化抗体含有一条轻链，它含有氨基酸序列SEQ ID NO：61或65，或在最优排列后与序列SEQ ID NO：61或65具有至少80％同一性的序列，或/和，它含有一条重链，它含有氨基酸序列SEQ ID NO 75，79或83，或在最优排列后与序列SEQ ID NO：75，79或83具有至少80％同一性的序列。
优选地，人源化抗体，或其功能片段之一，根据本发明，其特征是所述人源化抗体含有一条轻链，它包含氨基酸序列SEQ ID NO 65，并因此含有一条重链序列，它包含氨基酸序列SEQ ID NO 79或83，优选SEQ ID NO83。
根据一个新的方面，本发明涉及一种分离的核酸，其特征是它选自下面的核酸：
a)  根据本发明，编码一种抗体或其功能片段之一的核酸，DNA或RNA；
b)  如在a)中定义的核酸的互补核酸；和
c)  在极度严格性条件下能够与核酸序列SEQ ID NO 1，3，5，7，9或11中的至少一个CDR杂交的至少18个核苷酸的核酸，或在最优排列后与序列SEQ IDNO 1，3，5，7，9或11具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％同一性的序列。
对于核酸，核酸或核酸序列，多聚核苷酸，寡核苷酸，多聚核苷酸序列，核苷酸序列，这些将在本发明中普遍使用的术语，要指出的是核苷酸的准确连接，可使要确定核酸的片段或区域含有或不含有非天然的核酸，正好能够对应于一个双链的DNA，单链DNA作为所述DNA的转录产物，其中核苷酸可被修饰或未被修饰。
在此也必须理解的是本发明与自然染色体环境中的核苷酸序列无关，也就是说自然状态下序列。它与已经被分离和/或纯化的序列有关，也就是说它们已经直接或间接被选择，例如通过拷贝，它们的环境已经至少部分被改变。因此同样在此要指出的是通过，例如宿主细胞的基因重组获得，或通过化学合成获得的分离核酸。
对于在最优排列后与参考序列具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性百分比的序列，要指出的是就参考核苷酸序列而言，核苷酸序列具有某些修饰，如缺失，截断，延伸，嵌合融合和/或取代，特别是点取代。优选与下列序列有关，其中的序列编码与参考序列相同的氨基酸序列，这与基因代码的简并性有关，或能够特异与参考序列杂交的互补序列，优选在高度严格性条件下，特别是如下所述的情况下。
在高度严格性条件下的杂交的含义是以这种方式选择的温度条件和离子强度可维持互补DNA的两个片段之间进行杂交。通过图解说明，为了确定上述多聚核苷酸片段所进行的杂交步骤中的高严格性条件可很方便地采用下列的条件。
DNA-DNA或DNA-RNA杂交以两个步骤进行：(1)在含有5×SSC(1×SSC相当于0.15 M NaCl+0.015 M柠檬酸钠溶液)，50％甲酰胺，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，10×Denhardt’s，5％硫酸葡聚糖和1％鲑鱼精DNA的磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.5)中42℃预杂交3小时；(2)根据探针的大小在一个温度下(也就是，对于探针大小＞100个核苷酸的，42℃)实际杂交20小时，然后在20℃2×SSC+2％SDS中冲洗20分钟2次，在20℃ 0.1×SSC+0.1％SDS中冲洗20分钟1次。对于探针大小＞100个核苷酸，最后一次冲洗在60℃，0.1×SSC+0.1％SDS中进行30分钟。对于上述已确定大小的多聚核苷酸的高严格性杂交条件可由本领域专业技术人员根据Sambrook等人(1989，分子克隆：实验室手册，第二版，ColdSpring Harbor)的教授，对更大或更小的寡核苷酸进行修改。
发明同样涉及含有依照本发明的核酸的载体。
发明的目标特别是克隆和/或表达载体，它们含有依照本发明的核苷酸序列。
根据本发明载体优选含有在已确定的宿主细胞中允许核苷酸序列表达和/或分泌的元件。因此载体必须含有一个启动子，启动和终止翻译的信号，以及适当的转录调节区。必须能以稳定的方式在宿主细胞中保留，可选择性地含有特殊的信号，它引导已翻译蛋白的分泌。本领域专业技术人员可选择这些不同的元件并进行优化作为宿主细胞所使用的一种功能。为了达到这种效应，根据本发明的核苷酸序列在选择的宿主中插入进自主复制载体中，或是选择宿主的整合载体。
通过本领域专业技术人员所使用的常规方法可制备这些载体，得到的克隆可通过标准的方法导入进合适的宿主中，如通过lipofection，电穿孔，热休克，或化学方法。
根据本发明的载体，例如是质粒或病毒来源的载体。它们可用于转化宿主细胞以便克隆或表达依照本发明的核苷酸序列。
本发明同样包括由依照本发明的载体转化的宿主细胞，或含有载体的宿主细胞。
可以从原核或真核系统中选择宿主细胞，例如细菌细胞，以及酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。同样可能使用昆虫细胞或植物细胞。
发明同样与动物有关系，除人类以外，该动物含有至少一种根据本发明被转化的细胞。
根据另一个方面，本发明的一个主题是产生抗体或其功能片段之一的过程，根据本发明其特征是它含有下面的阶段：
a)根据本发明在一种培养基和适当的培养条件下培养宿主细胞；和
b)回收由培养基或所述培养细胞开始产生的所述抗体，或其功能片段之一。
根据本发明转化的细胞可用于制备依照本发明的重组多肽的过程中。制备根据本发明的重组形式的多肽的过程包含在本发明中，其特征是应用了一种载体和/或由根据本发明的一种载体转化的细胞。优选由根据本发明的载体转化的细胞在一定条件下进行培养，该条件可表达所述多肽和回收所述的重组肽。
如已经描述的那样，宿主细胞可从原核或真核系统中选择。特别是，又可能鉴定依照本发明的核苷酸序列，促进其在这样一种原核或真核系统中的分泌。根据本发明携带这样一种序列的载体因此可很方便地用于要分泌的重组蛋白的生产中。实际上，这些目的重组蛋白的纯化可被促进，因为存在这样的现实，即它们存在于细胞培养上清液中，而不是存在于宿主细胞内部。
也可能通过化学合成制备依照本发明的多肽。这样一种制备过程同样是发明的主题。本领域专业技术人员了解化学合成的过程，例如应用固相的技术(特别见Steward等人，1984，固相肽合成，Pierce Chem.Company，Rockford，111，第二版，(1984))或采用部分固相的技术，通过浓缩片段或在溶液中进行经典的合成。由化学合成获得并能包含相应的非天然氨基酸的多肽同样也包括在本发明中。
能由依照本发明的过程获得的抗体或其功能片段之一同样包括在本发明中。
根据第二个实施例，本发明与依照本发明的一种抗体有关，如上进一步所述，而且其特征是能特异地与人表皮生长因子受体EGFR结合和/或能特异地抑制所述EGFR受体的酪氨酸激酶活性。
通常，生长因子是小的蛋白参与正常细胞增殖和分化的调节中。这些生长因子中的一些在启动和维持细胞转化过程中具有重要地位，能作为自分泌或旁分泌因子。除了上面进一步所述的IGF1，对于表皮生长因子也特别是这种情况，似乎可特殊地参与至肿瘤表现型的出现，肿瘤的进展和产生转移。
EGF和IGF1通过其各自受体的介导而发挥其作用，这些受体在此称为EGFR和IGF-IR。它与具有酪氨酸激酶活性的两种膜受体有关，据称其过度表达发生在大量癌症中。但必须注意的是这两种受体的相互作用并不清楚，对于这种关系许多研究队伍进行的研究就这两种受体的协同关系得出了相反的结果。
对于前列腺肿瘤细胞进行的研究显示，抗EGFR单克隆抗体(在此称为″MAB″或″MAb″)对自分泌环EGF/EGFR的阻断作用是通过DU145细胞完全丧失对IGF1的反应表现出来的(Connolly J.M.和Rose D.P.，Prostate，Apr.24(4)：167-75，1994；Putz T.等人，Cancer Res.，Jan.1，59(1)：227-33，1999)。这些结果表明阻断EGF受体足以完全抑制由两种受体(EGFR和IGF-IR)活化所产生的转化信号。另一方面，其他研究(Pietrzkowski等人，Cell Growth Differ，Apr.，3(4)：199-205，1992；Coppola等人，Mol Cell Biol.，Jul.，14(7)：4588-95，1994)显示EGFR的过度表达需要功能性IGF-IR的存在以发挥其有丝分裂和转化体的潜力，尽管IGF-IR就其一部分而言，并不需要功能性EGFR的存在以介导这种作用。这两个系列的研究与倾向于阻断IGF-IR，同时影响两种受体的策略更为一致。
以一种令人惊讶的方式，发明者首先证明了同时抑制IGF1和/或IGF2与IGF-1R受体的附着以及EGF与EGFR受体的附着可使这两种作用产生明显的协同效应，获得的这两种作用在携带表达这两种受体的肿瘤的裸鼠体内可抑制肿瘤生长。能够解释协同效应的更可能的假设之一是两个生长因子EGF和IGF1(和/或IGF2)本身在正常细胞转化为具有肿瘤特征的细胞和/或在某些肿瘤的肿瘤细胞的生长和/或增殖过程中是协同作用的，特别是对于那些过度表达两种受体EGFR和IGF-IR和/或由这两种受体介导的转导信号过度活化，特别是在这些受体的酪氨酸激酶活性水平上的肿瘤。
根据此实施例的一个优选的方面，发明与如上进一步所述的抗体有关，其特征是它含有一种双特异性的抗体，含有一个第二基序，可特异地抑制EGF与EGFR的附着和/或特异地抑制所述EGFR受体的酪氨酸激酶活性。
术语“第二基序”在上面要指出的特别是一条氨基酸序列，含有能够与EGFR特异结合的片段，特别是抗EGFR抗体可变链的CDR区，或具有足够长度以发挥这种特异结合作用的这种CDR区的片段之一，或抗EGFR抗体的几个CDR区。
双特异性或双功能性抗体形成了第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区组合在同一个分子中(Hollinger和Bohlen，1999，Cancer and metastasis rev.18：411-419)。它们的应用已经证明了在诊断领域和治疗领域，它们都能恢复新的效应器功能，或能靶向肿瘤细胞表面上的几个分子。这些抗体可通过化学方法(Glennie MJ等人，1987 J.Immunol.139，2367-2375；Repp R.等人，1995 J.Hemat.377-382)或体细胞方法(Staerz U.D.和Bevan M.J.1986 PNAS 83，1453-1457；Suresh M.R.等人，1986 Method Enzymol.121：210-228)获得，但同样可优选通过基因工程技术，该技术可强制进行异二聚化，因此可加速所寻找的抗体的纯化过程(Merchand等人，1998 Nature Biotech.16：677-681)。
这些双特异性抗体可构建为整个IgG、双特异性Fab’2、Fab’PEG或完整体或其他的双特异性scFv，但同样可构建为四价的双特异性抗体或对于每个靶向抗原存在两个附着位点(Park等人，2000 Mol.Immunol.37(18)：1123-30)或如上进一步所述的其片段。
除了产生和应用双特异性抗体较产生两个特异性抗体要简便得多所获得经济方面的优势以外，使用这种双特异性抗体的优势是减少了治疗的毒性。这是因为使用双特异性抗体可使循环抗体的总量和因此产生的可能毒性减少。
在本发明的一个优选实施例中，双特异性抗体是一个二价或四价的抗体。
实际上，使用四价双特异性抗体的兴趣在于它较二价抗体有更强的亲合力，因为对于每个靶标存在两个附着位点，在本发明中分别是IGF-IR和EGFR。
与选择上述抗IGF-IR抗体的功能片段相似的方式，所述的第二基序选自片段Fv，Fab，F(ab’)2，Fab’，scFv，scFv-Fc和完整体，或任何其半衰期已经被增加的形式，如pegylated片段如Fv-PEG，scFv-PEG，Fab-PEG，F(ab’)2-PEG或Fab’PEG。根据本发明的一个更优选的方面，所述的第二个抗EGFR基序可来自鼠单克隆抗体225，其鼠-人嵌合衍生物C225，或这种抗体225衍生的人源化抗体。
仍根据另一个方面，本发明的一个主题是抗体或其功能片段之一，根据本发明作为一种药物，优选如上所确定的人源化抗体。抗体，对于本发明余下的描述，必须被理解为抗IGF-IR抗体以及双特异性抗IGF-IR/EGFR抗体。
同样发明与一种药学组合物有关，作为有效成分它含有的一种化合物，根据本发明包括一种抗体，或其功能片段之一，优选与一种赋形剂和/或药学可接受的载体混合。
仍然根据另一个实施例，本发明同样与一种药学组合物有关，如上面进一步所描述的，它含有一个第二化合物，选自能特异抑制EGF与人表皮生长因子受体EGFR附着和/或能特异抑制所述EGFR受体的酪氨酸激酶活性的化合物。
在本发明的一个优选的方面，所属第二化合物选自分离的抗EGFR抗体，或其功能片段，能通过竞争作用抑制EGF与EGFR的附着。更特别的是，所述的抗EGFR抗体选自单克隆，嵌合或人源化抗EGFR抗体，或其功能片段。更为特别的是，所述的抗EGFR抗体的功能片段选自片段Fv，Fab，F(ab’)2，Fab’，scFv-Fc或完整体，或任何其半衰期已被增加的片段，如pegylated片段。所述的抗体以一种更为优选的方式可含有鼠单克隆抗体225，其鼠-人嵌合衍生物C225(也称为IMC-C225)或由这个抗体225衍生的人源化抗体。
本发明的另一个补充实施例含有如上所述的一种组合物，为了作为一种组合产物同时，单独或相继使用，它可含有一种细胞毒/细胞生长抑制剂和/或IGF-I和/或EGF受体各自的酪氨酸激酶活性抑制剂。
“同时使用”可理解为依照本发明的组合物的两种化合物以单一和相同的药物形式给药。
“单独使用”可理解为依照本发明的组合物的两个化合物同时以不同的药物形式给药。
“相继使用”可理解为依照本发明的组合物的两个化合物每个都以不同的药物形式相继给药。
依照本发明的组合物以普通的形式可很大程度上的增加治疗癌症的效率。换言之，依照本发明抗IGF-IR抗体的治疗效应可以一种意想不到的方式通过给予一种细胞毒性剂而实现。依照本发明的一种组合物随后所产生的另一个主要优势是有可能使用有效成分的有效剂量更低，可使出现第二效应的危险性得到避免或减少，特别是细胞毒性剂的作用。
另外，依照本发明这种组合物可使所期望的治疗效应更快速的达到。
在一个特别优选的实施例中，依照本发明作为一种组合产物的所述组合物的特征是所述的细胞毒/细胞生长抑制剂选自与DNA相互作用的药剂，抗代谢物，拓扑异构酶I或II抑制剂，或纺锤体抑制剂或稳定剂或其他任何能用于化疗中的药剂。对于前面所述每种类型的细胞毒性剂，这样的细胞毒/细胞生长抑制剂，例如可在VIDAL 2001版中引用，所在的页面专门针对附加在癌学和血液学一栏″细胞毒素类″中的化合物，就本文而言，这些引用的细胞毒化合物在此引用作为优选的细胞毒性剂。
在一个特别优选的实施例中，依照本法且作为一种组合产物的所述组合物的特征是所述的细胞毒性剂可与所述抗体化学性偶联以便同时使用。
在一个特别优选的实施例中，依照本发明所述的组合物的特征是所述的细胞毒/细胞生长抑制剂选自纺锤体抑制剂或稳定剂，优选长春瑞宾和/或长春氟宁和/或长春新碱。
为了加速所述细胞毒性剂和所述的依照本发明的抗体之间的偶联，特别有可能在要被偶联的两个化合物之间导入间隔分子，如聚(烯基)乙二醇，象聚乙二醇或氨基酸，在另一个实施例中，使用所述细胞毒性剂的活性衍生物，它已经被引入了一些功能，能与依照本发明的所述抗体反应。这些偶联技术对于本领域专业技术人员是熟知的，在这里的描述中并没有被扩展。
在另一个优选的实施例中，所述IGF-I和/或EGF受体酪氨酸激酶活性抑制剂选自衍生的天然药剂，二苯胺酞酰亚胺，吡唑-或吡咯吡啶嘧啶或喹唑啉。这样的抑制剂对于本领域的专业技术人员是熟知的，并在文献中有所描述(Ciardiello F.，Drugs 2000，Suppl.1，25-32)。
EGFR的其他抑制剂，没有任何限制，可含有抗EGFR单克隆抗体C225和22Mab(ImClone Systems Incorporated)，ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)，EMD-7200(Merck KgaA)或化合物ZD-1834，ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)，PKI-166(Novartis)，PKI-166/CGP-75166(Novartis)，PTK 787(Novartis)，CP 701(Cephalon)，来氟米物(Pharmacia/Sugen)，CI-1033(Warner-LambertParke-Dayis)，CI-1033/PD 183，805(Warner-Lambert Parke-Davis)，CL-387，785(Wyeth-Ayerst)，BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche)，NaamidineA(Bristol-Myers Squibb)，RC-3940-II(Pharmacia)，BIBX-1382(BoehringerIngelheim)，OLX-103(Merck&Co)，VRCTC-310(Ventech Research)，EGF融合毒素(Seragen Inc.)，DAB-389(Seragen/Lilgand)，ZM-252808(Imperial CancerResearch Fund)，RG-50864(INSERM)，LFM-A12(Parker Hughes CancerCenter)，WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center)，GW-282974(Glaxo)，KT-8391(Kyowa Hakko)或“EGFR疫苗”(York Medical/Centro de Immunologia Molecular)。
仍然根据发明的另一个实施例，如上所述的组合物同样含有另一个抗体化合物，针对HER2/neu受体的细胞外结构区，作为同时，单独或连续使用的一种组合产物，打算用于预防和治疗癌症，特别是过度表达所述HER2/neu受体和受体IGF-IR和/或EGFR的癌症，如特别是乳腺癌。
参考文献可特别的参照Albanell等人(J.of the National CancerInstitute，93(24)：1830-1831，2001)和Lu等人(J.of the National CancerInstitute，93(24)：1852-1857，2001)的出版物，证实了在将一种抗HER2/neu抗体与依照本发明的一种抗IGF-IR抗体进行组合方面的出入意料的关注。
以一种特殊的方式，依照本发明的组合物的所述抗HER2/neu抗体是一种称为Trastuzumab(也称为Herceptin)的抗体。
发明在另一个方面涉及一种组合物，其特征是至少一个所述抗体，或其功能片段之一，与一种细胞毒素和/或一种放射性元素交联在一起。
优选地，所述毒素或所述放射性元素能够抑制表达IGF-IR和/或EGFR受体的细胞的至少一种细胞活性，更优选的方式是能防止所述细胞的生长或增殖，特别是完全使所述细胞失活。
也优选的是，所述的毒素是肠细菌毒素，特别是绿脓假单胞菌外毒素A。
用于治疗的优选与抗体交联的放射性元素(或放射性同位素)是能释放γ射线的放射线同位素，优选碘131，钇90，金199，钯100，铜67，铋217和锑211。可释放β和α射线的放射性同位素同样可用于治疗。
对于与依照本发明的至少一种抗体，或其功能片段之一交联的毒素或放射性元素，要指出的是任何可使所述毒素或所述放射性元素与所述至少一种抗体，特别是通过两种化合物之间的共价偶联进行结合的方式，可以引入或不引入连接分子。
在可使交联物的所有或部分成分以化学(共价)，静电或非共价方式结合的试剂中，特别要提到苯醌，碳化二亚胺，更特殊的是EDC(1-乙基-3-[3-二甲基-氨丙基]-碳化二亚胺氢氯化物)，二马来酰胺，二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)，N-琥珀酰亚胺酰S-乙酰硫代乙酸盐(SATA)，具有一个或多个可与紫外线(U.V.)反应的苯叠氮基的交联剂，优选N-[-4-(叠氮水杨酰氨基)丁基-3’-(2’-吡啶二硫代)-丙酰胺(APDP)，N-琥珀酰亚胺酰3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐(SPDP)，6-肼基-烟酰胺(HYNIC)。
偶联的另一种形式，特别是对于放射性元素，可以使用双功能离子螯合剂。
在这些螯合物中，可能要提到来自EDTA(乙二胺四乙酸)或DTPA(二乙撑三胺五乙酸)的螯合物，已经被开发用来结合金属，特别是放射活性金属，合免疫球蛋白。因此DTPA及其衍生物可由碳链上不同的基团取代以便增加配体-金属复合体的稳定性合刚性(Krejcarek等人，(1977)；Brechbiel等人，(1991)；Gansow(1991)；US专利4 831 175)。
例如二乙撑三胺五乙酸(DTPA)及其衍生物，已经被广泛用于医药合生物学中很长时间了，以游离形式或与金属离子复合体的形式，其非常明显的特征是可与金属离子形成稳定的螯合物，并可与治疗或诊断目的的蛋白偶联，如在癌症治疗中开发放射免疫交联剂所使用的抗体(Meases等人，(1984)；Gansow等人，(1990))。
同样优选地，依照本发明形成所述交联物的所述至少乙种抗体选自其功能片段，特别是其Fc部分的截断片段，如scFv片段。
而且本发明包括使用依照本发明的组合物制备一种药物。
更特殊地，根据另一个实施例，发明与使用一种抗体或其功能片段，和/或一种组合物来制备一种准备用来防止或治疗疾病的药物有关，该疾病是由IGF-IR和/或EGFR受体的过度表达和/或异常活化诱导的，和/或与由IGF-1或IGF-2与IGF-IR和/或EGF与EGFR和/或HER2/neu相互作用介导的信号转导通路的过度活化有关。
优选地，依照本发明所述的应用，其特征是使用所述的药物并不诱导或仅轻微诱导第二效应，与胰岛素受体IR的抑制有关，也就是说，IR受体与其天然配体的相互作用的抑制是由于所述药物的存在，特别是通过所述药物与IR附着所形成的竞争性抑制。
而且本发明包括使用一种抗体，或其功能片段之一，优选人源化，和/或依照本发明制备一种药物的组合物，该药物是准备用来抑制正常细胞转化为具有肿瘤特征的细胞，优选IGF依赖性的，特别是IGF1-和/或IGF2-依赖性和/或EGF-依赖性和/或HER2/neu-依赖性的细胞。
同样本发明涉及使用一种抗体，或其功能片段之一，优选人源化，和/或依照本发明制备一种药物的组合物，该药物是用来抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖，优选IGF-依赖性，特别是IGF1-和/或IGF2-依赖性和/或EGF-依赖性和/或雌激素依赖性，和/或HER2/neu-依赖性的细胞。
总体上，本发明的主题是使用一种抗体或其功能片段之一，优选人源化，和/或依照本发明的一种组合物，来制备准备用来防止或治疗癌症的一种药物，优选表达IGF-IR和/或EGFR的癌症，和/或优选由IGF-1或IGF-2与IGF-IR和/或EGF与EGFR相互作用介导的信号转导通路的过度活化有关的癌症，例如IRS1的过度表达。
同样本发明的主题是使用一种抗体，或其功能片段之一，优选人源化，和/或依照本发明的一种组合物，来制备准备用来防止或治疗干癣的一种药物，干癣的表皮过度增殖与IGF-IR和/或EGFR的表达或过度表达，和/或与由IGF-IR与其天然配体和/或EGFR与其天然配体相互作用介导的信号转导通路的过度活化有关(Wraight C.J.等人，Nat.Biotechnol.，2000，18(5)：521-526.胰岛素样生长因子I受体反义寡核苷酸对干癣表皮过度增殖的逆转)。
在要防止或治疗的癌症中，优选前列腺癌，骨肉瘤，肺癌，乳腺癌，子宫内膜肿瘤或结肠癌或任何其他过度表达IGF-IR的癌症。
仍然根据另一个方面，本发明的一个主题是一种诊断方法，优选在体外诊断与IGF-IR和/或EGFR受体过度表达或表达下调，优选过度表达有关的疾病，从怀疑有IGF-IR和/或EGFR受体的异常存在的生物学标本开始，其特征是所属的生物学标本与依照本发明的一种抗体，或其功能片段之一有关，如果需要，所述的抗体可能是被标记的。
优选在所述诊断方法中与IGF-IR和/或EGFR受体的过度表达有关的所述疾病是癌症。
所述的抗体或其功能片段可以一种免疫交联物的形式存在，或以标记抗体的形式存在以便获得可检测到和/或可定量的信号。
标记的抗体或依照本发明的其功能片段包括，例如称为免疫交联物的抗体，例如可与酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶交联或被一种分子如生物素，digoxygenin或5-溴脱氧尿苷酸交联。同样荧光标记可与抗体或依照本发明的其功能片段交联，特别包括荧光素和其衍生物，荧光色素，罗丹明和其衍生物，GFP(GFP为“绿荧光蛋白”)，dansyl，伞形酮等。在这种交联物中，发明的抗体或其功能片段可通过本领域专业技术人员已知的方法制备。它们可与酶偶联或与荧光标记直接偶联或通过一个间隔基团或连接基团如聚醛，象戊二醛，乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙撑三胺五乙酸(DPTA)的中间体偶联，或存在偶联剂如上面所述的那些治疗性交联剂。含有荧光素型标记的交联物可通过与异硫氰酸盐反应而制备。
同样其他的交联物包括化学发光标记如鲁米诺和dioxetanes，生物发光标记如虫荧光素酶和虫荧光素，或其他的放射活性标记如碘123、碘125、碘126、碘133、溴77、锝99m、铟111、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞107、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、氟18、钇199、碘131。本领域专业技术人员已知的将治疗性放射性同位素与抗体直接或通过上面提到的一种螯合剂如EDTA，DTPA偶联的方法可用于在诊断中使用的放射性元素。同样可能要提到用Na[I125]通过氯胺T法[Hunter W.M.和Greenwood F.C.(1962)Nature 194：495]或用锝99m通过Crockford等人的技术(US专利4 424 200)或如Hnatowich(US专利4 479 930)所述经DTPA被附着等进行标记。
因此，抗体或依照本发明的其功能片段，可用于检测和/或定量IGF-IR和/或EGFR受体在生物学标本中的过度表达或表达下调的过程中，其特征是它包括下列的步骤：
a)将生物标本与抗体或依照本发明的其功能片段之一接触，和
b)证明可能形成的IGF-IR和/或EGFR/抗体复合体。
在一个特殊的实施例中，抗体或依照本发明的其功能片段，可用于在一个生物标本中检测和/或定量IGF-IR和/或EGFR受体的过程，以监测预防和/或治疗IGF-和/或EGF依赖性癌症或干癣的功效。
更普遍的，抗体或依照本发明的其功能片段，可很方便地用于下面的任何情况中，其中IGF-IR和/或EGFR受体的表达必须可以可定性和/或可定量的方式观察。
优选地，生物标本可通过生物体液，如血清，全血，细胞，组织标本或人的活组织检查获得。
可使用任何步骤或常规试验，以便进行这样一种检测和/或用药。所述的试验可以是一种竞争或夹心试验，或任何本领域专业技术人员已知的试验，依靠形成一种抗体-抗原型免疫复合体。根据本发明应用后，抗体或其功能片段之一可被固定或标记。这种固定可在本领域专业技术人员已知的多种支持物上进行。这些支持物可特别地包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龙或天然的或修饰的细胞。这些支持物可以是可溶性的或不溶性的。
通过实例，根据ELISA技术，一种优选的方法可通过免疫荧光，或放射免疫测定(RIA)技术或相同的技术开始进行免疫酶过程。
因此，本发明同样包括实施诊断疾病的方法，或实施在一种生物标本中检测和/或定量EGF-IR和/或EGFR受体过度表达或表达下调的过程所需的试剂盒或装置，所述疾病由IGF-IR和/或EGFR受体的过度表达或表达下调诱导，优选过度表达所述受体，其特征是所述的试剂盒或装置包含下列的元件：
a)根据本发明的一种抗体或其功能片段；
b)可选择的是，可形成有利于免疫学反应的介质的试剂；
c)可选择的是，能证明由免疫学反应产生的IGF-IR和/或EGFR/抗体复合体的试剂。
而且发明涉及使用一种组合物作为依照本发明的一种组合产物，以制备准备用来防止或治疗癌症的药物，特别是所述细胞毒性剂或所述的抗HER2/neu抗体通常用于处方中的癌症，特别是肿瘤细胞表达或过度表达IGF-IR和/或EGFR受体的癌症。
发明的一个主题同样是使用依照本发明的一种抗体来制备准备用来将一种生物活性化合物特异靶向表达或过度表达IGF-IR和/或EGFR受体的细胞的药物。
在此要说明的生物活性化合物是指任何能够调节，特别是抑制细胞活性，特别是其生长，其增殖，转录或基因翻译的化合物。
本发明的一个主题也是一种体内诊断试剂，含有根据本发明的一种抗体，或其功能片段之一，优选标记的，特别是放射标记的，及其在医学影像中的应用，特别是检测与细胞表达或过度表达IGF-IR和/或EGFR受体有关的癌症。
发明同样涉及作为一种组合产物的组合物或依照本发明作为一种药物的抗IGF-IR和/或EGFR/毒素交联物或放射性元素。
优选地，作为组合产物的所述组合物或依照本发明的所述交联物将与一种赋形剂和/或一种药学可接受的载体混合在一起。
在本发明中，药学可接受的载体是指可进入药学组合物中的一种化合物或化合物的组合，没有令人反感的第二反应，例如可促进活性化合物的给药，增加其寿命和/或在体内的功效。这些药学可接受的载体是本领域专业技术人员所熟知的，并可根据所选择的活性化合物的给药方式和功能特性而改变的。
优选，这些化合物以全身的途径给药，特别是通过静脉内途径，肌肉内，真皮内，腹膜内或皮下途径，或通过口服途径。以一个更优选的方式，含有依照本发明的抗体的组合物以顺序的方式给药数次。
其给药的方式，剂量和最佳药物学形式可根据标准来确定，一般要考虑所制定的治疗措施适合患者，例如，患者的年龄或体重，其一般状况的严重性，对治疗和明显的第二效应的耐受性。
本发明的其他特征和优势将在实例和图表的继续描述中出现，其图例在下面表述。
附图描述
图1：IGF-IR的图示。
图2：在IGF附着的过程中IGF-IR介导的信号转导图。
图3A，3B和3C：单克隆抗体7C10识别MCF-7细胞表面上的天然IGF-IR。
对于这个实验，MCF-7细胞与7C10抗体或阴性对照抗体孵育，在荧光抗某种种属的二抗的辅助下回收。标记在FACS上读数。第一个直方图(图3A)单独对应于MCF-7细胞。在第二个直方图(图3B)中，无阴影的曲线对应于对照同型鼠抗体的非特异性标记。在第三个直方图(图3C)中，无阴影的曲线显示了MAS7C10对IGF-IR的识别。
图4A，4B和4C：分别表达IGF-IR或IR的Sf9昆虫细胞的标记。
图4A显示了非转染细胞单独的标记(1)或用对照的分别识别IGF-IR(2)或IR(3)市售单克隆抗体标记的细胞。在图4B，唯一表达IGF-IR的Sf9细胞用αIR3(2)或抗IR(3)标记，峰(1)代表单一细胞。在图4C中，唯一表达IR的Sf9用抗IR(3)或αIR3(2)标记，峰(1)代表单一细胞。
图5：7C10抗体对IGR-I诱导的MCF-7细胞增殖的抑制效应。
在存在或不存在要检测的MAB情况下，在增加IGF1浓度的情况下孵育MCF-7细胞。细胞的增殖通过3H胸苷掺入来评价。市售抗体αIR3用作试验的阳性对照。7G3是鼠抗IGF-IRIgG1，对增殖没有活性，用作对照的同型。
图6A，6B和6C：
-图6A：单克隆抗体7C10对裸鼠中MCF--7肿瘤生长的体内效应；
-图6B和6C：分别来自Arteaga等人(J.Clin.Invest.，84，1418-1423，1989)和Li等人(Cancer Immunol.Immunother.，49，243-252)发表文章中的图表，图6B显示了鼠αIR3的效应(同样注明为αIR3)和图6C显示了来自1H7的重组scFv-Fc对肿瘤生长的效应。
图7：MAb7C10效应和他莫西芬对体内肿瘤MCF-7生长的对比研究。
图8A，8B和8C：鼠抗体7C10在体内肿瘤细胞的不同异种移植模型中的抗肿瘤活性研究。
图8A显示了骨肉瘤模型SK-ES-1中获得的结果，图8B与一种前列腺雄激素非依赖性肿瘤DU-145有关，图8C与肺非小细胞肿瘤模型A549有关。在这三种模型中，每周两次腹腔内以250μg/次用药/鼠的速率给药治疗。曲线7G3，EC2和9G4分别对应每个模型中用作试验对照同型的三种鼠IgG1。
图9：MAb7C10与新霉酰胺(长春瑞宾)抗肿瘤效应的对比以及两种化合物在体内对细胞系A549生长的协同作用的研究。
图10：MAbαIR3，7C10和1H7对IGF-2诱导的MCF-7细胞增殖活性的比较。
图11：比较鼠7C10和嵌合C7C10 MAb对体外IGF1诱导的MCF-7细胞增殖的抑制作用。抗体9G4是用作试验对照同型的鼠IgG1。
图12：7C10和h7C10MAb(人源化1，在此记为7H2HM)对体外IGF1诱导的MCF-7细胞增殖模型的效应比较。
图13：7C10和h7C10 MAb(人源化1，在此记为7H2KM)对IGF1诱导的信号转导的效应。第一行点对应于由抗磷酸酪氨酸抗体所显示的免疫沉淀的β链的磷酸化，是来自在IGF1单独存在下或IGF1与要检测的多种抗体混合的情况下孵育的细胞中。9G4和hlgG1分别是7C10和h7C10(同样记为7H2HM)的对照同型。第二行点对应于β链的显示，显示所有孔中沉淀的量均完全相等。
图14：cDNA(SEQ ID No.48)序列，其互补链(SEQ ID No.50)序列，及其翻译的氨基酸(SEQ ID No.49)序列，用引物MKV-1和MKC从鼠杂交瘤7C10扩增的PCR片段的序列，该引物编码引导肽的3’末端和7C10VL。
图15：cDNA(SEQ ID No.51)序列，其互补链(SEQ ID No.53)序列和其翻译的氨基酸(SEQ ID No.52)序列，用引物MHV-12和MHC-1和MHV-8和MHC-1从鼠杂交瘤7C10扩增的PCR片段的序列，所述引物编码引导肽的3’末端和7C10VH。
图16：通过嵌合抗体7C10识别IGF-1受体，同样称为C7C10(cos7转染细胞培养物的上清液)。
图17：鼠7C10 VL(SEQ ID No.54)的氨基酸序列与具有最大序列同源性的其他鼠抗体单位的比较。
氨基酸的编号方式采用Kabat等人(1991)的方法。框架区(CDR外侧)的残基，在7C10VL和Kabat鼠亚组II(SEQ ID No.57)之间有差异，被加上下划线。圆点表示在这个位置上与7C10VL的序列比较残基是相同的。DRB1-4.3(SEQ ID No.55)代表了抗人鼠抗体MHC II类B链(在Kabat数据库中的记录号为N011794)的轻链序列。C94-5B11’CL(SEQ ID No.56)代表了鼠抗体的轻链序列(Kabat数据库中的记录号为P019314)。
图18：比较鼠7C10 VL(SEQ ID No.54)的氨基酸序列与属于Kabat人亚组II(SEQ ID No.60)并具有最大序列同源性的人轻链单位。
氨基酸序列被排列，并与鼠7C10VL的序列相比较。圆点表示在这个位置上与7C10VL的序列比较残基是相同的。GM607(SEQ ID No.58)代表由人淋巴母细胞瘤细胞系GM607分泌的κ轻链的序列(Klobeck等人，Nucleic Acids Res.，12：6995-7006，1984a和Klobeck等人，Nature，309：73-76，1984b，Kabat数据库中的记录编号为N011606)。DPK15/A19(SEQ ID No.59)代表人V胚细胞系κII的序列。
图19：比较鼠7C10(SEQ ID No.54)轻链(VL)，人抗体CM607(SEQ ID No.58)和人源化7C10 1和2(SEQ ID Nos.61 and 65)的两种形式的可变区氨基酸序列。
氨基酸序列被排列，并与鼠7C10 VL相比较。圆点表示在这个位置上与7C10VL的序列相比较残基是相同的。GM607代表由人淋巴母细胞瘤细胞系GM607分泌的κ轻链的序列(Klobeck等人，1984a和1984b，Kabat数据库中的记录编号为N011606)。
图20：cDNA序列(SEQ ID No.62)，其互补链序列(SEQ ID No.64)和其翻译的氨基酸序列(SEQ ID No.63)，由引导肽和7C10 VL人源化形式1重新组装编码所构建的基因序列。
图21：cDNA序列(SEQ ID No.66)，其互补链序列(SEQ ID No.68)和其翻译的氨基酸序列(SEQ ID No.67)，由引导肽和7C10 VL的人源化形式2重新组装编码所构建的基因序列。
图22：比较鼠7C10 VH(SEQ ID No.69)的氨基酸序列与属于Kabat鼠亚组I(A)，并具有最大序列同源性的人鼠重链的序列。
氨基酸的编号方式采用Kabat等人(1991)的方法。框架区(CDR外侧)的残基，在7C10VH和Kabat鼠亚组I(A)之间有差异，被加上下划线。圆点表示在这个位置上与鼠7C10VH的序列比较残基是相同的。ANO3’CL(SEQ ID No.70)代表了鼠抗体(在Kabat数据库中的记录号为P001289)的重链序列。
图23：比较鼠7C10 VH(SEQ ID No.69)的氨基酸序列与属于Kabat鼠亚组II(SEQ ID No.72)，并具有最大序列同源性的人重链的序列。
加了下划线的残基是Chothia等人(1989)所确定的典型结构的一部分。圆点表示在这个位置上与鼠7C10VH序列比较残基是相同的。
人VH FUR1’CL(SEQ ID No.73)代表了自体免疫来源的人抗核纤层蛋白B抗体IgM/K的重链序列(Marietta等人，Arthritis and Rheumatism，36：1315-1324，1993，Kabat中的记录编号为：N020619)。人germline(SEQ ID No.74)代表人germinal系4.22 VH IV的序列(Sanz等人，EMBO.J.8：3741-3748，1989)。
图24：比较鼠7C10(SEQ ID No.69)重链(VH)的可变区氨基酸序列和由CDR嫁接人源化VH 1，2和3(分别为SEQ ID Nos.75，79和83)三种人源化形式的氨基酸序列。
残基的编号方式与Kabat方法对应。序列被排列，并与鼠7C10 VH进行比较。圆点表示在这个位置上与鼠7C10 VH的序列相比较残基是相同的。
图25：cDNA序列(SEQ ID No.76)，其互补链序列(SEQ ID No.78)和其翻译的氨基酸序列(SEQ ID No.77)，由引导肽和7C10 VH的人源化形式1重新组装编码所构建的基因序列。
图26：cDNA序列(SEQ ID No.80)，其互补链序列(SEQ ID No.82)和其翻译的氨基酸序列(SEQ ID No.81)，由引导肽和7C10 VH的人源化形式2重新组装编码所构建的基因序列。
图27：cDNA序列(SEQ ID No.84)，其互补链序列(SEQ ID No.86)和其翻译的氨基酸序列(SEQ ID No.85)，由引导肽和7C10 VH的人源化形式3重新组装编码所构建的基因序列。
图28：在ELISA中比较嵌合抗体7C10(称为“C7C10”)和其人源化形式1(7C10hum1)对IGF-1受体的识别活性。
图29：在ELISA中对7C10抗体轻链的人源化形式1和2识别IGF-1受体活性的影响。
图30：在ELISA中比较嵌合抗体7C10和与人源化的7C10 VL2组合的重链的三种人源化形式(7C10 hum 1，2和3)的IGF-1受体识别活性。
图31：7C10抗体在常位模型A549中的抗肿瘤活性。
图32A，32B，32C和32D：在抗体7H2HM(分别为图表32C和32D)存在下在4小时中培养的A549和MCF-7细胞水平上观察到的ADCC的研究。抗体h4D5用作细胞A549和MCF-7(分别为图表32A和32B)的平行试验阳性对照。
图33A，33B和33C：抗体7C10和7H2HM对MCF-7细胞的细胞循环的效应。
图33A代表了在缺少IGF1的情况下，G0/G1，S和G2/M期中MCF-7细胞的比例，表示为所观察到的总MCF-7细胞的显著百分比。
图33B代表了存在IGF-1的情况下G0/G1，S和G2/M期中MCF-7细胞的比例，表示为所观察到的总MCF-7细胞的百分比。
与缺少IGF1(″0″)的对照标本相比较的图表中表明有化合物的存在下，图33C代表了在S(■)和G2/M(□)期MCF-7细胞的比例，表示为所观察到的总MCF-7细胞的百分比。
图34A和34B：抗体7C10和7H2HM对体外A549细胞生长(图34A)和体内MCF-7细胞生长(图34B)的效应比较。
图35A和35B：与对照标本比较，抗体7H2HM与新霉酰胺(NA)组合在模型A549中的体内协同作用的研究。图35A代表了种植的肿瘤体积的进展，从治疗开始和经过大约50天，作为治疗的函数(图35A)。图35B代表了与大约48天相比，这种进展以一种特殊的方式所获得的结果。在这个图表中，抗体7C10所获得的结果已经通过比较被引入(星号(*)对应于对照组/组(7C10+Na)或对照组/组(7H2HM+Na)以t-检验进行的比较)。
图36：抗体7C10和7H2HM对凋亡效应的研究。
数字表明抗体7C10和7H2HM可增强阿霉素的效应(阿霉素2μg/ml)。
图37A至37D：通过在FACS上的标记证明A549细胞上EGFR和IGF-IR的存在。
图38：共同给予MAB 7C10和225对肿瘤A549体内生长的效应。
图39：共同给予MAB 7C10和225对用A549细胞同位种植小鼠生存的效应。
图40A和40B：证明MAB 7C10和7H2HM可抑制IGF-IR和IRS-1β链的酪氨酸磷酸化。
图41：证明MAB 7C10和7H2HM对IGF-IR内化的诱导。
图42A至42C：证明MAB7C10和7H2HM对IGF-IR的降解。
实例1鼠单克隆抗体(MAb)的产生和选择
目标是产生特异针对IGF-IR的MAb，不识别IR，设想的方案包括6个筛选阶段。它包括：
用重组IGF-IR免疫小鼠，以便产生杂交瘤，
-通过ELISA对培养上清液筛选可用来免疫的重组蛋白，通过ELISA检测所有阳性的杂交瘤上清液，在MCF-7肿瘤细胞表面上过度表达天然受体，根据分别表达IGF-IR或IR的杆状病毒感染的昆虫细胞上IGF-IR和IR的差别识别，评价在两个首次筛选中均阳性的杂交瘤上清液，
-证实在此期选择的抗体能够在体外抑制IGF1所诱导的MCF-7细胞增殖，
-根据对肿瘤MCF-7生长的影响，保证所保留的候选物在裸鼠中的体内活性。
所有这些不同的阶段和获得的结果将简要地在下面的实例1中进行描述。
对于免疫阶段，小鼠通过皮下途径用8μg重组IGF-IR注射两次。在雌性大鼠细胞与小鼠骨髓瘤Sp20Agl4融合前3天，小鼠通过静脉注射3μg重组受体刺激小鼠。融合后14天，杂交瘤的上清液通过ELISA在用IGF-IR敏化的板上进行筛选。保留发现上清液阳性的杂交瘤，在被FACScan进行检测前进行扩增以证实产生的抗体同样能够识别天然的IGF-IR。为了做到这一点，来自过度表达IGF-IR的雌激素依赖的乳腺肿瘤的MCF-7细胞用在ELISA选择的杂交瘤产生的每种培养上清液孵育。在细胞表面上的天然/MAb受体复合体通过与一种荧光色素偶联的第二抗种属抗体所识别。图3A至3C显示了用杂交瘤7C10(图3C)上清液获得的类型与单独标记的细胞+二抗(图3A)或与用对照同型(图3B)标记的细胞比较的直方图。
在选择阶段，仅有同时识别重组受体和天然受体，分泌MAb的杂交瘤可被选择和克隆。产生由这些杂交瘤分泌的MAb，然后在被FACScan检测之前，根据上述的方法，在表达IGF-IR或IR的Sf9昆虫细胞上纯化，以便去除同时识别两种受体的杂交瘤。图4A显示了直方图1，2，3的总体回收情况，这些直方图分别对应未感染的细胞+二抗(1)，αIR3标记的未感染细胞+二抗(2)和抗IR抗体+二抗标记的未感染细胞(3)。第一个结果良好地显示了在这些未感染昆虫细胞表面上缺少可检测到的IGF-IR和IR。图4B显示了通过表达IGF-IR的杆状病毒对感染细胞的标记。在第二个图中，αIR3用作阳性对照，可如所预期的那样可良好地标记细胞(峰2)，而抗IR(峰3)则叠加在单一细胞的峰上。最后，在图4C中，显示如所预期的，抗IR可很好地标记表达IR的Sf9细胞(峰3)，但以一种意外的方式，在文献中所述的对IGF-IR有特异性的αIR3似乎同样可识别IR(峰2)。
在第三个筛选系统中获得的结果在表中进行总结，显示了一种MAb：7C10的产生，满足了识别IGF-IR，不识别IR的标准。Mab 7C10的同种分型显示它涉及一种IgG1。
表1：MAb 7C10对表达IGF-IR或IR的Sf9昆虫细胞的比较反应性                   MFI(平均荧光强度)未感染的细胞IGF1R+细胞IR+细胞    细胞    抗IR  抗IGF-IR(αIR3)    EC2    抗鼠FITC    超培养营养基    8    4.6    9    8    4.3    9    8    9    35    13    9    10    7    91    32    11    13    11    15B9    9F5D    13G5    7C10    7.5    8    7.8    8.6    25    41    37    49    77.8    40    24    13
供选择MAb的两个最后的筛选物在于证实后者能够抑制IGF-1在体外和体内诱导的MCF-7细胞系的细胞增殖。
对于体外选择，接种MCF-7细胞，无胎牛血清，然后在IGF-1浓度渐增(从1至50ng/ml)、存在或不存在加至终浓度10μg/ml的待测7C10抗体的条件下孵育。在此实验中，引用市售αIR3 Mab作为阳性对照，7G3 MAb(与7C10并行分离，对天然受体弱识别(在FACS上MFI为50，相比MAb 7C10为200))作为同型对照。通过以下用β计数器检测掺入含氚胸腺嘧啶核苷的细胞来评估细胞增殖。结果表述为增殖指数。数据呈现在图5中，显示IGF1能够以剂量依赖的方式刺激MCF-7细胞的增殖。用作阳性对照的MAb αIR3完全地抑制IGF-1诱导的MCF-7细胞的增殖。以同样的方式，MAb 7C10显著地抑制IGF-1诱导的MCF-7细胞的生长。最后，如所预期的，用作同型对照的MAb 7G3很好地证明是对MCF-7细胞的体外肿瘤细胞生长没有影响。
在已建立的肿瘤模型中进行体内选择。为此，裸鼠接受皮下植入缓释雌激素，这对鼠模型中得到肿瘤是不可缺少的。雌激素植入24小时后，5.106MCF-7细胞被皮下接种在小鼠右腹侧。此细胞接种5天后，肿瘤可测量，并随机形成6只小鼠的批次。每周对小鼠进行两次处理，在5至6周的时间内，以250μg/次/小鼠的剂量。在对照组，小鼠以与同型对照鼠同样的方式处理。结果呈现于图6A，显示抗体7C10对肿瘤生长产生非常显著的抑制作用。如果对照可获得关于αIR3的数据，此活性是特别意外的，αIR3通常在IGF1受体结构区中被用作参照，已知对雌激素依赖肿瘤的活体内生长没有任何作用(见图6B)。以同样的方式，与用来自鼠MAb1H7的重组抗体scFv-Fc获得的结果相比(见图6C)，MAb 7C10对MCF-7细胞的活体生长的抑制作用更有效。
实例2.7C10和他莫西芬对MCF-7肿瘤活体生长效应的比较
为了确定抗体7C10对雌激素依赖乳腺癌治疗的有效性，将7C10和他莫西芬做了比较，而他莫西芬是当前用于治疗有局部和/或转移的进展乳腺癌以及预防复发的药物(见VIDAL 2000，1975-1976页)。
在激素依赖的乳腺癌中，雌激素受体(ER)表达和IGF-IR表达存在着显著的相关关系(Surmacz E等人，Breast Cancer Res Treat，Feb，47(3)：255-267，1998)。此外，雌激素(E2)为了刺激细胞增殖似乎可与IGF1(有时写作IGF-I或者IGFI)一道起协同作用。已经显示E2治疗可以使IGF-IR mRNA及其蛋白质表达水平升高近10倍(Lee AV等人，Mol Endocrinol，May，13(5)：787-796，1999)，具体表现为IGF-IR的磷酸化显著增加。另外，E2能明显刺激IRS-1(胰岛素受体底物-1的缩写)的表达，而IRS-1是磷酸化IGF-IR的底物之一。
许多年来，他莫西芬广泛用于E2依赖乳腺癌患者的激素疗法(Forbes JF，Semin Oncol，Feb，24(1st Suppl 1)：S1-5-S1-19，1997)。他莫西芬和雌二醇竞争并抑制雌二醇对其受体的附着(Jordan V.C.，Breast Cancer Res.Treat.，31(1)：41-52，1994)。另外，他莫西芬还可通过抑制IGF-IR的表达和磷酸化来抑制IGF-IR依赖的增殖(Guvakova M.A.等人，Cancer Res.，July 1，57(13)：2606-2610，1997)。这些资料作为一个整体似乎指明了IGF-IR是E2/ER相互作用诱导的增殖过程中的一个重要介质。
长期使用他莫西芬还能显著增加子宫内膜肿瘤发生的危险(Fisher等人，J.National Cancer Institute，86，7：527-537，1994；VIDAL 2000，1975-1976)及E2非依赖性乳腺癌的间接复发(Li C.I.等人，J.Natl.Cancer Inst.，July4，93(13)：1008-1013，2001)。于是在这种情形下利用MCF-7模型做了7C10抗体和他莫西芬体内抗肿瘤效应的比较研究，以便明确其在与IGF-IR相关的ER增殖中的活性。为此，7×106 MCF-7细胞皮下种植于裸鼠，24小时后植入长久释放的雌二醇颗粒(0.72mg/片，释放超过60天)，这是建立任何人类E2依赖性肿瘤动物模型必不可少的。细胞种植5天后测量肿瘤大小，并将小鼠分成6组，分别做如下处理：1)腹膜内注射7C10抗体，剂量为250μg/只，每周两次；2)腹膜内注射10μg他莫西芬PBS液，内含3％羟基丙烷基纤维素(HPC)；或者3)溶解他莫西芬的溶剂(羟基丙烷基纤维素)。他莫西芬每天注射，持续4周，周末除外。接受类似单抗7C10处理的小鼠每天注射含3％HPC的PBS。先前已经有一项研究证实单独注射溶剂对肿瘤生长没有影响。
图7结果显示单抗7C10能显著抑制肿瘤MCF-7的生长(星号*对应于对照组/7C10组以t检验的比较)，而且7C10抗体似乎比他莫西芬抑制肿瘤生长更有效(圆圈°对应于他莫西芬组/7C10组以t检验的比较)，提示这种单抗治疗可能替代他莫西芬治疗。
实例3.单抗7C10体内抗不同来源人体肿瘤活性的实证
a)抗体7C10在三种肿瘤模型上的体内活性
为了归纳对其他表达IGF1受体肿瘤的活性，7C10抗体分别在雄激素非依赖性的前列腺肿瘤模型DU145(也写作DU-145)、SKES-1骨肉瘤模型以及肺非小细胞肿瘤模型A549上做了测试。实验方案与前述MCF-7的设计可比，结果(图8A～8C)显示此单抗在这三种肿瘤模型上有明显的活性。前列腺肿瘤模型上观察到的活性特别引人关注，因为单抗1H7的单链scFv对雄激素非依赖性的前列腺肿瘤模型并无作用(Li等人，2000)。
b)抗体7C10在同位移植肿瘤模型A549上的体内活性
前述的传统的异种移植模型不能进行肿瘤转移的药物研究，因为皮下种植的肿瘤仍然局限于注射部位，因而不能如实人体的实际情况。为了在一个更接近实际情形的模型上评价我们的抗体，我们将A549细胞植入胸膜内。此模型(Clin.Cancer Res.2000 Jan；6(1)：297-304有详细描述)就可用于肿瘤转移研究，接近人体上观察到的肿瘤转移，如纵隔、肺、心以及脊柱的转移。实验中，106A549细胞注入雌性裸鼠胸膜内，7天后，22只裸鼠分成两批：一批接受500μg/只的攻击剂量，然后每周两次250μg的7C10治疗；另一批依照同样的设计用同种型9G4抗体治疗。图31显示单抗7C10治疗的小鼠存活率显著提高，表明此抗体对肿瘤转移有作用。
实例4.体内单抗7C10和新霉酰胺的比较以及两种疗法共用的效果
新霉酰胺是一种在肺非小细胞肿瘤和乳腺转移肿瘤治疗中需要的化疗化合物。我们在A549肿瘤模型上做了有关7C10抗体和新霉酰胺的比较及这两种产品可能有的相互协同作用的研究。在实验中，5.106A549细胞被皮下移植到小鼠的右侧腹部，5天后测量肿瘤大小并开始单抗和/或新霉酰胺的治疗。抗体剂量始终为250μg/次/鼠，一周两次，腹膜内注射。至于新霉酰胺，腹膜内注射小鼠所能承受的最大剂量或者10mg/kg。这种治疗每隔7天进行一次，共3次，共同治疗时两种产品注射前再混合。
图9的结果显示抗体7C10令人惊异地与传统的新霉酰胺治疗在这种模型中一样起作用，同样于第72天在7只小鼠中的5只身上(无可测出的肿瘤)也观察到两种产品显著的协同作用。
实例5.体外抑制IGF2诱发MCF-7肿瘤生长的研究
正如上面指出的，许多肿瘤都过表达IGF-IR，尤其在大部分乳腺和结肠肿瘤中，增殖信号是通过IGF2(有时写作IGF-II或IGFII)转给此受体的。所以，确保单抗7C10同样可以体外抑制IGF2诱导的MCF-7肿瘤增长是非常必要的。为此，细胞接种于96孔板中，去除胎牛血清并加入在培养基中为终浓度的200ng IGF2/ml进行刺激(加或不加浓度为10μg/ml的待测单抗)。图10的结果显示如同IGF1一样，IGF2显著刺激MCF-7细胞的生长，而加入用作对照的同种型9G4抗体则没有刺激作用。正如De Leon等人描述的(Growth Factors，6：327-334，1992)一样，在加入单抗αIR3的过程中没有观察到任何效应。另一方面，单抗7C10完全抑制了IGF2诱发的生长，其活性显著高于1H7。
实例6.嵌合7C10(C7C10)和人源化7C10(h7C10)的生物学活性
a)7C10/C7C10和7C10/h7C10的体外作用在MCF-7模型上的比较
如上所述，在MCF-7模型上测试了嵌合形式的7C10抗体及纯化的人源化形式1的抗体(此处写作7H2HM)。图11和12的结果分别显示出这两种形式的抗体很完美地保留了其抑制IGF1诱导的MCf-7肿瘤生长的特性。
b)单抗7C10和h7C10在IGF1附着其受体后所诱发的信号转导过程的比较效应
体外实验中对IGF1诱导的MCF-7细胞系生长的抑制活性应该是单抗7C10结合IGF1受体过程中抑制IGF1介导的信号转导的转化。为证实这个假说，MCF-7细胞在有或没有待测抗体存在的条件下和IGF1或不和IGF1共同孵育。经过短暂的孵育后，溶解细胞，免疫沉淀β链，并借助抗磷酸酪氨酸激酶抗体评估此亚单位的磷酸化。图13的实验结果显示7C10或h7C10附着后显著抑制了IGF-IRβ亚单位的磷酸化，与无关鼠抗体(9G4)或人抗体(实验方案中写作IgG1)相反。
c)7H2HM抗体介入的ADCC机制
b)段所述信号转导的抑制是7C10和7H2HM抗体发挥生物学活性的主要机制，然而，在应用于人体时，IgG1的同种型7H2HM抗体可能通过ADCC(抗体依赖的细胞毒性)类型的机制引发细胞的溶解。为了证实此观点，来自人类供体的外周血NK(自然杀伤)细胞置于A549或预先和10μg 7H2HM抗体共同孵育4小时(每5×105个细胞)并标记了51Cr(50μg)的MCF-7细胞中。在本实验中，贺赛汀(herceptin)(图32A和32B中写作h4D5)作为实验的阳性对照。正如预期的那样，图32A至图32D的结果显示贺赛汀在A549和MCF-7两种细胞上都引发了明显的ADCC(分别见图32A和32B)。同样地，7H2HM亦可在A549细胞引发ADCC(见图32C)，但此现象发生的幅度小于MCF-7细胞(见图32D)。
d)抗体7C10和7H2HM对细胞周期的效应
体外实验观察到的MCF-7细胞生长抑制应能透过对细胞周期的效应而表现出来。为了回答这个问题，我们将4×105MCF-7细胞接种于6孔板，24小时后去除小牛血清，在有或无被测试抗体的条件下加入IGF1。经过24小时的孵育，收获细胞用于细胞周期的研究。图33B显示了有IGF1对进入细胞周期以及MCF-7细胞生长的效应和无IGF1对进入细胞周期以及MCF-7细胞生长的效应(见图33A)。加入生长因子后，可观察到G0/G1期的显著下降(从88.2％降至56.3％)而S期(从7.8％升至31％)和G2/M期(从4％升至12.7％)因此升高。加入抗体7C10和7H2HM(见图33C)过程中，可见进入细胞周期的进程明显受到抑制，其中要注意的是鼠源性抗体及其人源化类似物对细胞周期具有可相比的活性。作为阳性对照，αIR3在实验中的活性较7C10和7H2HM稍差，而对照同种型9G4抗体对细胞周期无影响。
e)A549体内模型上抗体7C10和7H2HM的比较活性
为了证实人源性抗体7H2HM的体内活性，我们将7H2HM和单抗7C10在肺非小细胞肿瘤模型A549上做了比较，除了将每周两次、每次剂量250μg改为125μg外，其余实验严格按上面的方案进行，因为大量的7H2HM抗体未利用。抗体9G4作为单抗7C10的同型对照，一无关的人免疫球蛋白同种型IgG1(以下称为HIgG1)用作人源化抗体7H2HM的对照。
图34A显示9G4与HIgG1的对照曲线没有明显差异，而鼠单抗7C10则如愿抑制了肿瘤的生长，至于人源化抗体7H2HM的活性强度与其鼠源性抗体完全一致。此结果连同前面体外实验观察到的现象提示人源化并未改变抗体的特性。另一方面，在小鼠异种移植模型中，人源化抗体的活性似乎固有地与信号转导的抑制机制联系在一起，于是，如果ADCC效应在裸鼠肿瘤生长抑制的过程中起作用，那么，应该可以观察到鼠源性和人源化抗体活性上的差异。
如所预期的，在MCF-7乳腺癌模型所做的同样的体内实验就显示抗体7H2HM在抑制体内肿瘤生长方面完全可与鼠源性抗体7C10媲美(图34B)。
f)7H2HM和新霉酰胺之间协同作用的实证
重复实例4所提供的实验方案以期重获7C10及其人源化抗体7H2HM的结果。
图35A和35B的结果显示，在有7C10的情况下，人源化抗体和7H2HM和新霉酰胺之间有明显的协同效应。
g)抗体7C10和7H2HM对MCF-7细胞体外凋亡的效应
如前所述，在细胞表面过表达时IGF-IR可提供针对凋亡的保护。此外，前述的实例也表明抗体7C10和7H2HM具有作为化疗活性化合物的潜力。为了测试抗体7C10和7H2HM诱导凋亡的能力并部分解释其与化疗药物的潜在协同作用，我们对MCF-7细胞在有无阿霉素(可致体外细胞系凋亡的药剂)的条件下进行了实验。在实验中，MCF-7细胞以2.104/cm2接种于平皿内并在无酚红的10％胎牛血清(FCS)RPMI培养基中培养24小时，然后PBS洗两次，再放回无FCS的培养基中培养。在加入10μg/ml抗体之前允许有37℃、10分钟的适应时间，再37℃培养10分钟，将重组的IGF-1(Sigma)加入培养基(终浓度50ng/ml)。细胞再次置于37℃，1小时，使抗体和IGF-I吸附。最后，培养基中加入阿霉素(Sigma)，浓度2μg/ml，细胞继续37℃孵育24小时。
10μg/ml新霉酰胺亦做同样的处理。
在用annexin V-FITC(20分钟，4℃)和DAPI(2μg/ml)标记后，借助流式细胞术分析细胞的活力。死细胞百分率通过标记的Annexin+/DAPI+集落计算。抗体5C2用作同型对照。
图36的结果显示阿霉素诱发了8％的MCF-7细胞凋亡。当细胞经抗体7C10和阿霉素共同处理后可见细胞死亡明显增加。相同的效应亦见于抗体7H2HM。抗体和新霉酰胺共用时也能观察到相同形式的结果。
实例7.编码单克隆抗体(MAb)7C10重和轻链可变区的基因的克隆策略
使用TRI REAGENTTM(按照供应商提供的使用说明书，SIGMA，T9424)从107的分泌抗体7C10的杂交瘤细胞中抽提总RNA。借助Amersham-Pharmacia的’第一链cDNA合成’试剂盒(#27-9621-01，按照供应商提供的使用说明书)，合成第一个cDNA链。对于二个链，用试剂盒中含有的寡核苷酸Not I-d(T)18进行激发反应。
由此获得的cDNA:mRNA杂交体被用来通过PCR扩增编码Mab 7C10重和轻链的基因。通过使用对小鼠免疫球蛋白重和轻(κ)链特异的寡核苷酸联合进行PCR。对应于5’端的引物在对应于信号肽的区域内杂交(表2为重链，表3为轻链)。这些引物是从数据库中的大量小鼠抗体序列中搜集的(Jones S.T.等人，Bio/Technology 9：88-89，1991)。对应于3’端的引物在重链恒定区内杂交(亚类IgG1的CH1区，距V-C连接不远，表4的MHC-1引物)和轻链(κ区，距V-C连接不远，表4的MKC引物)。
表2：小鼠免疫球蛋白重链可变区(MHV)5’区的寡核苷酸引物(″小鼠可变重链″″MHV″)
MHV-1：    5′ATGAAATGCAGCTGGGTCATSTTCTT 3′    (SEQ ID No.13)
MHV-2：    5′ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT 3′    (SEQ ID No.14)
MHV-3：    5′ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTT 3′    (SEQ ID No.15)
MHV-4：    5′ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRT3′        (SEQ ID No.16)
MHV-5：    5′ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT 3′    (SEQ ID No.17)
MHV-6：    5′ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTG 3′    (SEQ ID No.18)
MHV-7：    5′ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT 3′    (SEQ ID No.19)
MHV-8：    5′ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG 3′       (SEQ ID No.20)
MHV-9：    5′ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATT 3′    (SEQ ID No.21)
MHV-10：   5′ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT 3′    (SEQ ID No.22)
MHV-11：   5′ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG 3′  (SEQ ID No.23)
MHV-12：   5′ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT 3′    (SEQ ID No.24)
NB KEY：   R＝A/G，Y＝T/C，W＝A/T，K＝T/G，M＝A/C，S＝C/G.
表3：小鼠免疫球蛋白κ(轻)链可变区(MKV)5’区的寡核苷酸引物(″小鼠可变κ″″MKV″)
MKV-1：    5′ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 3′  (SEQ ID No.25)
MKV-2：    5′ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGT 3′  (SEQ ID No.26)
MKV-3：    5′ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT 3′        (SEQ ID No.27)
MKV-4：    5′ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGG 3′     (SEQ ID No.28)
MKV-5：    5′ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTT 3′  (SEQ ID No.29)
MKV-5A：   5′ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT3′   (SEQ ID No.30)
MKV-6：    5′ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRG3′      (SEQ ID No.31)
MKV-7：    5′ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACA 3′        (SEQ ID No.32)
MKV-8：    5′ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAAT 3′  (SEQ ID No.33)
MKV-9：    5′ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTT 3′       (SEQ ID No.34)
MKV-10：   5′ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC 3′     (SEQ ID No.35)
MKV-11：   5′ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT 3′     (SEQ ID No.36)
MKV-12A：  5′ATGRAGTYWCAGACCCAGGTCTTYRT 3′     (SEQ ID No.37)
MKV-12B：  5′ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT 3′     (SEQ ID No.38)
MKV-13：   5′ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT 3′     (SEQ ID No.39)
NB KEY：R＝A/G，Y＝T/C，W＝A/T，K＝T/G，M＝A/C，S＝C/G.
表4：小鼠VH和VL基因3’端的寡核苷酸引物
轻链(MKC)：
5′ACTGGATGGTGGGAAGATGG 3′                            (SEQ ID No.40)小鼠κ区的恒定区：
A   D   A   A   P   T   V   S   I   F   P   P   S   S   (SEQ ID No.41)
GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA TCC AGT (SEQ ID No.42)
                            ||  ||| ||| ||| ||| ||| |||
                       (MKC)CC  ATC TTC CCA CCA TCC AGT (SEQ ID No.43)
重链(MHC-1)
5′CCAGTGGATAGACAGATG 3′                               (SEQ ID No.44)小鼠γ-1(IgG1亚类)的CH1区：
A   K   T   T   P   P   S   V   Y   P   L      (SEQ ID No.46)
GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG    (SEQ ID No.45)
                ||| ||| ||| ||| ||| ||| |||
(MHC-1)         CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG    (SEQ ID No.47)
实例8.克隆自鼠杂交瘤7C10的免疫球蛋白序列
遵循前述的扩增策略，对应于重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的PCR产物用pGEM_-T Easy Vector Systems(Promega)进行克隆。对7C10 VL而言，PCR产物经MKC连同MKV1与MKV2引物扩增得到，而7C10 VH则需用MHC-1连同MHV8和MHV12引物扩增PCR产物。PCR产物的全序列测定显示轻链有两处不同而重链只有一处。
a)从寡核苷酸MKV1分离出的可变区
所得DNA序列具有功能性免疫球蛋白可变区的特征，因此推测是7C10 VL的编码基因，其DNA(SEQ ID Nos.48和50)和氨基酸(SEQ ID No.49)的cDNA序列见图14。
b)从寡核苷酸MKV2分离出的可变区
此轻链编码基因来自于一异常mRNA转录物，该转录物存在于所有用于生产7C10杂交瘤的鼠骨髓瘤细胞Sp2/Oag14中的原始MOPC-21肿瘤的标准融合伴侣中。该序列包含了一种V、J基因异常重组的方式(四个碱基缺失致使读框中有一处改变)以及23位胱氨酸-酪氨酸的突变。这些改变提示此轻链可能没有功能，尽管可以转录为mRNA。假轻链的DNA序列没有给出。
c)从寡核苷酸MHV8和MHV12分离出的可变区
除了寡核苷酸自身编码的序列之外，用MHV8和MHV12扩增得到的DNA序列完全一样。这种序列是一种功能性重链的新的编码序列，被推定为单抗7C10的VH。编码7C10 VH的cDNA的DNA(SEQ ID Nos.51和53)及氨基酸(SEQ ID No.52)序列见图15。
实例9.鼠-人嵌合基因的构建
构建嵌合抗体7C10，使鼠7C10的VL和VH分别联接到人恒定区κ(kappa)和γ(gamma)-1区。寡核苷酸用于修饰7C10的VL和VH编码DNA的侧翼序列5’与3’端，使其能够克隆入载体进行哺乳动物细胞的表达。表达载体使用强启动子HCMV，以使嵌合抗体7C10重链和轻链有效转录。另一方面，这些载体同样含有SV40的复制启始点，使DNA高效复制并在cos细胞中瞬时表达。
实例10嵌合抗体7C10 IGF-1受体识别活性的表达和评估
两个包含嵌合抗体7C10编码DNA的质粒共转染cos-7细胞(ATCC编号CRL-1651)用于研究重组抗体的瞬时表达。孵育72小时后移去培养基，离心去除细胞碎片，用ELISA技术分析人IgG1抗体的产生(见实例16)及其识别IGF-1受体的活性(见实例17)。
人IgG1/Kappa浓度用ELISA方法检测，结果显示嵌合抗体7C10在cos-7细胞中的表达浓度介于300～500ng/mm，与大多数抗体测得的数据具有可比性。
IGF-1受体的识别采用ELISA试验，结果显示嵌合抗体特异地识别受体，且相对亲合力很好(见图3A，3B和3C)。这为7C10抗体正确的VH和VL基因鉴定提供了功能上的证据。另外，这种7C10的嵌合形式看来对人源化抗体亲合力的评估是一个不可缺少的工具。
实例11.鼠抗体7C10可变区的分子建模
为协助并改良经所谓“CDR嫁接”实现人源化的过程，基于1AY1重链和2PCP轻链的X射线结晶衍射获得的结构，我们构建了一个鼠抗体7C10 VL和VH区的分子模型。
实例12.抗体7C10轻链可变区(7C10VL)经CDR嫁接的人源化过程
a)7C10 VL氨基酸序列与所有已知鼠序列的比较
作为经CDR嫁接而人源化过程的一项预备步骤，7C10 VL的氨基酸序列和Kabat数据库中所有的鼠VL序列进行了比较(数据库的互联网地址是：ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_format/，最后更新于1999年)。7C10 VL经Kabat等人鉴定为κ轻链II亚组(见Sequences of proteins ofimmunological interest第五版，NIH publication No.91-3242，US Departmentof Health and Human Services，Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，1991)。序列同一性高达95％的鼠单克隆抗体轻链可变区(VL)已经鉴定(DRB1-4.3(SEQ ID No.55)：95％，C94-5B11’CL(SEQ ID No.56)：95％，见图17)。为确定7C10 VL序列中的非寻常氨基酸残基，7C10 VL氨基酸序列(SEQ ID No.54)和Kabat定义的鼠κ轻链II亚组的共有序列(SEQ ID No.57)进行了排列(见图17)。
在Kabat定义的3号位置，通常出现在κ轻链II亚组(71％)的缬氨酸(V)被亮氨酸(L)取代。此处的亮氨酸并非罕见，比如DR31-4.3和C94-5B11’CL就是如此。根据构建的分子模型，此氨基酸似乎并无特殊功能。因此，其保守性在人源化过程中可不必考虑。
在Kabat定义的7号位置，通常出现在κ轻链II亚组(66％)的苏氨酸(T)被异亮氨酸(I)取代。此处的异亮氨酸相对地较为罕见，因为在所有已知的鼠VL序列中仅仅发现了15次而在人VL序列中一次都没有发现过。分子模型显示此处的残基(17)指向分子的表面，但并不与CDR接触(最近处的CDR残基应是Kabat42位精氨酸)。另外，17位残基似乎也不太可能直接接触抗原。因此，其保守性在人源化过程中可不必考虑，至少不是首先要考虑的。
在Kabat定义的77号位置，通常出现在κ轻链II亚组(95.5％)的精氨酸(R)被丝氨酸(S)取代。此处的丝氨酸并非罕见。
b)7C10 VL的氨基酸序列与所有已知人VL序列的比较
为了确定“CDR嫁接”的最佳候选序列，我们搜索了可能与7C10 VL具有最大同源性的源自人的κ(Kappa)型VL区，最后还比较了鼠7C10κ(Kappa)型VL的氨基酸序列和所有Kabat数据库中的人κ(Kappa)VL序列。鼠7C10 VL和Kabat(1991)等定义的人II亚组κ(Kappa)型VL区有最大的序列同源性。源自人单克隆抗体的VH区在构成可变区的112个氨基酸中具有高达75.9％的序列同一性(GM607(SEQ ID No.58)，见图18)。一个源自人胚细胞系的序列DPK15/A19(SEQID No.59)也得以鉴定，序列和GM607(Klobeck等人，1984)相比有76％的同一性(见图18)。由此，GM607序列被选定为鼠7C10 VL对人CDR的受位序列(根据Kabat的定义)。通过比较GM607序列和人II亚组的共有序列(SEQ ID No.60)(图18)，没有发现框架区(Rch)有什么特别的氨基酸残基，同样的事实再次指明GM607是进行CDR嫁接的很好的候选位置。
c)人源化的7C10 VL
人源化的下一步是把鼠7C10 VL CDR与筛选出来的人轻链框架区(Rch)即GM607(Klobeck等人，1984)连接起来。在这一步骤里，鼠7C10 Fv区的分子模型对于选择保守的氨基酸残基特别有用，保守的序列既能在维持抗体分子三维结构方面(CDR的规范结构，VH/VL界面，等等)起到一定作用又能结合抗原分子。在框架区内，鼠(7C10 VL)和人(GM607)氨基酸的每一处差异都进行了小心翼翼的检查(见表5)。另外，鼠7C10 VL序列里经鉴定的某些特别的氨基酸残基(见实施例12.a)在必要时也都预以考虑。
第一种7C10 VL经“CDR嫁接”人源化的形式(human1)只是将GM607框架区(Rch)的一个残基改变，即Rch1中的第2位残基缬氨酸(按Kabat命名)，它实际上参与了7C10 VL CDR 1规范结构的构成，因而可能在维持CDR 1环的正确构型方面起关键作用，所以此缬氨酸在人源化时依然保留在同样的位置上(见表5和图19的氨基酸序列(SEQ ID No.61)和图20的DNA序列(SEQ ID Nos.62和64)，以及构成此肽信号的氨基酸序列(SEQ ID No.63)。
第二种7C10 VL经“CDR嫁接”人源化的形式(human 2)没有在人轻链GM607Rch内做任何改变，框架区里所有的残基均来自人，包括第2位替换鼠7C10 VL缬氨酸至人异亮氨酸的突变(见于人轻链GM607的相同位置(见表5和图19的氨基酸序列(SEQ ID No.65)和图21的DNA序列(SEQ ID Nos.66和68)，以及构成此肽信号的氨基酸序列(SEQ ID No.67))。这种形式是完全彻底的人源化(当然CDR本身要除外)，因为框架区内所有的氨基酸残基都来自人轻链GM607。
            表5：氨基酸序列排列，引导改型的人7C10 VL区设计kabat#FR或CDR小鼠轻链7C10人胚细胞系DPK15/A19GM607改型的人改型的人7C10 2注释11FR1DDDDD22|V*I*I*V*I*Cano  LI 4(16)微调带33|LVVVV44|MMMMM微调带55|TTTTT66|QQQQQ77|ISSSS88|PPPPP99|LLLLL1010|SSSSS1111|LLLLL1212|PPPpP1313|VVVVV1414|STTTT1515|LPPPP1616|GGGGG1717|DEEEE1818|QPPPP1919|AAAAA2020|SSSSS2121|IIIII2222|sSSSS2323FR1ccCCC2424CDR1RRRRR2525|S*S*S*S*S*Cano  LI 42626|sSsSS2727|QQQQQ
    27A    28    |    s    S    s    S    S    27B    29    |    I*    L*    L*    i*    i*Cano  LI  4    27C    30    |    V    L    L    i    I    27D    31    |    H    H    H    H    H    27E    32    |    S    S    S    S    S    28    33    |    N    N    N    N    N    29    34    |    G    G    G    G    G    30    35    |    N    Y    Y    n    N    31    36    |    T    N    N    t    T    32    37    |    Y    Y    Y    Y    Y    33    38    |    L*    L*    L*    L*    L*Cano LI 4    34    39    CDR1    Q    D    D    q    Q    35    40    FR2    W    W    W    W    W微调带    36    41    |    Y    Y    Y    Y    YVH/VL内微调带    37    42    |    L    L    L    L    L    38    43    |    Q    Q    Q    Q    QVL/VH内    39    44    |    K    K    K    K    K    40    45    |    P    P    P    p    P    41    46    |    G    G    G    G    G    42    47    |    Q    Q    Q    Q    Q    43    48    |    S    S    S    S    S    44    49    |    P    P    P    P    PVL/VH 内    45    50    |    K    Q    Q    Q    Q    46    51    |    L    L    L    L    LVL/VH内 微调带    47    52    |    L    L    L    L    L微调带    48    53    |    I    I    I    I*    I*Cano L2 1(7)微调带    49    54    FR2    Y    Y    Y    Y    Y微调带    50    55    CDR2    K    L    L    k    K    51    56    |    V*    G*    G*    V*    V*Cano L2 1(7)    52    57    |    S*    S*    S*    S*    S*Cano L2 1(7)    53    58    |    N    N    N    N    N    54    59    |    R    R    R    R    R    55    60    |    L    A    A    l    L    56    61    CDR2    Y    S    S    Y    Y
 5762 FR3GGGGG 5863 |VVVVV 5964 |pPPPP 6065 |DDDDD 6166 |RRRRR 6267 |FFFFF 6368 |SSSSS 6469 |G*G*G*G*G*Cano L2 1(7)微调带 6570 |SSsSS 6671 |GGGGG微调带 6772 |SSSSS 6873 |GGGGG微调带 6974 |TTTTT微调带 7075 |DDDDD 7176 |F*F*F*F*F*Cario LI 4(16)微调带 7277 |TTTTT 7378 |LLLLL 7479 |KKKKK 7580 |IIIII 7681 |SSSSS 7782 |SRRRR 7883 |VVVVV 7984 |EEEEE 8085 |AAAAA 8186 |EEEEE 8287 |DDDDD 8388 |LVVVV 8489 |GGGGG 8590 |VVVVV 8691 |YYYYY 8792 |YYYYYVL/VH内 8893 FR3CCCCC 8994 CDR3FMMfFVL/VH内 9095 |Q*Q*Q*Q*Q*Cano L3 1(9) 9196 |GAAgGVL/VH内 9297 |SLLsS 9398 |HQQhH
9499 |VTTVV9510 |P*p*P*P*P*Cano L3 19610 |WQwWVL/VH  内9710 CDR3TTTT9810 3 FR4FFFFVL/V内(+)微调带gg10 |GGGG10010 |GQQQ10110 |GGGG10210 |TTTT10310 |KKKK10410 |LVVV10511 |EEEE10611 |IIII10711 FR4KKKK
图例：第1栏(Kabat)表明根据Kabat等人(1991)的氨基酸残基位置；第2栏(#)表明氨基酸残基在正常序列中的位置；第3栏(FR或CDR)为容易地确定骨架节段(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR节段(CDR1、CDR2和CDR3)(″互补性决定区″的″CDR″)而制，具有3个CDRs分隔4个FRs；第4栏(小鼠轻链7C10)表示小鼠抗体7C10 VL区的氨基酸序列(SEQ ID No.54)；第5栏(人胚细胞系DPK15/A19)表示胚细胞系κII人V轻链的氨基酸序列(SEQ ID No.59)；第6栏(GM607)表示人抗体GM607 VL区的氨基酸序列(SEQ ID No.58)；第7和第8栏(改型的人7C10 1和2)表示人源化的1和2抗体7C10 VL的氨基酸序列(分别为SEQ ID Nos.61和65)。”*”表示为如Chothia等人所定义的CDR环的正规结构部分(Nature，342，877-883，1989)。
实例13.通过抗体7C10重链(7C10 VH)可变区的CDR嫁接进行人源化的步骤
a)7C10 VH氨基酸序列与所有已知小鼠VH序列的比较
作为通过CDR嫁接进行人源化的预备阶段，首先将7C10 VH的氨基酸序列与Kabat数据库(Internet address：ftp：//ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_f ormat/，最后数据更新日期从1999)中存在的所有小鼠VH序列比较。因此7C10 VH被确定为属于Kabat等人(1991)所定义的重链亚群I(A)。确定了具有高达90.5％序列同一性的小鼠单克隆抗体VH区(ANO3’CL(SEQ ID No.70)，见图22)。为了要确定7C10 VH序列中非普通残基，我们将7C10 VH的氨基酸序列(SEQID No.69)与Kabat所定义的小鼠重链亚群I(A)的共有序列(SEQ ID No.71)进行了排列对比(见图22)。
残基17(Kabat’s编号方式)，亚群I(A)共有序列是Thr，7C10 VH中是Ser，定位在有关恒定区界面的分子表面上。此残基看起来是不重要的。
残基27(Kabat’s编号方式)，亚群I(A)共有序列是Asp，7C10 VH中是Tyr，是CDR 1正则残基。在此位置的Tyr并不罕见，对维持CDR 1的良好构型可能是关键的。
残基84(Kabat’s编号方式)，亚群I(A)共有序列是Thr，7C10 VH中是Asn。Asn在小鼠VH被发现93次，在人VH中发现3次。按照分子模型，它是远离抗体结合部位的表面残基。
氨基酸的编号方式是Kabat等人的方式(1991)。在7C10 VH和Rabat小鼠亚群I(A)间不同的框架区中(除了CDRs)的残基被加下划线。ANO3’CL表示小鼠抗体重链的序列(在Kabat数据库中的记录号是P001289)。
b)7C10 VH氨基酸序列与所有已知人VH序列的比较
为了确定″CDR嫁接″的最佳人源候选者，考虑与7C10 VH具有最大可能同一性的人源VH区。为此，小鼠7C10 VH的氨基酸序列与Kabat数据库中存在的所有人VH序列比较。如Kabat等人(1991)所定义的，小鼠7C10 VH与亚群II的人VH区具有最大的序列同一性。人源单克隆抗体的VH区被确定在可变基因(也就是说除了CDRS和J区)编码的全部98个氨基酸范围内，具有高达67.3％的序列同一性(人VH FUR1’CL(SEQ ID No.73，见图23)。按照与VH FUR1’CL同样的标准还确定，人源胚细胞系4.22 VH IV(Sanz等人，1989)具有68.4％的序列同一性(人胚细胞系(SEQ ID No.74)，见图23)。由胚细胞系4.22 VH IV编码的序列被选择作为能够接受鼠7C10 VH而非VH FUR1’CL的CDRs(按照Kabat的定义)的人序列，因为在比较4.22 VH IV和VH FUR1’CL序列与人亚群II(人Kabat sg II(SEQ ID No.72)，见图23和表6)的共有序列时，尽管在VH FUR1’CL编码的序列中确定存在两个非典型的残基(按照Kabat的命名法，分别是81和82A位置上的Gln和Arg)，但在4.22 VH IV框架区(Rch)内没有鉴定到非典型的残基存在。
c)7C10 VH的人源化形式
以下人源化过程的阶段包括连接小鼠7C10 VH的CDRs到人胚细胞系4.22 VHIV的框架区(Rch)上(Sanz等人，1989)。在此阶段，小鼠7C10 Fv区的分子模型在选择要保留的小鼠残基中特别地有用，保留的残基能够在保持分子的立体结构(CDRs正规结构，VH/VL界面，等)或与抗原结合(属于抗体结合部位)中起作用。在Rchs中，小鼠(7C10 VH)和人(4.2.2 VH IV)氨基酸之间的每一个差异被认真地检查(见表6)。此外，如果需要考虑已被确定的小鼠7C10 VH序列中的特殊残基(见实例8.a)。
在通过″CDR嫁接″人源化的第一种形式7C10 VH，人源化1中，在4.22 VH IV框架区(Rch)内进行了4个改变(见表6，图24是氨基酸序列(SEQ ID No.75)，图25是DNA序列(SEQ ID Nos.76和78)，以及组成肽信号的氨基酸序列(SEQ IDNo.77))。这4个改变涉及：
·位于Rch1的残基30(Kabat’s命名法)。此残基实际上进入7C10 VHCDR1的结构组合物中(如Chothia等人所定义的，1989)，并因此对维持此环的正确构造可能是关键的。在小鼠序列7C10 VH中存在于此位置的Thr因此保留在人源化形式的相同位置上。
·位于Rch2的残基48(Kabat’s命名法)。此残基接近CDRs，尽管按照分子模型不直接与后者接触，但能够影响其最终构造。在小鼠序列7C10 VH中存在于此位置的蛋氨酸因此保留在人源化形式1的相同位置上。
·位于Rch3的残基67(Kabat’s命名法)。此残基接近CDRs，按照分子模型能够接触CDR2中的赖氨酸60(Kabat’s命名法)。在小鼠序列7C10 VH中存在于此位置的异亮氨酸因此保留在人源化形式1的此位置上。
·位于Rch3的残基71(Kabat’s命名法)。此残基是CDR2正规结构的一部分，因此对维持此环的正确构造应当是关键的。在小鼠序列7C10 VH中存在于此位置的精氨酸因此保留在人源化形式1的此位置上。
在通过″CDR嫁接″人源化的第二种形式7C10 VH，人源化2中，在4.22 VH IV框架区(Rch)内进行了2个改变。这2个改变涉及已经在人源化形式1中描述的残基30和71(Kabat’s命名法)(见表6，图24是氨基酸序列(SEQ ID No.79)，图26是DNA序列(SEQ ID Nos.80和82)，以及组成肽信号的氨基酸序列(SEQ ID No.81))。
在通过″CDR嫁接″人源化的第三种形式7C10 VH，人源化3中，没有对4.22 VHIV的框架区(Rch)进行改变。Rchs的所有残基因此即是人源残基，包括已经保留的残基30、48、67和71(Kabat’s命名法)(见表6，图24是氨基酸序列(SEQ IDNo.83)，图27是DNA序列(SEQ ID Nos.84和86)，以及组成肽信号的氨基酸序列(SEQ ID No.85))。因此，此人源化的形式3是完全人源化的(当然，除了如Kabat所定义的CDRs本身以外)，因为所有的Rchs残基是由胚细胞系4.22 VH IV的VH基因编码的。
表6：氨基酸序列排列，引导改型的人7C10 VH区设计  KabmtFR或CDR小鼠重链    7C10  胚细胞系  4.22VH IV  人  FURICL  VH改造的人7C10H1改造的人7C10H2改造的人7C10H3    注释    1    FR1    D    Q    Q    Q    Q    Q    2    |    V    V    V    V    V    V微调带    3    |    Q    Q    Q    Q    Q    Q    4    |    L    L    L    L    L    L    5    |    Q    Q    Q    Q    Q    Q    6    |    E    E    E    E    E    E    7    |    S    S    S    S    S    S    8    |    G    G    G    G    G    G    9    |    P    P    P    P    P    P    10    |    G    G    G    G    G    G    11    |    L    L    L    L    L    L    12    |    V    V    V    V    V    V    13    |    K    K    K    K    K    K    14    |    P    P    P    P    P    P    15    |    S    S    S    S    S    S    16    |    Q    E    E    E    E    E    17    |    S    T    T    T    T    T    18    |    L    L    L    L    L    L    19    |    S    S    S    S    S    S    20    |    L    L    L    L    L    L    21    |    T    T    T    T    T    T    22    |    C    C    C    C    C    C    23    |    S    T    T    T    T    T    24    |    V    V    V    V*    V*    V*正规的H12(6)    25    |    T    S    S    S    S    S    26    |    G*    G*    G*    G*    G*    G*  正规的 H1 2(6)    27    |    Y*    Y*    Y*    Y*    Y*    Y*  正规的 H1 2(6)微调带    28    |    S    S    S    S    S    S  微调带    29    |    I*    I*    I*    I*    I*    I*  正规的 H1 2(6)  微调带    30    FR1    T    S    S    t    T    s  靠近CDR*的微调  带    31    CDR1    G    S    S    g    G    g    32    |    G    G    G    G    G    G    33    |    Y    Y    Y    Y    Y    Y    34    |    L    Y    Y    I    L    I    35    |    W*    W*    W*    W*    W*    W*  正规的H1 2(6)  VH/VL界面    35A    CDR1    N    G    G    m    N    m    36    FR2    W    W    W    W    W    W    37    |    I    I    I    J    I    I  VH/VL界面    38    |    R    R    R    R    R    R    39    |    Q    Q    Q    Q    Q    Q  VH/VL界面    40    |    F    P    P    P    P    P    41    |    P    P    P    P    P    P    42    |    G    G    G    G    G    G    43    |    N    K    K    K    K    K    44    |    K    G    G    G    G    G    45    |    L    L    L    L    L    L  VH/VL界面  (+)    46    |    E    E    E    E    E    E    47    |    W    W    W    W    W    W  界面  微调带    48    |    M    I    I    m    I    I  靠近CDRs的微调带    49    FR2    G    G    G    G    G    G    微调带
    50    CDR2    Y    S    S    V    Y    Y    微调带    51    |    I    I    M    I    I    I    52    |    S    Y    F    s    S    s    53    |    Y    H    H    v    Y    y    54    |    D    S    S    d    D    d    55    |    G*    G*    G*    G*    G*    G*正规的 H2 1(16)    56    |    T    S    S    t    T    t    57    |    N    T    S    n    N    n    58    |    N    Y    Y    n    N    m    59    |    Y    Y    Y    Y    Y    Y    60    |    K    N    N    k    K    k    61    |    P    P    P    r    P    P    62    |    S    S    S    S    S    S    63    |    L    L    L    L    L    L    64    |    K    K    K    K    K    K    65    CDR2    D    S    S    d    d    d    66    FR3    R    R    R    R    R    R    67    |    I    V    V    i    v    v靠近COR2的微调带    68    |    S    T    T    T    T    T    69    |    I    I    I    I    I    I    微调带    70    |    T    S    S    S    S    S    71    |    R*    V*    V*    r*    r*    V*正规的  H2 1(16)    微调带    72    |    D    D    D    D    D    D    73    |    T    T    T    T    T    T    微调带    74    |    S    S    S    S    S    S    75    |    K    K    K    K    K    K    76    |    N    N    N    N    N    N    77    |    Q    Q    Q    Q    Q    Q    78    |    F    F    F    F    F    F    微调带    79    |    F    S    S    S    S    S    80    |    L    L    L    L    L    L    81   |    K    K    Q    K    K    K    82   |    L    L    L    L    L    L    82A   |    N    S    R    S    S    S    82B   |    S    S    S    S    S    S    82C   |    V    V    V    V    V    V    83   |    T    t    T    T    T    T    84   |    N    A    A    A    A    A    85   |    E    A    A    A    A    A    86   |    D    D    D    D    D    D    87   |    T    T    T    T    T    T    88   |    A    A    A    A    A    A    89   |    T    V    V    V    V    V    90   |    Y    Y    Y    Y    Y    Y    91   |    Y    Y    Y    Y    Y    Y  VH/VL 界面    92   |    C    C    C    C    C    C    93   |    A    A    A    A    A    A  VH/VL 界面    微调带    94    FB3    R*    R*    R*    R*    R*    R*  正规的 H1 2(6)    微调带    95    CDR3    Y    G    v    v    vVH/VL 界面    96    |    G    R    g    g    g    97    |    R    Y    r    r    f    98    |    V    C    v    v    v    99    |    F    S    f    f    f    100    |    S    100A    |    T    100B    |    S    100C    |    C    100D    |    N    100E    |    W    100K    |    F    F    f    r    r VH/VL 界面(+)    101    |    D    D    d    d    d    102  CDR3    Y    P    y    y    y
  103  FR4    W    W    W    W    W VH/VL 界面(4)   微调带  104    |    G    G    G    G    G  105    |    Q    Q    Q    Q    Q  106    |    G    G    G    G    G  107    |    T    T    T    T    T  108    |    T    L    L    L    L  109    |    L    V    V    V    V  110    |    T    T    T    T    T  111    |    V    V    V    V    V  112    |    S    S    S    S    S  113  FR4    S    S    S    S    S
图例：第1栏(Kabat)表明根据Kabat等人(1991)的氨基酸残基位置：第2栏(FR或CDR)为容易地确定骨架节段(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR节段(CDR1、CDR2和CDR3)而制，具有3个CDRs分隔的4个FRs：第3栏(小鼠重链7C10)表示小鼠抗体7C10 VH区的氨基酸序列(SEQ ID No.69)：第4栏(胚细胞系4.22 VH IV)表示基因4.22 VH IV的氨基酸序列(Sanz等人，1989)(SEQ ID No.74)：第5栏(人FUR1’CL VH，kabat记录号N020619)表示人源IgMK抗核纤层蛋白B的氨基酸序列(SEQ ID No.73)[lacuna](Mariette等人，1993)：第6、7和8栏(改型的人7C101、2和3)表示改型的人7C10 VH区的氨基酸序列，分别是形式1(SEQ ID No.75)、2(SEQ ID No.79)和3(SEQ ID No.83)。″*″表示如Chothia等人所定义的CDR环正规结构部分(1989)。
实例14.通过装配寡核苷酸构建编码7(210 VL和VH人源化形式1的基因
a)原理
编码人源化可变区的基因(引导肽+VH可变区VDJ或VK可变区VJ)通过在用抗生物素蛋白链菌素包被的磁珠上进行固相装配而合成。由于在两个序列中存在KpnI限制性位点，并且几乎位于基因长度的一半(对于VL和VH基因5’端分别位于200和245号核苷酸)，因此编码人源化7C10 VH(445个碱基对)和人源化7C10VL(433个碱基对)的基因是通过融合两个DNA片段来构建的。融合在一起的两个片段本身通过装配技术组合，包括使用磷酸化寡核苷酸(大约30-35 mer)以在延长期间重叠的方式两两杂交(一个寡聚正义和其它反义，同一性大约为50％)。第一个在5’位置生物素化的寡核苷酸附着在磁珠上，然后逐个加入磷酸化寡核苷酸对。通过T4 DNA连接酶在并列的磷酸化寡核苷酸之间产生磷酸二酯键。
由此重新合成的基因可以直接地克隆(通过用与选择的表达载体相适应的限制性酶消化)或通过PCR扩增以获得更多的物质作为通过酶消化定向克隆的准备。然后，由此通过重新装配构建的基因序列通过DNA自动测序证实。
b)重新装配技术的实验方案
浓度被调节到100μM的在5’位置磷酸化或在5’位置生物素化的寡核苷酸从MWG Biotech定购(见表7用于构建人源化7C10 VL的寡核苷酸序列，和表8用于构建人源化7C10 VH)。寡核苷酸按照表9描述的计划成对杂交(克分子数相等的正义寡聚和反义寡聚混合物，500pmol，在T4 DNA连接酶缓冲液中被加热至95℃5分钟，然后在工作台上使其冷却至室温)。
第一个生物素化的寡核苷酸附着在用抗生物素蛋白链菌素包被的磁珠上(Dyna微珠M-280抗生物素蛋白链菌素，Dynal产品编号112-05)。为此，500pmol的生物素化寡核苷酸的15mM NaCl溶液加入50ul轻轻倒出的微珠中(使用磁容器)，微珠预先用100μl TE 1X缓冲液(Tris-EDTA 100X缓冲液：1M Tris-HCl，pH8，0.1M EDTA，Sigma T-9285)冲洗两次。37℃孵育15min后，用冲洗缓冲液(10mMTris-HCl pH 7.6，10mM EDTA和50mM NaCl)冲洗微珠两次，然后逐个添加杂交的寡聚核苷酸对。在每次新添加寡核苷酸对时，加热混合物至95℃ 5min，然后在工作台上使其冷却至室温。一旦达到室温，加入2μl的10U/l T4 DNA连接酶(Biolabs)，混合物在37℃孵育20min。然后冲洗微珠(冲洗缓冲液)，接着加入后续寡核苷酸对。
最后未配对的寡聚体(反义)以下面的方式装配。5μl寡聚体(500pmol)和43μl T4 DNA连接酶缓冲液加入轻轻倒出的微珠上，然后加热混合物至95℃5min，并在工作台上使其冷却至室温。一旦达到室温，加入2μl的T4 DNA连接酶(Biolabs)，并在37℃孵育混合物20min。然后用冲洗缓冲液冲洗微珠两次，再用TE 1X缓冲液冲洗两次。
然后，在进行基因重新装配的克隆和测序之前，微珠可被4℃保存。
表7：用于通过重新装配构建人源化7C10 VL 1的寡核苷酸DNA序列
引导MluI.生物素    5’-GTCAGAACGCGTGCCGCC                 (SEQ ID No.87)
7C10Lresh.1正义    S’-ACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT   (SEQ ID No.88)
7C10Lresh.2正义    5’-GATGTTCTGGTTTCCTGCTTCCAGCAGTGATG   (SEQ ID No.89)
7C10Lresh.3正义    5’-TTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCC   (SHQ ID No.90)
7C10Lresh.4正义    5’GTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTG    (SEQ ID No.91)
7C10Lresh.5正义    5’-CAGGTCTAGTCAGACCATTATACATAGTAATG   (SEQ ID No.92)
7C10Lresh.6正义    5’-GAAACACCTATTTGGAATGGTACCTGCAGA     (SEQ ID No.93)
7C10Lresh.7反义    5’-GGCAACTTCATGGTGGCGGCACGCGTTCTGAC   (SEQ ID No.94)
7C10Lresh.8反义    5’-GAAACCAGAACATCAGCACCAACAGCCTAACA   (SEQ ID No.95)
7C10Lresh.9反义    5’-CTGAGTCATCACAACATCACTGCTGGAAGCAG   (SEQ ID No.96)
7C10Lresh.10反义   5’-TCTCCAGGGGTGACGGGCAGGGAGAGTGGAGA   (SEQ ID No.97)
7C10Lresh.11反义   5’-TCTGACTAGACCTGCAGGAGATGGAGGCCGGC   (SEQ ID No.98)
7C10Lresh.12反义   5’-AAATAGGTGTTTCCATTACTATGTACAATGC    (SEQ ID No.99)
7C10Lresh.13正义   5’CAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAA    (SEQ ID No.100)
7C10Lresh.14正义   5’-GTTTCTAATCGGCTTTATGGGGTCCCTGACAG   (SEQ LD No.101)
7C10Lresh.15正义   5’GTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTA    (SEQ ID No.102)
7C10Lresh.16正义   5’-CACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGAT   (SEQ ID No.103)
7C10Lresh.17正义   5’-GTTGGGGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACA   (SEQ ID No.104)
7C10Lresh.18正义   5’-TGTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCATIGG  (SEQ ID Nn.105)
7C10Lresh.19正义   5’TGGAAATCAAACGTGAGTGGATCCTCTGCG      (SEQ ID No.106)
7C10Lresh.KpnIREV  5’-TCTGCAGGTACCATTGC                  (SEQ ID No.107)
7C10Lresh.KpnI生物素5’-TGCAATGGTACCTGCAGAAGC             (SEQ ID No.108)
7C10Lresh.20反义    5’-AGACTGCCCTCSGCTTCTGCAGGTACCATTGCA (SEQ ID No.109)
7C10Lresh.21反义    5’-CGATTAGAAACTTTATAGATCAGGAGCTGTGG  (SEQ ID No.110)
7C10Lresh.22反义    5’-TGCCACTGAACCTGTCAGGGACCCCATAAAGC  (SEQ ID No.111)
7C10Lresh.23反义    5’-GATTTTCAGTGTAAAATCTGTGCCTGATCCAC  (SEQ ID No.112)
7C10Lresh.24反义    5’-TAA/kCCCCAACATCCTCAGCCTCCACTCTGCT (SEQ ID No.113)
7C10Lresh.25反义    5’-TCCACGGAACATGTGAACCTTGAiVAGCAGTAA (SEQ ID No.114)
7C10Lresh.26反义    5’-TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAAC   (SEQ ID No.115)
7C10Lresh.BamHI反义 5’-CGCAGAGGATCCACTCACG               (SEQ ID No.116)
表8：用于通过重新装配构建人源化7C10 VH 1的寡核苷酸DNA序列引导MluI.生物素5’-GTCAGAACGCGTGCCGCC    (SEQ ID No.117)
7C10Hresh.1正义5’-ACCA’I’GAAAGTG’f TGAGTCTG’rrGTACCTCTTGfl.(SEQ ID No.118)
7C10Hresh.2正义5’ -CAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTCAGGTGCAGCT   (SEQ ID No.119)
7C10Hresh.3正义5’ -TCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG/JiGCCTTCG  (SEQ ID No.120)
7C10Hresh.4正义5’ -GAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTC’1’CTGGT(SEQ ID No.121)
7C10Hresh.5正义5’ -TACTCCATCACCGGTGGTTATTTATGGKACTGG   (SEQ ID No.122)
7C10Hresh.6正义5’ -ATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGCAGTGG   (SEQ ID No.123)
7C10Hresh.7正义5’ -ATGGGGTATATCAGCTACGACGGTACCAATAAC   (SEQ ID No.124)
7C10Hresh.8反义5’ -TCAACACTTTCATGGTGGCGGCACCCGTTCTGAC  (SEQ ID No.125)
7C10Hresh.9反义5’ -ATACCAGGAATGGCTGTCAAGAGGTACAACAGAC  (SEQ ID No.126)
7C10Hresh.10反义5’-TGGGCCCGACTCCTGAAGCTGCACCTGAGACAGG  (SEQ ID No.127)
7C10Hresh.11反义5’-TGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCACCAGTCC  (SEQ ID No.128)
7C10Hresh.12反义5’-CCACCGGTGATGGAGTAACCAGAGACAGTGCAGG  (SEQ ID No.129)
7C10Hresh.13反义5’-CCCTGGGGGCTGCCGTATCCAGTTCCATJiAATAA (SEQ ID No.130)
7C10Hresh.14反义5’-TAGCTGATATACCCCATCCACTCCAGTCCCTT    (SEQ ID No.131)
7C10Hresh.KpnIREV5’-GTTATTGGTACCGTCG                   (SEQ ID No.132)
7C10Hresh.KpnI生物素5’-TACGACGGTACCAATAACTAC           (SEQ ID No.133)
7C10Hresh.15正义5’-AAACCCTCCCTCAAGGATCGAATCACCATATC    (SEQ ID No.134)
7C10Hresh.16正义5’-ACGTGACACGTCC.IAGAACCAGTTCTCCCTGA   (SEQ ID No.135)
7C10Hresh.17正义5’-AGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACTGCA    (SEQ ID No.136)
7C10Hresh.18正义5’-GTCTATTACTCTGCGAGATACGGTAGGGTCTT    (SEQ ID No.137)
7C10Hresh.19正义5’-CTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA    (SEQ ID No.138)
7C10Hresh.20正义5’-CCGTCTCCTCAGGTGAGTGGATCCTCTGCG      (SEQ ID No.139)
7C10Hresh.21反义5’-AGGGAGGGTTTGTAGTTATTGGTACCGTCGTA    (SEQ ID No.140)
7C10Hresh.22反义5’-JiCGTGTCACGTGATATGGTGATTCGATCCTTG   (SEQ ID No.141)
7C10Hresh.23反义5’-AGAGCTCAGCTTCAGGGAG.AACTGGTTCTTGG   (SEQ ID No.142)
7C10Hresh.24反义5’-CAGTAATACACTGCAGTGTCCGCAGCGGTCAC    (SEQ ID No.143)
7C10Hresh.25反义5’-ACTAGTCAWVGAAGACCCTACCGTATCTCGCA    (SEQ ID No.144)
7C10Hresh.26反义5’-CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCC   (SEQ ID No.145)
7C10Hresh.BamHI反义5’-CGCAGA.GGATCCACTCAC              (SBQ ID No.146)
表9：重新装配人源形式7C10 VH和VL编码基因的寡核苷酸配对方案
重新装配7C10VL人源化1的                    重新装配7C10 VL人源化1的
MlUI-Kpn1片段                              KpnI-BamHI片段
生物素化的寡聚引导子MlUI 7C10 VL           生物素化的寡聚7C10 L KpnI
寡聚对1和7                                      寡聚对13和20
寡聚对2和8                                      寡聚对14和21
寡聚对3和9                                      寡聚对15和22
寡聚对4和10                                     寡聚对16和23
寡聚对5和11                                     寡聚对17和24
寡聚对6和12                                     寡聚对18和25
反义寡聚7C10 VL KpnI                            寡聚对19和26
                                                反义寡聚7C10 L BamHI
重新装配7C10 VL人源化1的M1UI-Kpnl片段           重新装配7C10 VL人源化1的KpnI
生物素化的寡聚引导子M1UI 7C10 VH                生物素化的寡聚7C10 H KpnI
寡聚对1和8                             寡聚对15和21
寡聚对2和9                             寡聚对16和22
寡聚对3和10                            寡聚对17和23
寡聚对4和11                            寡聚对18和24
寡聚对5和12                            寡聚对19和25
寡聚对6和13                            寡聚对20和26
寡聚对7和14                            反义寡聚7C10 VH BamHI
反义寡聚7C10 VH Kpnl
实例15通过定向诱变构建编码7C10 VL和7C10VH人源化形式2以及7C10VH人源化形式3的基因
7C10 VH的人源化形式2是通过对人源化形式1的48和67残基(按照Kabat’s命名法)进行定向诱变获得的。此定向诱变是在QuikChangeTM系统Stratagene位点-定向诱变(试剂盒#200518)的帮助下，按照厂商描述的方法实施的。构建分两个阶段进行，首先，形式1上的残基48在7C10H人源化1QCM48正义和反义引物对(见表10)的帮助下突变，随后，这个在48位残基上突变的形式在7C10H人源化1QCI67正义和反义(见表10)引物对的帮助下自身在67位残基上突变。
同样采用QuikChangeTM系统，通过对人源化形式2的30和71残基(按照Kabat’s命名法)进行位点定向的突变获得7C10 VH的人源化形式3。此构建分两个阶段进行。首先，形式2上的残基30在7C10H人源化QCT30正义和反义引物(见表10)的帮助下进行突变。随后，这个在残基30上突变的形式通过使用7C10H人源化1V67QCR71正义和反义引物对(见表10)在残基71自身突变。
7C10 VL人源化形式2通过采用QuikChangeTM系统对形式1的残基2(按照Kabat’s命名法)进行位点定向突变而获得。形式1上的残基2是通过使用7C10L人源化1QCV2正义和反义(见表10)引物对而突变的。
表10通过stratagene QuikChangeTM系统进行定向诱变所使用的寡核苷酸列表7C10H人源化1QCT30.正义5′-CTCCTTACTCCATCAGCGGTGGTTATTTATG(SEQ ID No.147)7C10H人源化1QCT30.正义5′-CATAAATAACCACCGCTGATGGAGTAACCAG(SEQ ID No.148)7C10H人源化1QCM48.正义5′-GGGACTGGAGTGGATCGGGTATATCAGCTAC(SEQ ID No.149)7C10H人源化1QCM48.反义5′-GTAGCTGATATACCCGATCCACTCCAGTCCC(SEQ ID No.150)7C10H人源化1QCI67.正义5′-TCCCTCAAGGATCGAGTCACCATATCACGTG(SEQ ID No.151)7C10H人源化1QCI67.反义5′-CACGTGATATGGTGACTCGATCCTTGAGGGA(SEQ ID No.152)7C10H人源化1V67QCR71.正义5′-GATCCAGTCACCATATCAGTGGACACGTCCAAGAACCAG(SEQ ID No.153)7C10H人源化1V67QCR71.反义5′-CTGGTTCTTGGACGTGTCCACTGATATGGTGACTC GATC(SEQ ID No.154)7C10I人源化1QCV2.正义5′-GCTTCCAGCAGTGATATTGTGATGACTCAGT(SEQ ID No.155)7C10I人源化1QCV2.反义5′-ACTGAGTCAGCACAATATCACTGCTGGAAGC(SEQ ID No.156)
实例16.电穿孔转染cos7细胞
含有嵌合或抗体7C10人源形式的轻、重链的哺乳动物表达载体在cos7细胞里做了重组7C10抗体瞬时表达的测试。DNA借助BioRad仪器(Gene Pulsar)经电穿孔导入cos细胞。载体DNA(每个载体10μg)加入0.8ml浓度为1×107/ml悬浮于PBS缓冲液的cos细胞(无Ca++和Mg++)，加载1900伏特和25微法的脉冲。转染的cos细胞随后加到8ml含5％小牛血清的DMEM培养液中37℃孵育72小时。收集上清，离心去除细胞碎片，最后用ELISA检测重组IgG1/人K型抗体7C10的浓度。
实例17.检测cos转染子培养上清中重组IgG1/人κ型抗体浓度的ELISA方法
cos7细胞瞬时表达的培养上清需经7C10 IgG1/人K型抗体的检测。为检测IgG1/人K型免疫球蛋白，用山羊抗人IgG的多克隆抗体(特异性针对γ球蛋白的Fc段，Jackson Immuno-Research Laboratories Inc.，#109-005-098)包被96孔ELISA板(Maxisorb，Nunc)。cos细胞培养上清做系列稀释后加入包被的孔板。37℃孵育1小时后洗涤，加入过氧化物酶标记的山羊抗人κ型轻链的多克隆抗体(HRP，Sigma，A-7164)。37℃孵育45分钟，洗涤，加TMB底物(KPL#50-76-04)。孵育10分钟，加1M硫酸终止反应，在450nm处读取光密度值。用已知浓度的纯化的人IgG1/人K型免疫球蛋白(Sigma，1-3889)作为标准参照抗体。
实例18.测定7C10的人IgG1/κ型重组抗体识别IGF-1受体(IGF-IR)活性的ELISA方法
用一种ELISA方法测定cos7培养上清识别IGF-1R的能力。96孔ELISA板(Dynex Immulon 2HB)用浓度为0.31ng/ul的IGF-1R(人胰岛素样生长因子I的可溶性受体，R&D Systems，#391-GR)PBS溶液包被，100ul/孔，4℃孵育过夜。用含0.05％Tween20的PBS洗板，加含0.5％明胶的PBS溶液封闭，37℃孵育1小时。PBS洗涤三次，然后将预先用含0.1％明胶和0.05％Tween20的PBS预先系列稀释的待测cos细胞培养上清样品加入板中。37℃孵育1小时，随后洗三次(PBS中含0.05％Tween 20)，再加过氧化物酶(HRP，Jackson Immune-Research LaboratoriesInc.，#109-035-098)标记的抗-人IgG抗体(特异性针对Fc段，用含0.1％明胶和0.05％Tween 20的PBS按1∶5000稀释)。37℃孵育45分钟，PBS洗涤三次(含0.05％Tween 20)，加TMB底物(KPL#50-76-04)。孵育10分钟，加1M硫酸终止反应，在450nm处读取光密度值。
实例19测定经“CDR嫁接”不同形式人源化7C10抗体的对IGF1-R的识别活性
起先，我们比较了嵌合的7C10轻、重链人源化样式1抗体对IGF-1受体的识别活性。图28显示了ELISA法测定cos7细胞培养上清识别IGF-1R(见实例18)活性的结果，其中的IgG1/人K型抗体浓度(见实例17)已经ELISA定量。经测试的四种重组抗体其滴定曲线重叠得非常完美，表明它们对IGF-IR的相对亲和力很相似、接近。由此可以得出结论：由组成人源化轻链1(框架区内有一个鼠源的氨基酸残基)和人源化重链1(框架区内有四个鼠源的氨基酸残基)的7C10人源化形式1特异地识别IGF-1受体，且其亲和力非常类似于由鼠可变区构成的嵌合抗体。
随后，我们考察了7C10的人源化轻链(人源化形式1对人源化形式2，见图19)第2位氨基酸残基(按照Kabat的命名)对IGF-IR识别功能的影响。图29显示了ELISA法测定cos7细胞培养上清识别IGF-1R(见实例18)活性的结果，其中的IgG1/人K型抗体浓度(见实例17)已经ELISA定量。两种轻链的人源化形式1和2都成功地与人源化7C10 VH1相结合。两条滴定曲线相互重叠，表明轻链第2位氨基酸残基的人源化突变(形式1突变为缬氨酸，形式2突变为异亮氨酸)显然没有对识别IGF1受体的相对亲和力产生任何影响。7C10轻链人源化形式2除CDR以外没有任何鼠的成分(即完全的人源化)，是我们倾向的7C10 VL改造结果。
我们对完全人源化的7C10轻链(人源化形式2，见上)以及三种人源化的7C10重链都做了测试。图30显示了ELISA法测定cos7细胞培养上清识别IGF-1R活性的结果，其中的IgG1/人K型抗体浓度(见实例17)已经ELISA定量。滴定曲线非常相似，事实上与相应嵌合抗体的标准参照曲线重叠，表明当和人源化的7C10 VL2连接后，7C10 VH人源化的三种形式1、2和3对IGF-1R有完全一样的相对亲和力。尽管如此，其他ELISA平行测试的结果(未给出)却显示71位(Kabat的命名)从精氨酸(鼠)到缬氨酸(人)的点突变与相应抗体对IGF-1R亲和力的轻微损失有关系，因此，有理由认为人源化的7C10 VH 2和7C10 VH 1对IGF-1R的相对亲和力是一样的。相比于人源化形式1，形式2更可取，因为它仅有2个鼠氨基酸(30和71位，见图24)。形式3同样可取，因为它除了CDR以外没有任何鼠的成分，而且亲和力的损失似乎也及其微小。
总之，根据本发明看起来有两种改造的人源化7C10抗体特别可取：一种由人源化7C10 VH 2(2个保守的鼠氨基酸残基)和人源化7C10 VL 2(无保守的鼠氨基酸残基)连接后组成，另一种由人源化7C10 VH 3(无保守的鼠氨基酸残基)和人源化7C10 VL 2(无保守的鼠氨基酸残基)连接后组成。最后这种形式是同时在轻链、重链中都没有鼠氨基酸残基出现的最后的人源化形式。
实例20.EGFR和IGF-IR在A549细胞表面的表达
我们在荷非小细胞肺肿瘤裸鼠(经皮下注射肺癌细胞系A549建立)身上同时使用分别针对IGF-IR和EGFR的两种单抗研究了它们的协同作用。
首先，为确保A549细胞在注射小鼠之前在细胞表面同时表达了IGF-IR和EGFR两种受体，我们分别用鼠7C10抗-IGF-IR单抗(图37B)和鼠225抗-EGFR单抗(图37D)标记A549细胞，然后行流式细胞术计数。为此，A549细胞用含10％胎牛血清的PBS溶液4℃封闭30分钟，洗涤后和目标抗体4℃孵育30分钟，然后再洗三遍，加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记抗鼠二抗，孵育30分钟，最后在FACS(荧光活化的细胞分选仪)上读取520nm(激发波长488nm)计数。
结果如图37A～37D所示：A549细胞表面EGF受体和IGF1受体数目相当，分布均一。抗体标记的特异性经同种型抗体对照所证实(图37C)。这些结果证实A549可作为细胞模型用于IGF-IR和EGFR两种受体相互协同、协作的研究。
实例21.共用抗-IGF-IR和抗-EGFR单克隆抗体在裸鼠体内抗肿瘤治疗的协同作用
裸鼠皮下移植5.106A549细胞。5天后测量肿瘤大小，肿瘤体积均一的裸鼠组成一批。从这一批裸鼠开始，每6只裸鼠随机产生一组。每只裸鼠将接受每周两次腹腔内单独注射7C10或225单抗的治疗，或者同时注射两种单抗，总剂量均为250μg/鼠。单抗9G4作为实验的同型对照。
图38结果显示，单独注射抗体7C10或225能显著减缓肿瘤的生长。需要注意的是，这两种单抗对抗肿瘤的能力基本相当。同时使用两种单抗时可见明显的协同作用(每次做动力学t检验时p≤0.01)，这与以往文献报道不同，提示这两种受体在体内存在着协作，最适于肿瘤的生长；而且，阻断一种受体的作用并不能完全抑制另一个受体介导的肿瘤生长，这也与以往文献报道不同。
实例22.共用鼠单抗7C10和225在同位种植A549细胞的裸鼠中的抗肿瘤活性研究
用同位模型评价抗肿瘤活性对于研究肿瘤扩散的过程有特殊的重要性。为了评估分别针对IGF-IR和EGFR的抗体混合物的抗肿瘤活性，106A549细胞(非小细胞肺癌)种植于裸鼠胸腔内。注意，这种肿瘤细胞种植的后果和在人体上观察到的扩散过程是非常相似的，并能导致动物的死亡。图39显示单用抗体225和7C10可见存活率明显提高，两者效能彼此相当；令人惊讶的是，同时使用这两种抗体裸鼠存活率有相当程度的提高，提示这样的处理对肿瘤细胞的扩散有影响。
实例23.7C10和7H2HM抑制IGF-IR和IRS-Iβ链中酪氨酸的磷酸化
MCF7细胞在20ml RPMI培养基中培养24小时，细胞密度5×104细胞/cm2(75cm2平板，COSTAR)，培养基中无酚红，但含5mM谷氨酰胺，青霉素/链霉素(浓度分别是100U/100μg/ml)，以及10％胎牛血清。PBS洗涤三次，细胞在RPMI培养基中培养12小时，此时培养基不含酚红、胎牛血清，但仍含有5mM谷氨酰胺，青/链霉素，0.5μg/ml牛血清白蛋白(Sigma A-8022)和5μg/ml转铁蛋白(SigmaT8158)。
为了激活，细胞先用封闭抗体(10μg/ml)37℃孵育2分钟，然后加入IGF-I(Sigma I3769，50ng/ml)额外孵育2分钟。随着吸出孵育培养基终止活化反应，并将平板置于冰上，然后给细胞加入0.5ml裂解缓冲液((50mM tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，1％Nonidet P40，0.5％脱氧胆酸钠，)再混合蛋白酶抑制剂(每50ml1片，Boehringer Ref.：1697 498)和磷酸酶抑制剂(Calbiochem Ref.：524625(1/100))进行裂解。刮下细胞，重获悬液，置于振荡器上4℃振荡1.5小时。溶液经4℃ 12000rpm离心10分钟，上清中的蛋白浓度由BCA试剂进行定量。
500μg细胞裂解物蛋白与抗-IGF-IR(Santa Cruz Ref.：sc-713)混合进行免疫沉淀，振荡器上4℃孵育1.5小时。加入蛋白A-琼脂糖(Boehringer Ref.：1 134515)收获免疫沉淀物，4℃振荡器上孵育过夜。IRS-1的免疫沉淀则用的是抗-IRS-1抗体偶联的琼脂糖微珠(Santa Cruz Ref.：559Ac)。琼脂糖微珠用1ml裂解缓冲液洗两次，用洗涤缓冲液1(50mM tris-HCl pH 7.5；500mM NaCl；0.1％Nonidet P40；0.05％脱氧胆酸钠(Boehringer 1 332 597)，加有蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂)洗两次，用洗涤缓冲液2(50mM tris-HCl；0.1％Nonidet P40；0.05％脱氧胆酸钠(Boehringer Ref.：1 332 597)，加有1∶100蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)洗一次。免疫沉淀物重悬于Laemmli缓冲液，加热至100℃5分钟。上清进行聚丙烯酰胺SDS凝胶(8％Novex EC6015)电泳分析。蛋白转移至硝酸纤维素膜上进行免疫印迹：用HRP标记的抗-磷酸化酪氨酸抗体(UpstateBiotechnology 4G10)，或者抗-IGF-IR或抗-IRS-1β链(Santa Cruz Ref.：sc 8038)，然后是HRP标记的抗-兔抗体。印迹采用化学发光(Amersham RPN2209)，Kodak X-mat AR胶片上放射自显影。
图40A描述的是MCF7细胞未经刺激(0)，单独经IGF-1(50ng/ml)(0+IGF-1)刺激，或者结合了单抗或人源化抗-IGF-IR抗体(10μg/ml)7C10，1H7，7H2HM。抗体9G4或hIgG1被用作阴性对照的鼠或人同种型免疫球蛋白IgG1。IGF-IR的β链经免疫沉淀后用磷酸化的抗-酪氨酸抗体进行印迹。结果显示单抗或人源化的抗-IGF-IR抗体7C10，1H7和7H2HM抗体抑制了IGF-IRβ链中酪氨酸的磷酸化。
图40B描述的是MCF7细胞未经刺激(0)，单独经IGF-1(50ng/ml)(0+IGF-1)刺激，或者结合了单抗或人源化抗-IGF-IR抗体(10μg/ml)7C10，1H7，7H2HM。抗体9G4或hIgG1被用作阴性对照的鼠或人同种型免疫球蛋白IgG1。IRS-1经免疫沉淀后用磷酸化的抗酪氨酸抗体进行印迹。结果显示单抗7C10，7H2HM和1H7抑制了IRS-1中酪氨酸的磷酸化。
实例24.7C10和7H2HM引发IGF-IR的内化
MCF7和A549细胞用10％胎牛血清PBS(FACS缓冲液)悬浮至1.107细胞/ml。1.106细胞和10μg/ml单抗(7C10，7G3，9G4)或20μg/ml 7H2HM 37℃孵育30分钟。洗涤后，细胞被生物素化的抗-IGF-IR抗体(单抗12B1)标记(4℃ 30分钟)，然后是和链亲合素-488 alexa Fluor结合物4℃孵育30分钟。最后，去除了细胞碎片的细胞经FACScan(Becton-Dickinson，Enembogegem，Belgium)用Cellquest软件进行分析。
图41显示A549细胞无染色(第一个峰)，和7C10或7H2HM孵育后(第二个峰)，以及和无关小鼠或大鼠IgG1孵育后(第三个峰)。当细胞经7C10或7H2HM孵育处理后，可见细胞表面IGF-IR表达的减少。
实例25.7C10和7H2HM诱发IGF-IR的降解
MCF-7细胞在15ml完全培养基培养24小时至10.104细胞/cm2(75cm2，Costar)，细胞用PBS洗三次，接着用无血清培养基孵育12小时。然后，细胞单独用25μg/ml放线菌酮孵育，或者和10μg/ml单抗7C10、9G4、7G3，或者IGF-I(50ng/ml)孵育。在某些实验中，细胞在和单抗孵育前需经MG-132(10uM，Calbiochem 474791)37℃处理1小时以抑制蛋白酶体的活性。孵育后洗涤，然后加裂解缓冲液裂解细胞。20μg蛋白经8％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，再转移至硝酸纤维素膜上进行上述的IGF-IR的抗β链免疫印迹实验。
经由Western印迹所作的IGF-IR完整性分析(图42A)显示7C10和7H2HM诱发了受体的降解，而受体的天然配体并没有引起后者的降解。作为同种型抗体的对照，无关抗体9G4也没有引起受体的降解。图42B显示受体降解被一个蛋白酶体抑制剂MG132(孵育2小时)所抑制。
用人源化抗体7H2HM也获得了大体相当的实验结果(图42C)。
序列表
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aga tct agt cag agc att gta cat agt aat gga aac acc tat tta caa    48
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln
  1               5                  10                  15
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Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr
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<212>PRT
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Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr
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ttt caa ggt tca cat gtt ccg tgg acg                            27
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
  1               5
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Gly Gly Tyr Leu Trp Asn
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Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp
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tac ggt agg gtc ttc ttt gac tac                                    24
Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr
  1               5
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Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr
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atggctgtcy trgsgctrct cttctg                                       26
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atggratgga gckggrtctt tmtctt                                       26
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Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
  1               5                  10
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<212>PRT
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Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
  1               5                  10
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Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
  1               5                  10
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<212>PRT
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Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
  1               5                  10
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<212>DNA
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<220>
<221>CDS
<222>(28)..(393)
<400>48
atgaagttgc ctgttaggct gttggtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc aga  54
                              Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg
                                1               5
agt gat gtt ttg atg acc caa att cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt    102
Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu
 10                  15                 20                   25
gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat    150
Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His
                 30                  35                  40
agt aat gga aac acc tat tta caa tgg tac ctg cag aaa cca ggt cag    198
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
             45                  50                  55
tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ctt tat ggg gtc    246
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val
         60                  65                  70
cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag    294
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
     75                  80                  85
atc agc agc gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa    342
Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln
 90                  95                 100                 105
ggt tca cat gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc    390
Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu I1e
            110                 115                 120
aaa cgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca gt             438
Lys
<210>49
<211>122
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>49
Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln
  1               5                  10                  15
Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
             20                  25                  30
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
         35                  40                  45
Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
     50                  55                  60
Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
 65                  70                  75                  80
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
                 85                  90                  95
Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        115                 120
<210>50
<211>438
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>50
tacttcaacg gacaatccga caaccacgac tacaagacct aaggacgaag gtcttcacta  60
caaaactact gggtttaagg tgagagggac ggacagtcag aacctctagt tcggaggtag  120
agaacgtcta gatcagtctc gtaacatgta tcattacctt tgtggataaa tgttaccatg  180
gacgtctttg gtccagtcag aggtttcgag gactagatgt ttcaaaggtt ggctgaaata  240
ccccagggtc tgtccaagtc accgtcacct agtccctgtc taaagtgtga gttctagtcg  300
tcgcacctcc gactcctaga ccctcaaata atgacgaaag ttccaagtgt acaaggcacc  360
tgcaagccac ctccgtggtt cgacctttag tttgcccgac tacgacgtgg ttgacatagg  420
tagaagggtg gtaggtca                                                438
<210>51
<211>438
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>CDS
<222>(25)..(405)
<400>51
atgatggtgt taagtcttct gtac ctc ttg aca gcc att cct ggt atc ctg     51
                           Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile Leu
                             1               5
tct gat gta cag ctt cag gag tca gga cct ggc ctc gtg aaa cct tct    99
Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
 10                  15                  20                  25
cag tct ctg tct ctc acc tgc tct gtc acc ggc tac tcc atc acc ggt    147
Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly
                 30                  35                 40
ggt tat tta tgg aac tgg atc cgg cag ttt cca gga aac aaa ctg gag    195
Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu
             45                  50                  55
tgg atg ggc tac ata agc tac gac ggt acc aat aac tac aaa cca tct    243
Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser
         60                  65                  70
ctc aaa gat cga atc tcc atc act cgt gac aca tct aag aac cag ttt    291
Leu Lys Asp Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
     75                  80                  85
ttc ctg aag ttg aat tct gtg act aat gaa gac aca gct aca tat tac    339
Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
 90                  95                 100                 105
tgt gca aga tac ggt agg gtc ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc    387
Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
                110                 115                 120
act ctc aca gtc tcc tca gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctg       438
Thr Leu Thr Val Ser Ser
            125
<210>52
<211>127
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>52
Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu
  1               5                  10                  15
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys
             20                  25                  30
Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile
         35                  40                  45
Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr
     50                  55                  60
Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Ile Ser Ile
 65                  70                  75                  80
Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val
                 85                  90                  95
Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115             120                     125
<210>53
<211>438
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>53
tactaccaca attcagaaga catggacaac tgtcggtaag gaccatagga cagactacat  60
gtcgaagtcc tcagtcctgg accggagcac tttggaagag tcagagacag agagtggacg  120
agacagtggc cgatgaggta gtggccacca ataaatacct tgacctaggc cgtcaaaggt  180
cctttgtttg acctcaccta cccgatgtat tcgatgctgc catggttatt gatgtttggt  240
agagagtttc tagcttagag gtagtgagca ctgtgtagat tcttggtcaa aaaggacttc  300
aacttaagac actgattact tctgtgtcga tgtataatga cacgttctat gccatcccag  360
aagaaactga tgaccccggt tccgtggtga gagtgtcaga ggagtcggtt ttgctgtggg  420
ggtagacaga taggtgac                                                438
<210>54
<211>112
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>54
Asp Val Leu Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                 85                  90                  95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>55
<211>112
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>55
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                   70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                 85                  90                  95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
            100                 105                 110
<210>56
<211>112
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>56
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                 85                  90                  95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>57
<211>112
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>57
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
  1               5               10                     15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
             20              25                      30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35              40                      45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
     50              55                      60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                 85                  90                  95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>58
<211>112
<212>PRT
<213>类人
<400>58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                 85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>59
<211>100
<212>PRT
<213>类人
<400>59
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Prc Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
            85             90                  95
Leu Gln Thr Pro
            100
<210>60
<211>112
<212>PRT
<213>类人
<220>
<221>变体
<222>(35)..(36)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<221>变体
<222>(39)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<221>变体
<222>(99)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
             20                  25                  30
Asp Gly Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                 85                  90                  95
Leu Gln Xaa Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>61
<211>112
<212>PRT
<213>类人
<400>61
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                 85                  90                  95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>62
<211>433
<212>DNA
<213>类人
<220>
<221>CDS
<222>(22)..(414)
<400>62
gtcagaacgc gtgccgccac c atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg    51
                        Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu
                          1               5                  10
atg ttc tgg ttt cct gct tcc agc agt gat gtt gtg atg act cag tct    99
Met Phe Trp Phe Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
                 15                  20                  25
cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc    147
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
             30                  35                  40
agg tct agt cag agc att gta cat agt aat gga aac acc tat ttg caa    195
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln
         45                  50                  55
tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct cca cag ctc ctg atc tat aaa    243
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys
     60                  65                  70
gtt tct aat cgg ctt tat ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga    291
Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
 75                  80                  85                  90
tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat    339
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
                 95                 100                 105
gtt ggg gtt tat tac tgc ttt caa ggt tca cat gtt ccg tgg acg ttc    387
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe
            110                 115                 120
ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt gagtggatcc tctgcg          433
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
       125                    130
<210>63
<211>131
<212>PRT
<213>类人
<400>63
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Phe Pro Ala
  1               5                  10                  15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
             20                  25                  30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
         35                  40                  45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
     50                  55                  60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                 85                  90                  95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
        115                 120                 125
Glu Ile Lys
    130
<210>64
<211>433
<212>DNA
<213>类人
<400>64
cagtcttgcg cacggcggtg gtacttcaac ggacaatccg acaaccacga ctacaagacc  60
aaaggacgaa ggtcgtcact acaacactac tgagtcagag gtgagaggga cgggcagtgg  120
ggacctctcg gccggaggta gaggacgtcc agatcagtct cgtaacatgt atcattacct  180
ttgtggataa acgttaccat ggacgtcttc ggtcccgtca gaggtgtcga ggactagata  240
tttcaaagat tagccgaaat accccaggga ctgtccaagt caccgtcacc tagtccgtgt  300
ctaaaatgtg acttttagtc gtctcacctc cgactcctac aaccccaaat aatgacgaaa  360
gttccaagtg tacaaggcac ctgcaagccg gttccctggt tccaccttta gtttgcactc  420
acctaggaga cgc                                                     433
<210>65
<211>112
<212>PRT
<213>类人
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>65
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                 85                  90                  95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>66
<211>433
<212>DNA
<213>类人
<220>
<221>CDS
<222>(22)..(414)
<400>66
gtcagaacgc gtgccgccac c atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg    51
                        Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu
                          1               5                  10
atg ttc tgg ttt cct gct tcc agc agt gat att gtg atg act cag tct    99
Met Phe Trp Phe Pro Ala Ser Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser
                 15                  20                  25
cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc    147
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
             30                  35                  40
agg tct agt cag agc att gta cat agt aat gga aac acc tat ttg caa    195
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln
         45                  50                  55
tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct cca cag ctc ctg atc tat aaa    243
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys
     60                  65                  70
gtt tct aat cgg ctt tat ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga    291
Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
 75                  80                  85                  90
tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat    339
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
                 95                 100                 105
gtt ggg gtt tat tac tgc ttt caa ggt tca cat gtt ccg tgg acg ttc    387
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe
            110                 115                 120
ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt gagtggatcc tctgcg          433
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
        125                 130
<210>67
<211>131
<212>PRT
<213>类人
<400>67
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Phe Pro Ala
  1               5                  10                  15
Ser Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
             20                  25                  30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
         35                  40                  45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
     50                  55                  60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr
65                   70                  75                  80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                 85                  90                  95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
        115                 120                 125
Glu Ile Lys
    130
<210>68
<211>433
<212>DNA
<213>类人
<400>68
cagtcttgcg cacggcggtg gtacttcaac ggacaatccg acaaccacga ctacaagacc  60
aaaggacgaa ggtcgtcact acaacactac tgagtcagag gtgagaggga cgggcagtgg  120
ggacctctcg gccggaggta gaggacgtcc agatcagtct cgtaacatgt atcattacct  180
ttgtggataa acgttaccat ggacgtcttc ggtcccgtca gaggtgtcga ggactagata  240
tttcaaagat tagccgaaat accccaggga ctgtccaagt caccgtcacc tagtccgtgt  300
ctaaaatgtg acttttagtc gtctcacctc cgactcctac aaccccaaat aatgacgaaa  360
gttccaagtg tacaaggcac ctgcaagccg gttccctggt tccaccttta gtttgcactc  420
acctaggaga cgc                                                     433
<210>69
<211>117
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>69
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
  1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly
             20                  25                  30
Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Asp Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
 65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>70
<211>118
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>70
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
  1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
             20                  25                  30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
 65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Tyr Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>71
<211>118
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>71
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
             20                  25                  30
Tyr Trp Asn Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Phe
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>72
<211>117
<212>PRT
<213>类人
<400>72
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Trp Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                  40                 45
Ile Gly Arg Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Xaa Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
 65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Glu Leu Pro Gly Gly Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>73
<211>123
<212>PRT
<213>类人
<400>73
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
             20                  25                  30
Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Ile Gly Ser Met Phe His Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gly Arg Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Asn Trp Phe Asp Pro
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>74
<211>98
<212>PRT
<213>类人
<400>74
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
             20                  25                  30
Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
 65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg
<210>75
<211>117
<212>PRT
<213>类人
<400>75
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly
             20                  25                  30
Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Asp Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
 65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>76
<211>445
<212>DNA
<213>类人
<220>
<221>CDS
<222>(22)..(426)
<400>76
gtcagaacgc gtgccgccac c atg aaa gtg ttg agt ctg ttg tac ctc ttg    51
                        Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu
                          1               5                  10
aca gcc att cct ggt atc ctg tct cag gtg cag ctt cag gag tcg ggc    99
Thr Ala Ile Pro Gly Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
                 15                  20                  25
cca gga ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc    147
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
             30                  35                  40
tct ggt tac tcc atc acc ggt ggt tat tta tgg aac tgg ata cgg cag    195
Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln
         45                  50                  55
ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg atg ggg tat atc agc tac gac ggt    243
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly
     60                  65                  70
acc aat aac tac aaa ccc tcc ctc aag gat cga atc acc ata tca cgt    291
Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Ile Thr Ile Ser Arg
 75                  80                  85                  90
gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gct    339
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
                 95                 100                 105
gcg gac act gca gtg tat tac tgt gcg aga tac ggt agg gtc ttc ttt    387
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe
            110                 115                 120
gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca ggtgagtgga     436
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        125                 130
tcctctgcg                                                          445
<210>77
<211>135
<212>PRT
<213>类人
<400>77
Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile
  1               5                 10                   15
Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
             20                  25                  30
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
         35                  40                 45
Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
     50                  55                 60
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro
 65                  70                 75                   80
Ser Leu Lys Asp Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
                 85                  90                  95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    130
<210>78
<211>445
<212>DNA
<213>类人
<400>78
cagtcttgcg cacggcggtg gtactttcac aactcagaca acatggagaa ctgtcggtaa  60
ggaccatagg acagagtcca cgtcgaagtc ctcagcccgg gtcctgacca cttcggaagc  120
ctctgggaca gggagtggac gtgacagaga ccaatgaggt agtggccacc aataaatacc  180
ttgacctatg ccgtcggggg tcccttccct gacctcacct accccatata gtcgatgctg  240
ccatggttat tgatgtttgg gagggagttc ctagcttagt ggtatagtgc actgtgcagg  300
ttcttggtca agagggactt cgactcgaga cactggcgac gcctgtgacg tcacataatg  360
acacgctcta tgccatccca gaagaaactg atgaccccgg tcccttggga ccagtggcag  420
aggagtccac tcacctagga gacgc                                        445
<210>79
<211>117
<212>PRT
<213>类人
<400>79
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly
             20                  25                  30
Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
 65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                105                  110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>80
<211>445
<212>DNA
<213>类人
<220>
<221>CDS
<222>(22)..(426)
<400>80
gtcagaacgc gtgccgccac c atg aaa gtg ttg agt ctg ttg tac ctc ttg    51
                        Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu
                          1               5                  10
aca gcc att cct ggt atc ctg tct cag gtg cag ctt cag gag tcg ggc    99
Thr Ala Ile Pro Gly Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
                 15                  20                  25
cca gga ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc    147
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
             30                  35                  40
tct ggt tac tcc atc acc ggt ggt tat tta tgg aac tgg ata cgg cag    195
Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln
         45                  50                  55
ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg atc ggg tat atc agc tac gac ggt    243
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly
     60                  65                  70
acc aat aac tac aaa ccc tcc ctc aag gat cga gtc acc ata tca cgt    291
Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg
 75                  80                  85                  90
gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gct    339
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
                 95                 100                 105
gcg gac act gca gtg tat tac tgt gcg aga tac ggt agg gtc ttc ttt    387
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe
            110                 115                 120
gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca ggtgagtgga     436
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        125                 130
tcctctgcg                                                          445
<210>81
<211>135
<212>PRT
<213>类人
<400>81
Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile
  1               5                  10                  15
Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
             20                  25                  30
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
         35                  40                  45
Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
    50                   55                  60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro
 65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
                 85                  90                  95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    130
<210>82
<211>445
<212>DNA
<213>类人
<400>82
cagtcttgcg cacggcggtg gtactttcac aactcagaca acatggagaa ctgtcggtaa  60
ggaccatagg acagagtcca cgtcgaagtc ctcagcccgg gtcctgacca cttcggaagc  120
ctctgggaca gggagtggac gtgacagaga ccaatgaggt agtcgccacc aataaatacc  180
ttgacctatg ccgtcggggg tcccttccct gacctcacct agcccatata gtcgatgctg  240
ccatggttat tgatgtttgg gagggagttc ctagctcagt ggtatagtgc actgtgcagg  300
ttcttggtca agagggactt cgactcgaga cactggcgac gcctgtgacg tcacataatg  360
acacgctcta tgccatccca gaagaaactg atgaccccgg tcccttggga ccagtggcag  420
aggagtccac tcacctagga gacgc                                        445
<210>83
<211>117
<212>PRT
<213>类人
<400>83
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Gly Gly
             20                  25                  30
Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
 65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>84
<211>445
<212>DNA
<213>类人
<220>
<221>CDS
<222>(22)..(426)
<400>84
gtcagaacgc gtgccgccac c atg aaa gtg ttg agt ctg ttg tac ctc ttg    51
                        Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu
                          1               5                  10
aca gcc att cct ggt atc ctg tct cag gtg cag ctt cag gag tcg ggc    99
Thr Ala Ile Pro Gly Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
                 15                  20                  25
cca gga ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc    147
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
             30                  35                  40
tct ggt tac tcc atc agc ggt ggt tat tta tgg aac tgg ata cgg cag    195
Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln
         45                  50                  55
ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg atc ggg tat atc agc tac gac ggt    243
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly
     60                  65                  70
acc aat aac tac aaa ccc tcc ctc aag gat cga gtc acc ata tca gtg    291
Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Val
 75                  80                  85                  90
gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gct    339
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
                 95                 100                 105
gcg gac act gca gtg tat tac tgt gcg aga tac ggt agg gtc ttc ttt    387
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe
            110                 115                 120
gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca ggtgagtgga     436
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        125                 130
tcctctgcg                                                          445
<210>85
<211>135
<212>PRT
<213>类人
<400>85
Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile
  1               5                  10                  15
Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
             20                  25                  30
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser
         35                  40                  45
Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro
 65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
                 85                  90                  95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    130
<210>86
<211>445
<212>DNA
<213>类人
<400>86
cagtcttgcg cacggcggtg gtactttcac aactcagaca acatggagaa ctgtcggtaa  60
ggaccatagg acagagtcca cgtcgaagtc ctcagcccgg gtcctgacca cttcggaagc  120
ctctgggaca gggagtggac gtgacagaga ccaatgaggt agtcgccacc aataaatacc  180
ttgacctatg ccgtcggggg tcccttccct gacctcacct agcccatata gtcgatgctg  240
ccatggttat tgatgtttgg gagggagttc ctagctcagt ggtatagtca cctgtgcagg  300
ttcttggtca agagggactt cgactcgaga cactggcgac gcctgtgacg tcacataatg  360
acacgctcta tgccatccca gaagaaactg atgaccccgg tcccttggga ccagtggcag  420
aggagtccac tcacctagga gacgc                                        445
<210>87
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
    寡核苷酸
<400>87
gtcagaacgc gtgccgcc                                                18
<210>88
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
寡核苷酸
<400>88
accatgaagt tgcctgttag gctgttggtg ct                                32
<210>89
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>89
gatgttctgg tttcctgctt ccagcagtga tg                                32
<210>90
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>90
ttgtgatgac tcagtctcca ctctccctgc cc                                32
<210>91
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>91
gtcacccctg gagagccggc ctccatctcc tg                                32
<210>92
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>92
caggtctagt cagaccatta tacatagtaa tg                                32
<210>93
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>93
gaaacaccta tttggaatgg tacctgcaga                                   30
<210>94
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>94
ggcaacttca tggtggcggc acgcgttctg ac                                32
<210>95
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>95
gaaaccagaa catcagcacc aacagcctaa ca                                32
<210>96
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>96
ctgagtcatc acaacatcac tgctggaagc ag                                32
<210>97
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>97
tctccagggg tgacgggcag ggagagtgga ga                                32
<210>98
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>98
tctgactaga cctgcaggag atggaggccg gc                                32
<210>99
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>99
aaataggtgt ttccattact atgtacaatg c                                 31
<210>100
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>100
cagggcagtc tccacagctc ctgatctata aa                                32
<210>101
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>101
gtttctaatc ggctttatgg ggtccctgac ag                                32
<210>102
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
寡核苷酸
<400>102
gttcagtggc agtggatcag gcacagattt ta                                32
<210>103
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>103
cactgaaaat cagcagagtg gaggctgagg at                                32
<210>104
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>104
gttggggttt attactgctt tcaaggttca ca                                32
<210>105
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>105
tgttccgtgg acgttcggcc aagggaccaa gg                                32
<210>106
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>106
tggaaatcaa acgtgagtgg atcctctgcg                                   30
<210>107
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>107
tctgcaggta ccattgc                                                 17
<210>108
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>108
tgcaatggta cctgcagaag c                                            21
<210>109
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>109
agactgccct ggcttctgca ggtaccattg ca                                32
<210>110
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>110
cgattagaaa ctttatagat caggagctgt gg                                32
<210>111
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>111
tgccactgaa cctgtcaggg accccataaa gc                                32
<210>112
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>112
gattttcagt gtaaaatctg tgcctgatcc ac                                32
<210>113
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>113
taaaccccaa catcctcagc ctccactctg ct                                32
<210>114
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>114
tccacggaac atgtgaacct tgaaagcagt aa                                32
<210>115
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>115
tttgatttcc accttggtcc cttggccgaa c                                 31
<210>116
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>116
cgcagaggat ccactcacg                                               19
<210>117
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>117
gtcagaacgc gtgccgcc                                                18
<210>118
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>118
accatgaaag tgttgagtct gttgtacctc ttga                              34
<210>119
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>119
cagccattcc tggtatcctg tctcaggtgc agct                              34
<210>120
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>120
tcaggagtcg ggcccaggac tggtgaagcc ttcg                              34
<210>121
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>121
gagaccctgt ccctcacctg cactgtctct ggt                               33
<210>122
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>122
tactccatca ccggtggtta tttatggaac tgg                               33
<210>123
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>123
atacggcagc ccccagggaa gggactggag tgg                               33
<210>124
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>124
atggggtata tcagctacga cggtaccaat aac                               33
<210>125
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>125
tcaacacttt catggtggcg gcacgcgttc tgac                              34
<210>126
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>126
ataccaggaa tggctgtcaa gaggtacaac agac                              34
<210>127
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>127
tgggcccgac tcctgaagct gcacctgaga cagg                              34
<210>128
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>128
tgagggacag ggtctccgaa ggcttcacca gtcc                              34
<210>129
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>129
ccaccggtga tggagtaacc agagacagtg cagg                              34
<210>130
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>130
ccctgggggc tgccgtatcc agttccataa ataa                              34
<210>131
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>131
tagctgatat accccatcca ctccagtccc tt                                32
<210>132
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>132
gttattggta ccgtcg                                                  16
<210>133
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>133
tacgacggta ccaataacta c                                            21
<210>134
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>134
aaaccctccc tcaaggatcg aatcaccata tc                                32
<210>135
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>135
acgtgacacg tccaagaacc agttctccct ga                                32
<210>136
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>136
agctgagctc tgtgaccgct gcggacactg ca                                32
<210>137
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>137
gtgtattact gtgcgagata cggtagggtc tt                                32
<210>138
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>138
ctttgactac tggggccagg gaaccctggt ca                                32
<210>139
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>139
ccgtctcctc aggtgagtgg atcctctgcg                                   30
<210>140
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>140
agggagggtt tgtagttatt ggtaccgtcg ta                                32
<210>141
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>141
acgtgtcacg tgatatggtg attcgatcct tg                                32
<210>142
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>142
agagctcagc ttcagggaga actggttctt gg                                32
<210>143
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>143
cagtaataca ctgcagtgtc cgcagcggtc ac                                32
<210>144
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>144
agtagtcaaa gaagacccta ccgtatctcg ca                                32
<210>145
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>145
ctgaggagac ggtgaccagg gttccctggc ccc                               33
<210>146
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸
<400>146
cgcagaggat ccactcac                                                18
<210>147
<211>31
<212>DNA
<213>类人
<400>147
ctggttactc catcagcggt ggttatttat g                                 31
<210>148
<211>31
<212>DNA
<213>类人
<400>148
cataaataac caccgctgat ggagtaacca g                                 31
<210>149
<211>31
<212>DNA
<213>类人
<400>149
gggactggag tggatcgggt atatcagcta c                                 31
<210>150
<211>31
<212>DNA
<213>类人
<400>150
gtagctgata tacccgatcc actccagtcc c                                 31
<210>151
<211>31
<212>DNA
<213>类人
<400>151
tccctcaagg atcgagtcac catatcacgt g                                 31
<210>152
<211>31
<212>DNA
<213>类人
<400>152
cacgtgatat ggtgactcga tccttgaggg a                                 31
<210>153
<211>39
<212>DNA
<213>类人
<400>153
gatcgagtca ccatatcagt ggacacgtcc aagaaccag                         39
<210>154
<211>39
<212>DNA
<213>类人
<400>154
ctggttcttg gacgtgtcca ctgatatggt gactcgatc                         39
<210>155
<211>31
<212>DNA
<213>类人
<400>155
gcttccagca gtgatattgt gatgactcag t                                 31
<210>156
<211>31
<212>DNA
<213>类人
<400>156
actgagtcat cacaatatca ctgctggaag c                                 31