一个系列的非病毒载体及包含其的药物组合物.pdf

本发明涉及一系列非病毒载体及编码其的融合基因，所述非病毒载体是包含受体或辅助受体多肽与富含阳性氨基酸的多肽的融合靶向性蛋白，其将能够在体内表达对细胞具有杀伤作用的功能蛋白质的表达型重组体靶向性地导入被HIV/SIV感染的CD4+细胞，以使该表达型重组体在该细胞内表达出功能蛋白，从而杀灭清除所述被感染的细胞；该非病毒载体同时能够在细胞外中和失活游离的HIV/SIV；本发明还涉及包含所述非病毒载体和所述表达型重组体的药物组合物，并涉及特定的表达型重组体及用于构建所述表达型重组体的特定的功能基因。

权利要求书
1、  非病毒载体，其是包含受体多肽或辅助受体多肽与富含阳性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白。

2、  如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于所述受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CD4、CD4V1V2或CD4V1，或者是它们的相关片段、类似物或突变体。

3、  如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于所述辅助受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CXCR4或其相关片段、类似物或突变体。

4、  如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于所述辅助受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CCR5或其相关片段、类似物或突变体。

5、  如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于所述受体多肽或辅助受体多肽是由两个或更多个多肽片段融和而成的。

6、  如权利要求1～5之任一项所述的非病毒载体，其特征在于所述富含阳性氨基酸的多肽是组蛋白或组蛋白H1，或者是它们的片段或类似物。

7、  如权利要求6所述的非病毒载体，其特征在于所述富含阳性氨基酸的多肽是组蛋白H1中的一段86个氨基酸的片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：10所示。

8、  如权利要求6所述的非病毒载体，其特征在于所述富含阳性氨基酸的多肽是组蛋白H1中的一段24个氨基酸的片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：12所示。

9、  如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于所述富含阳性氨基酸的多肽是DNA结合蛋白SON或其相关片段、类似物或突变体。

10、  如权利要求9所述的非病毒载体，其特征在于所述受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CD4V1或其相关片段、类似物或突变体。

11、  如权利要求10所述的非病毒载体，其中编码CD4V1的基因是包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，所述序列如SEQ ID NO.：3所示。

12、  如权利要求9所述的非病毒载体，其特征在于所述辅助受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CXCR4的第二胞外环区XE或其相关片段、类似物或突变体。

13、  如权利要求12所述的非病毒载体，其中编码XE的DNA序列为包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，所述序列如SEQ IDNO.：15所示。

14、  如权利要求9所述的非病毒载体，其特征在于所述辅助受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CCR5的氨基末端的第2-31位氨基酸片段RN或其相关片段、类似物或突变体。

15、  如权利要求14所述的非病毒载体，其中编码RN的DNA序列为包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，所述序列如SEQ IDNO.：16所示。

16、  如权利要求9所述的非病毒载体，其特征在于所述辅助受体多肽是由XE和RN融和而成的如SEQ ID NO.：17所示的融和蛋白XE-RN。

17、  如权利要求16所述的非病毒载体，其中编码XE-RN的DNA序列为包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，所述序列如SEQID NO.：18所示。

18、  如权利要求9～17之任一项所述的非病毒载体，其特征在于所述富含阳性氨基酸的多肽是DNA结合蛋白SON的第788-859位氨基酸的片段。

19、  如权利要求18所述的非病毒载体，其特征在于所述SON片段的编码DNA为包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，所述序列如SEQ ID NO.：20所示。

20、  如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于通过基因工程方法在体外重组获得融合基因，并在原核或真核细胞中表达该融合基因而获得该融合蛋白。

21、  如权利要求20所述的非病毒载体，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO.：21、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：23、SEQ ID NO.：24、SEQ ID NO.：25、SEQ ID NO.：26或SEQ ID NO.：27。

22、  编码权利要求21的非病毒载体的融和基因，所述融和基因选自：SEQ ID NO.：29所示的融合基因CD4V1V2-H1-86、SEQ IDNO.：30所示的融合基因CXCR4-H1-86、SEQ ID NO.：31所示的融合基因CCR5-H1-24、SEQ ID NO.：32所示的融合基因CD4V1-SON、SEQ ID NO.：33所示的融合基因XE-SON、SEQ ID NO.：34所示的融合基因RN-SON，以及SEQ ID NO.：35所示的融合基因XE-RN-SON。

23、  用于靶向性艾滋病基因治疗的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至21之一种或多种的非病毒载体，以及功能基因表达型重组体，所述表达型重组体包含表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。

24、  如权利要求23所述的药物组合物，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或其他对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物或人工化学合成的蛋白质，或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物。

25、  如权利要求24所述的药物组合物，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素，或者是其第二和第三功能结构域。

26、  如权利要求23所述的药物组合物，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌毒素的第三功能结构域或其突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.：28所示。

27、  如权利要求23～26之任一项所述的药物组合物，其中所述表达型重组体在细胞内表达对细胞具有杀伤作用的毒素蛋白。

28、  如权利要求23～26之任一项所述的药物组合物，其中所述表达型重组体为以CMV为启动子，基于pcDNA3.1mychisA而构建的表达型重组体pCMV-PEIIImut。

29、  如权利要求23～26之任一项所述的药物组合物，其中所述表达型重组体为受HIV-1或HIV-2的5′-LTR启动子控制的真核重组表达型重组体pYL-PEIIImut。

30、  突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA，PEIIImut，其DNA序列如SEQ ID NO.：36所示。

31、  由权利要求30的基因PEIIImut编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：28所示。

32、  以权利要求30的基因PEIIImut作为功能基因，基于pcDNA3.1mychisA而构建的表达型重组体pCMV-PEIIImut。

33、  以权利要求30的基因PEIIImut作为功能基因，受HIV-1或HIV-2的5′-LTR控制的真核重组表达型重组体pYL-PEIIImut。

34、  如权利要求32或33所述的表达型重组体，其中在HIV-1或HIV-2的5′-LTR与PEIIImut之间，或者在CMV与PEIIImut之间接有内含子，即，形成5′LTR-Intron-PEIIImut，或CMV-Intron-PEIIImut。

35、  如权利要求34所述的表达型重组体，其中所述内含子是兔子珠蛋白的Intron II。

36、  权利要求1～21之任一项的非病毒载体的制备方法，所述方法包括将编码受体多肽或辅助受体多肽的基因与编码富含阳性氨基酸的多肽的基因在体外重组，获得融和基因，然后使所述融和基因在原核或真核细胞中进行表达，获得所述非病毒载体。

37、  权利要求23～29之任一项的药物组合物的制备方法，所述方法包括将非病毒载体与功能基因表达型重组体混和、装配成复合药物。

说明书一个系列的非病毒载体及包含其的药物组合物
技术领域
本发明属于基因治疗领域，具体地说，本发明涉及一个系列的非病毒载体及编码其的融合基因，所述非病毒载体将能够在体内表达对细胞具有杀伤作用的蛋白质的表达型重组体靶向性地导入被HIV/SIV感染的CD4+细胞中，以使该表达型重组体在该细胞内表达出毒素蛋白，从而杀灭清除所述被感染的细胞；该非病毒载体同时能够在细胞外中和游离的HIV/SIV；本发明还涉及包含所述一个系列的非病毒载体和所述表达型重组体的药物组合物，并涉及特定的表达型重组体及用于构建所述表达型重组体的特定目的基因。本发明还涉及上述的一个系列的非病毒载体和药物组合物的制备方法。
背景技术
目前，艾滋病的最常用的治疗方法为鸡尾酒疗法，该方法最大的缺陷是毒副作用大，易形成耐药性，易出现病毒的潜伏，且价格昂贵。虽然该方法可以降低患者血中的病毒滴度，但不能根治艾滋病。
基因治疗逐渐成为艾滋病治疗方法中非常有前景的一种手段。基因治疗通过将外源DNA导入人体的特定细胞以产生治疗效果，达到治疗疾病的目的。目前主要有两大类方法可以有效地介导外源DNA转入人体细胞，一类是病毒载体介导的方法；另一类是非病毒载体介导的方法。病毒载体存在一些目前的技术无法克服的缺点，如滴度低、逆转录病毒载体存在致瘤的可能性、病毒载体感染的靶细胞必须为可分裂细胞、病毒引起的免疫排斥反应导致治疗失效以及宿主细胞的死亡等。而近年来发展起来的非病毒载体有以下优点：简便、安全、无毒，可以将目的基因特异性地导入靶组织或细胞，达到治疗目的。
对属于非病毒载体的受体介导的基因转移方法，近年来有所报道。受体介导的基因转移可以通过外源DNA重组体与受体的相应配体结合形成复合物来实现。该类复合物中的配体可与特定细胞表面的相应受体结合，通过受体介导的内化作用，将外源DNA重组体转导入特定细胞，提高基因转移的靶向性和转移效率。
靶向性治疗技术又称为“生物导弹”技术，正越来越引起人们的关注。第一代生物导弹的设计思路是将单克隆抗体与药物、核素或抗生素融合在一起用于临床治疗，其主要问题是靶向性差；第二代生物导弹的设计思路是将不同的功能区段拼接所构建的融合蛋白作为“分子导向”型导弹，如人工构建TGF-PE40、IL2-PE40、CD4-PE40融合蛋白用于治疗某些恶性肿瘤、自身免疫性疾病以及艾滋病，其主要问题是人工构建的融合蛋白由于其中的PE40对人体而言是异源蛋白，在人体应用会有较强的免疫原性，应用中将引起严重的免疫中和效应，导致药物失效，以及毒素蛋白的肝、肾毒性，以至无法真正在临床上推广；第三代生物导弹主要设计思路是利用治疗基因(或基因片段)与化学合成的多聚阳离子分子形成DNA-蛋白质复合物，利用此复合物中蛋白质上的特异性配体作为分子识别蛋白，将整个复合物特异性地导向到靶细胞内从而实现其靶向性设计。经常用于结合DNA的多聚阳离子分子为多聚赖氨酸(Polylysine)，但大部分的多聚赖氨酸都是人工合成的，在基因治疗临床应用中成本极高(在美国，固相合成的28氨基酸，1克约为40-50万美元，在中国约为150-160万人民币)，以至于即使临床试验成功也几乎无法在临床推广应用。为了降低成本，并尽可能减少外源物质引起免疫原性的可能，需要有更廉价易得且无免疫原性的结合DNA的多聚阳离子物质。
为了克服以上缺点，本发明的发明人应用来自于人体基因表达产物的蛋白质片段构建非病毒载体，复合与包裹带有毒素基因的重组体DNA，经非病毒载体中的受体多肽或辅助受体多肽与配体结合，将毒素基因导入靶细胞，以使毒素基因仅在拟将之杀灭的细胞内表达，从而杀灭该细胞。这样，一方面通过用基因代替蛋白，避免了作为人体异源蛋白的毒素蛋白在人体内运行过程中因免疫原性所导致地抗体产生及其继后的中和失效的发生；另一方面也避免了毒素蛋白对正常细胞的杀伤作用，即毒副作用。同时由于用于复合与包裹重组体DNA的融和蛋白的各种片段是来自于人体的基因的表达产物，从而避免了使用昂贵的多聚赖氨酸，使其实施成为可能，而且这些人源基因产物不会有很强的免疫原性。
发明内容
因此，在第一方面，本发明提供非病毒载体，所述非病毒载体是包含受体多肽或辅助受体多肽与富含阳性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白。
在另一方面，本发明提供包含所述非病毒载体以及表达型重组体的药物组合物，其用于靶向性艾滋病基因治疗，所述表达型重组体包含表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。
优选地，所述非病毒载体中的受体多肽是能够与HIV/SIV表面分子gp120和/或gp41特异性结合的CD4分子、CD4V1V2或CD4V1，或它们的相关片段、类似物或突变体；或者是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CXCR4或其相关片段、类似物或突变体；或者是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CCR5或其相关片段、类似物或突变体；其中编码CD4V1V2的基因序列如SEQ ID NO.：1所示，所编码的CD4V1V2的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示；突变后的CD4V1的基因序列如SEQ ID NO.：3所示，所编码的CD4V1的氨基酸序列如SEQ ID NO.：4所示；编码CXCR4氨基末端的氨基酸的DNA序列如SEQ ID NO.：5所示，所编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.：6所示；编码CCR5氨基末端的氨基酸的DNA序列如SEQ IDNO.：7所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.：8所示；。
优选地，所述非病毒载体中的富含阳性氨基酸的多肽是人组蛋白或组蛋白H1，或者是它们的功能域片段或类似物或其突变体，特别是组蛋白H1中的一段86个氨基酸的片段，其编码DNA序列如SEQID NO.：9所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.：10所示；或者是组蛋白H1中的一段24个氨基酸的片段，其编码DNA序列如SEQ ID NO.：11所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.：12所示。
使用组蛋白H1或其片段的非病毒载体可以称之为H型非病毒载体。
类似地，还优选所述非病毒载体中的富含阳性氨基酸的多肽是DNA结合蛋白SON或其片段、类似物或突变体。
当富含阳性氨基酸的多肽是SON或其片段时，所述非病毒载体中的受体多肽优选是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CD4V1或其相关片段、类似物或突变体；或者是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CXCR4的第二胞外环区XE或其相关片段、类似物或突变体；或者是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CCR5的氨基末端的第2-31位氨基酸片段RN或其相关片段、类似物或突变体；其中，XE的氨基酸序列如SEQ ID NO.：13所示，RN的氨基酸序列如SEQ ID NO.：14所示。
更优选地，上述受体多肽的编码基因是包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：15和SEQ ID NO.：16所示的序列。
当富含阳性氨基酸的多肽是SON或其片段时，所述非病毒载体中的受体多肽最优选是由上述XE和RN融合而成的如SEQ ID NO.：17所示的融和蛋白XE-RN，并且最优选所述融和蛋白XE-RN的编码基因是包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO.：18所示的序列。
优选地，所述非病毒载体中的富含阳性氨基酸的多肽是DNA结合蛋白SON的第788-859位氨基酸的片段，其氨基酸序列如SEQ IDNO.：19所示；更优选地，编码该片段的DNA序列为包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO.：20所示的序列。
使用DNA结合蛋白SON或其片段的非病毒载体可以称之为S型非病毒载体。
优选地，通过基因工程方法在体外重组获得融合基因，并在原核或真核细胞中表达该融合基因而获得本发明的非病毒载体(融合蛋白)。
最优选地，所述非病毒载体的氨基酸序列如SEQ ID NO.：21、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：23、SEQ ID NO.：24、SEQ ID NO.：25、SEQ ID NO.：26或SEQ ID NO.：27所示。
优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或其他对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物或人工化学合成的蛋白质，或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物；更优选地，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素，或者是其第二和第三结构域；最优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌毒素的第三结构域或其突变体，其中所述突变体的氨基酸序列SEQ ID NO.：28所示。
优选地，所述表达型重组体为基于pcDNA3.1mychisA而构建的表达型重组体pCMV-PEIIImut；或者是受HIV-1或HIV-2的5′-LTR控制的真核重组表达型重组体pYL-PEIIImut。
在另一方面，本发明提供七种编码上述最优选的本发明的非病毒载体(融合蛋白)的融合基因，所述融合基因的DNA序列分别如SEQID NO.：29、SEQ ID NO.：30、SEQ ID NO.：31、SEQ ID NO.：32、SEQ ID NO.：33、SEQ ID NO.：34、SEQ ID NO.：35所示。它们编码的融合蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.：21、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：23、SEQ ID NO.：24、SEQ ID NO.：25、SEQ ID NO.：26和SEQ ID NO.：27所示。这些融合蛋白是运用基因工程技术方法生产的，同固相合成相比较，其造价约降低2-3个数量级，以便于临床试验及可能的临床应用。
在另一方面，本发明涉及序列如SEQ ID NO.：36所示的突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA，PEIIImut；涉及其表达产物，所述表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.：28所示；并涉及包含PEIIImut的表达型重组体，如以CMV为启动子的，基于pcDNA3.1mychisA而构建的表达型重组体pCMV-PEIIImut，或者是基于载体PYL158构建成的、受HIV-1或HIV-2的5′-LTR启动子控制的真核重组表达型重组体pYL-PEIIImut。
附图说明
图1A、1B、1C分别为作为本发明优选实施方案的三型七组十四种药物组合物的总体设计图。
图2为表达型重组体pCMV-PEIIImut(图中简写为pA-PEIIImut)的构建图谱。
图3为表达型重组体pBS-PEIIImut的构建图谱。
图4为表达型重组体pYL-PEIIImut的构建图谱。
图5为重组体pPIC9K-H1的构建图谱。
图6为含有融合基因CD4V1V2-H1的重组体pPIC9K-CD4V1V2-H1的构建图谱。
图7为含有融合基因CXCR4-H1的重组体pPIC9K-CXCR4-H1的构建图谱。
图8为含有融合基因CCR5-H124的重组体pPIC9K-CCR5-H124的构建图谱。
图9a～9e是显示杀伤试验中各组细胞的形态的荧光照片，其中图9a为正常细胞；图9b为A1组被SIV感染的CEMX-174细胞；图9c为D1组细胞；图9d为E1组细胞；图9e为F1组细胞；放大倍数均为200X。
图10b～10e是显示中和试验中各组细胞的形态的荧光照片，其中图10b为B2组细胞；图10c为D2组细胞；图10d为E2组细胞；图10e为H2组细胞；放大倍数均为200X，该中和试验中的正常细胞形态与图9a所示相同。
图11为含有融合基因RN-SON的重组体pCW-RN-SON的构建图谱。
图12为含有融合基因CD4V1-SON的重组体pCW-CD4V1-SON的构建图谱。
图13为含有融合基因XE-SON的重组体pCW-XE-SON的构建图谱。
图14为表达型载体pDYP-PEIIImut的构建图谱。
图15为含有融合基因XE-RN-SON的重组体pCW-XE-RN-SON(图中简写为pCWXRS)的构建图谱。
图16为重组体T-RN-SON的测序图谱(T为T载体)。
图17为重组体pCW-XE-RN-SON表达蛋白飞行质谱检测结果。
图18为含有融合基因XE-RN-SON的重组体pCW-XE-RN-SON的N末端15个氨基酸测序图谱。
图19为重组体pCW-XE-RN-SON表达蛋白阳离子柱梯度洗脱结果。
图20a、20b为显示pCW-XE-RN-SON/pDYP-PEIIImut杀伤试验前后细胞形态的荧光照片，其中图20a为复合物杀伤试验前细胞染色照片；图20b为复合物杀伤试验后细胞染色照片，放大倍数均为200X。
图21a、21b为显示pCW-XE-RN-SON/pDYP-PEIIImut中和试验前后细胞的形态的荧光照片，其中图21a为复合物中和试验前细胞染色照片；图21b为复合物中和试验后细胞染色照片，放大倍数均为200X。
具体实施方式
绿脓杆菌毒素(PE)是由绿脓杆菌分泌的一种毒素，其是一种极毒的毒素，仅仅对小鼠一次静脉注射0.3微克即可使之在24小时内死亡。对一个细胞来说几个分子的毒素的导入即可使这个细胞死亡。由于PE这种独特的性能，使其作为一种很有前途的毒素被应用到艾滋病的基因治疗中去。PE具有三个结构域，结构域Ia(AA1-252)为细胞结合结构域，结构域III(AA405-613)为ADP糖基化区域，结构域II和结构域III又合称为PE40，而结构域Ib(AA365-404)无明显的生物学功能。
为了增加毒素基因PEIIImut在人体内表达的安全性，本发明人另将毒素基因连接在HIV-1或HIV-2的5′-LTR(-158～+80)下游，形成5′-LTR-Intron-PEIIImut，这样的重组体只有被导入受HIV/SIV感染的细胞中，毒素基因PEIIImu才能表达出蛋白质，从而杀灭被感染的细胞。这是因为，HIV的Tat蛋白可以与5′-LTR中的TAR结合，5′-LTR中的启动子驱动PEIIImut的表达。而对于未受HIV/SIV感染的细胞，即使上述毒素重组体被误导入其中，因无Tat蛋白的存在，5′-LTR中的启动子不会被驱动或活化，因而PEIIImut基因不会表达，细胞也不会被杀灭。相反，这类对细胞为异源的重组体，则会被细胞内的溶酶体所降解与清除。这就是功能基因可控性或限制性表达设计的一种形式(第二开关)，确保了毒素基因应用的精确制导与安全性。
上述的内含子优选为兔子珠蛋白的Intron II。
因此，在本发明的第一个优选的实施方案中，提供了包含突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA，PEIIImut的表达型重组体，所述重组DNA PEIIImut的序列如SEQ ID NO.：36所示，其编码的突变绿脓杆菌毒素结构域III的毒力，即杀伤力更强。
毒力的增强如下实现：通过将绿脓杆菌毒素第III结构域C端的5个氨基酸残基RDELK的密码子突变为KDEL的密码子，并引入终止密码子TGATAA而得到重组DNA PEIIImut，其编码的毒素蛋白的毒力比原来的PEIII大约强20倍左右。PEIIImut可根据本领域公知的技术引入各种表达载体以用于构建表达型重组体，从而表达毒素蛋白。这种表达型重组体的一个例子是pCMV-PEIIImut，本发明人得到了以pCMV-PEIIImut转化的大肠杆菌DH5α/pCMV-PEIIImut。
在本发明的第二个优选的实施方案中，提供了用于艾滋病靶向基因治疗的药物组合物，其包含上述表达型重组体与非病毒载体(融合蛋白)的复合物。所述融合蛋白包括人CD4V1V2的179个氨基酸和人组蛋白H1(第134位至219位)的86个氨基酸，或者所述融合蛋白包括人CXCR4的309个氨基酸组蛋白和人H1的86个氨基酸，或者包括人CCR5的氨基末端的300个氨基酸和人组蛋白H1(第134位至157位)的24个氨基酸，或者，所述融合蛋白包括人CD4的V1结构域的100个氨基酸和人SON第788-859位的72个氨基酸，或者所述融合蛋白包括人XE的27个氨基酸和人SON第788-859位的72个氨基酸，或者包括人RN的30个氨基酸人和SON第788-859位的72个氨基酸，或者，所述融合蛋白包括人XE的27个AA和RN的30个AA，以及人SON的第788-859位的72个AA。这些融合蛋白对人体无免疫原性。在本发明的这种用于靶向性基因治疗的药物的应用中，包含PEIIImut的表达型重组体与融合蛋白中可结合DNA的组分，人组蛋白H1或SON紧密结合，融合蛋白中的靶向组分CD4V1V2、CXCR4、CCR5、CD4V1、XE、RN或XE-RN通过与被HIV/SIV感染的CD4+细胞(包括Hut-78细胞、CEMX-174细胞等)的gp120结合而将复合物导入被HIV/SIV感染的CD4+细胞，在被感染的细胞中PEIIImut表达型重组体表达毒素蛋白，从而将被SIV/HIV感染的CD4+细胞杀死。
在本发明的第三个实施方案中，提供了融合基因，所述融合基因编码本发明的药物组合物中使用的作为非病毒载体的融合蛋白，所述融合蛋白从5′到3′依次包括人CD4V1V2的179个氨基酸和人组蛋白H1的86个氨基酸(含53个赖氨酸和6个精氨酸，即59个带正电氨基酸)，或者从5′到3′依次包括人CXCR4的309个氨基酸和人组蛋白H1的86个氨基酸(含52个赖氨酸和11个精氨酸，即63个带正电氨基酸)，或者从5′到3′依次包括人CCR5的300个氨基酸和人组蛋白H1的24个氨基酸(含21个赖氨酸和12个精氨酸，即33个带正电氨基酸)，或者从5′到3′依次包括人CD4V1的100个氨基酸和人SON的72个氨基酸(含30个赖氨酸和18个精氨酸，即48个带正电氨基酸)，或者从5′到3′依次包括人XE的27个氨基酸和人SON的72个氨基酸(含17个赖氨酸和17个精氨酸，即34个带正电氨基酸)，或者从5′到3′依次包括人RN的30个氨基酸和人SON的72个氨基酸(含19个赖氨酸和16个精氨酸，即35个带正电氨基酸)，或者从5′到3′依次包括人XE的27个氨基酸和人RN的30个氨基酸以及人SON的72个AA(含36个赖氨酸和33个精氨酸，即69个带正电的氨基酸)。分别将以上七种融合基因命名为：①CD4V1V2-H1、②CXCR4-H1、③CCR5-H124、④CD4V1-SON、⑤XE-SON、⑥RN-SON和⑦XE-RN-SON，它们的DNA序列分别如SEQ ID NO.：29、SEQ ID NO.：30、SEQ ID NO.：31、SEQ ID NO.：32、SEQ ID NO.：33、SEQ ID NO.：34和SEQ ID NO.：35所示。用上述①～③含有CD4V1V2-H1编码的质粒pPIC9K-CD4V1V2、含有CXCR4-H1编码的质粒pPIC9K-CXCR4-H1以及含有CC54-H124编码的质粒pPIC9K-CCR5-H124分别转化毕赤酵母KM71，获得转化子毕赤酵母KM71/pPIC9K-CD4V1V2-H1、毕赤酵母KM71/pPIC9K-CXCR4-H1及毕赤酵母KM71/pPIC9K-CCR5-H124。将上述④～⑦融合基因分别与表达型载体pCW111(含PL-SD)重组，分别命名为pCW-CD4V1-SON、pCW-XE-SON、pCW-RN-SON和pCW-XE-RN-SON。用上述质粒分别转化大肠杆菌DH5α，获得可以表达目的蛋白的工程菌。
本发明的一个基本原理是，受HIV/SIV感染的细胞表面必然出现HIV/SIV的gp120糖蛋白，它可被相应的受体或辅助受体所结合。这是本发明实现药物靶向设计的最基本的根据之一。具体地说，由于本发明的药物组合物是将毒素基因导入被HIV/SIV感染的CD4+细胞中表达，因此，就不需要毒素的跨膜转运结构域。正是由于这种原因，本发明的毒素基因PEIIImut中仅含有绿脓杆菌毒素的具有ADP糖基化酶活性的第III结构域的编码序列。该编码序列在靶细胞中表达出的蛋白可作为杀死靶细胞的毒素。它的作用是破坏正常蛋白质合成的延伸，引起细胞凋亡以致死细胞。另外，本发明人用白喉毒素C端的4个氨基酸残基KDEL替代了PE毒素C端的5个氨基酸残基REDLK，由此大大增强了毒素的杀死细胞能力。另外，由于毒素蛋白是在细胞内进行表达，这就彻底避免了毒素蛋白的免疫原性问题。即使在靶细胞崩解后，其中的毒素蛋白也许可能被机体免疫识别捕获，从而产生抗体，但这些抗体既无法清除细胞内的毒素蛋白，也不会和作为毒素蛋白表达载体的质粒DNA发生反应。事实上，这类被杀灭的细胞将迅速被机体的免疫机制所清除。
关于本发明的非病毒载体中的特异性受体CD4V1V2，CXCR4和CCR5问题，已知单独的CD4胞外可变区V1V2即可与gp120充分结合，故在此选取其V1V2部分。利用RT-PCR技术从正常中国人外周血中获得的CD4V1V2、CXCR4和CCR5的编码序列。CXCR4和CCR5为化学趋化因子受体，作为CD4的辅助受体可以配合CD4与HIV Env结合，也可直接与Env结合。其C端细胞内部分的作用是将信号传递给GTP结合蛋白，它的缺失并不影响受体与gp120的结合，而受体分布于整个胞外区的部位对于HIV的结合及病毒进入细胞均有作用。为了使靶向蛋白尽可能在维持功能的基础上减小体积，进一步利用PCR分别去掉CXCR4和CCR5羧基端的34和52个氨基酸，同时在C端引入一个AvrII酶切位点，便于组蛋白H1的加入。
另外，本发明的药物组合物中进一步应用特异性受体CD4、CXCR4、CCR5中参与结合配体的核心部分，即CD4的V1区、CXCR4分子的第二胞外环区(第176-202位氨基酸，XE)和CCR5分子的N末端第2-31位的氨基酸片段(RN)，其目的在于：(1)尽可能减小靶向蛋白分子和融合蛋白的长度与体积，以及尽可能的保持受体结合配体的功能。(2)为了进一步提高表达水平，基于细菌在表达蛋白时对遗传密码子的偏爱性的考虑，在构建表达型重组体时，将CDV1、XE、RN以及SON中天然存在的密码子突变为最适或较适的密码子，以获得高水平的表达。因此，借助基因合成和长引物PCR拼接技术，获得目的基因片段。XE和RN为化学趋化因子受体中与配体结合主要功能区，可直接与HIV/SIV的Env的gp120结合，还可以作为CD4V1的辅助受体，与CD4V1共同参与结合HIV/SIV的Env的gp120。为了便于融合蛋白中的导向部分和DNA结合部分之间的重组操作，在具体实施过程中在CDV1和XE基因的3′端和SON的5′端引入一个KpnI酶切位点，便于SON的加入。
而且，本发明的药物组合物中应用特异性辅助受体CXCR4、CCR5中参与结合配体的重要部分，即CXCR4分子的第二胞外环区(第176-202位氨基酸，XE)和CCR5分子的N末端第2-31位的氨基酸片段(RN)的组合，其优点在于，XE-RN组合对于能够侵入靶细胞的三类HIV病毒都可以发挥作用。第一类为M-tropic HIV株(巨噬细胞嗜向性HIV)，即感染巨噬细胞和末梢血T细胞，合胞体形成能力低。第二类为T-tropic(T细胞株嗜向性HIV)，即感染培养T细胞株，合胞体形成能力高。第三类为双嗜性(dual-tropic)HIV，既能感染巨噬细胞和末梢血T细胞，又能感染培养T细胞株的HIV病毒株。现已证明HIV感染时，嗜巨噬细胞HIV利用CCR5；嗜T细胞株HIV利用CXCR4；双嗜性既利用CCR5又利用CXCR4。因此，借助基因合成和长引物PCR技术，获得目的基因片段。XE和RN为化学趋化因子受体中与配体结合主要功能区，可直接与HIV/SIV的Env结合，还可以作为CD4V1的辅助受体，与CD4V1共同参与结合HIV/SIV的Env的gp120。为了便于融合蛋白中的导向部分和DNA结合部分之间的重组操作，在具体实施过程中在RN基因的5′端和SON的3′端引入一个KpnI酶切位点和BamHI位点，以便于RN-SON的加入。
本发明的融合蛋白中利用人体内正常存在的组蛋白H1或DNA结合蛋白SON分子片段作为DNA的结合分子。组蛋白H1含有足够量的碱性氨基酸，特别是大量的赖氨酸，而SON分子片段含有大量碱性氨基酸，特别是赖氨酸和精氨酸，它们在一定pH条件下带正电荷，能通过静电作用与带负电荷的DNA结合。其自然形态本身就在真核生物基因组DNA的折叠、浓聚方面有重要的作用。这样设计可以保证DNA分子充分浓聚的基础上保证了低免疫原性，且可以被靶细胞内化。
以下通过实施例进一步描述本发明。本发明在实施例中给出了三型七组十四种复合物的制备方法及其药效，这些复合物可以概括如下：
(A)H型
(1)CD4V1V2-H1/pCMV-PEIIImut；CD4V1V2-H1/5’LTR-IntronII-PEIIImut
(2)CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut；CXCR4-H1/5’LTR-IntronII-PEIIImut
(3)CCR5-H1/pCMV-PEIIImut；CCR5-H1/5’LTR-IntronII-PEIIImut
(B)S型
(1)CD4V1-SON/pCMV-PEIIImut；CD4V1-SON/5’LTR-IntronII-PEIIImut
(2)XE-SON/pCMV-PEIIImut；XE-SON/5’LTR-IntronII-PEIIImut
(3)RN-SON/pCMV-PEIIImut；RN-SON/5’LTR-IntronII-PEIIImut
(C)XR型
(1)XE-RN-SON/pCMV-PEIIImut；XE-RN-SON/5’LTR-IntronII-PEIIImut
实施例1  PEIIImut的克隆及其表达型重组体的构建
1、PEIIImut的扩增和克隆
以含有绿脓杆菌毒素PE40的质粒pZM3为模板，用序列如下的引物经PCR扩增出绿脓杆菌毒素的III结构域的编码序列。所用的引物序列中引入了EcoRV和EcoRI的识别序列，并且引入了以使PEIII编码序列3′端如上所述的5个氨基酸的密码子突变为4个氨基酸的密码子的序列，引物序列为：
上游引物(33bp)：5′-tcgatatcaccatgctcggcgacggcggcgacg-3′
                    EcoRV Kozak
下游引物(40bp)：5′-ggaattcttacagttcgtccttcggcggtttgccgggctg-3′
                    EcoRI
PCR反应条件为：94℃变性5分钟后开始循环：94℃变性40秒，56℃退火40秒，70℃延伸40秒。经35个循环后，70℃延伸10分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以琼脂糖凝胶电泳、玻璃奶法回收PCR产物中的660bp的目的DNA片段。所得扩增片段经EcoRV和EcoRI双酶切，再以琼脂糖凝胶电泳、玻璃奶法回收酶切产物的目的DNA片段。
2、表达型重组体pCMV-PEIIImut的构建
将上述回收的目的DNA片段与同样经EcoRV和EcoRI处理的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisA(Invitrogen公司，Carlsbad，加州，美国)的DNA片段相连接，并转化大肠杆菌DH5α。筛选出阳性克隆，从中制备质粒，用EcoRV和EcoRI(TaKaRa公司)酶切鉴定所的质粒。由此鉴定出约含有650bp插入片段的阳性重组质粒，命名为pCMV-PEIIImut，其构建过程如图2所示。经测序显示所得PEIIImut片段的序列与所设计的序列吻合。PEIIImut的大小为642bp，其序列如SEQ ID NO.：36所示。
实施例2  重组质粒pYL-PEIIImut的构建
1、pBS-PEIIImut的构建
用EcoRV和HindIII(六合通公司，大连，中国)对实施例1中获得的含有PEIIImut毒素基因的DNA片段的载体pCMV-PEIIImut进行双酶切，纯化、回收649bp大小的片段。同样地，对质粒pBSKS(Promage公司)进行双酶切，纯化、回收大片段。用连接酶连接上述所获得的两片段，取部分连接产物转化大肠杆菌DH5α。筛选出阳性克隆，从中制备质粒，用EcoRV和HindIII酶切鉴定所得的质粒。由此鉴定出约含有650bp插入片段的阳性重组质粒，命名为pBS-PEIIImut，其构建过程如图3所示。
2、重组质粒pYL-PEIIImut的构建
pYL158是以HIV-1 5′-LTR-158到+80的片段为启动子，含荧光酶报告基因的表达质粒。用PstI和ClaI(六合通公司，中国大连)将带有PEIIImut的DNA片段从pBS-PEIIImut中酶切下，与经同样酶切处理的pYL158载体片段相连接。取部分连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性克隆，并对阳性克隆进行小量质粒制备，对质粒进行酶切鉴定，确定有PEIIImut片段正确插入的阳性重组质粒，命名为pYL-PEIIImut，其构建过程如图4所示。
实施例3  含有H1基因的重组体的构建
1、组蛋白H1基因片段的扩增
用人类白细胞的基因组DNA为模板，以如下引物经PCR扩增人组蛋白H1基因，所用引物如下：
上游引物：5′-TTTCCTAGGGCCAAGAAGCCCAAGAAGGT-3′
                 AvrII
下游引物：5′-GCTGCGGCCGCTTATCACTTTTTCTTCGGAGCTG-3′
             NotI
PCR反应条件为：94℃变性5分钟后开始循环：94℃变性35秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以2.0％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到283bp的DNA片段。
2、重组体pPIC9KH1的构建
分别用AvrII和NotI酶切步骤1纯化回收的酶切产物，同时用这两种酶分别酶切酵母表达型载体pPIC9K(Invitrogen公司)，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶法分别纯化、回收283bp和载体大片段，用T4 DNA连接酶连接这两个片段，连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆，按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。将该重组体命名为pPIC9KH1，其构建过程如图5所示。
实施例4  含有融合基因CD4V1V2-H1的重组体pPIC9K-CD4V1V2-H1的构建
1、CD4V1V2基因片段的获得
用含CD4V1V2基因的pPIC9-CD4V1V2重组体为模板，以如下引物经PCR扩增人CD4V1V2区段的编码序列，所用引物如下：
上游引物序列：5′-CAGGGAAAGAAAGTGGTGCTG-3′
下游引物序列：5′-CGCCCTAGGGAAAGCTAGCACCACGATG-3′
                      AvrII
PCR反应条件为：94℃变性3分钟后开始循环：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟，4℃5分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以1.5％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到556bp的DNA片段。
2、PIC9K-CD4V1V2-H1融合基因的构建和测序
用AvrII酶切步骤1中回收的基因片段CD4V1V2，同时用AvrII和SnaBI酶切实施例3中获得的pPIC9KH1，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶法分别纯化、回收546bp和9300bp左右的片段。用Gibco-BRL公司(洛克维尔，马里兰州，美国)的连接酶(5u/μl)连接上述获得的两种酶切产物。具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。上述连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。其构建过程如图6所示。经测序表明CD4V1V2-H1融合基因的序列如SEQ ID NO.：29所示。
实施例5  含有融合基因CXCR4-H1的重组体pPIC9K-CXCR4-H1的构建
1、CXCR4基因片段的扩增
用含基因CXCR4的pPIC9-CXCR4重组质粒为模板，以如下引物经PCR扩增人CXCR4的N端的编码序列，所用引物如下：
上游引物序列：5′-ACTTCAGATAACTACACCGAG-3′
下游引物序列：5′-AATCCTAGGACAGGTGAGTGCGTGCTG-3′
                      AvrII
PCR反应条件为：94℃变性3分钟后开始循环：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分钟。经35个循环后，72℃延伸5分钟，4℃、5分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以1％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到936bp左右的DNA片段。
2、pPIC9K-CXCR4-H1融合基因的构建和测序
用AvrII酶切步骤1中回收的基因片段CXCR4，同时用AvrII和SnaBI酶切实施例3中获得的pPIC9KH1，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶法分别纯化、回收936bp和9300bp左右的片段。用Gibco-BRL公司(洛克维尔，马里兰州，美国)的连接酶(5u/μl)连接上述获得的两种酶切产物。具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。上述连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。其构建过程如图7所示。经测序表明CXCR4-H1融合基因的序列如SEQ ID NO.：7所示。
实施例6  含有融合基因CCR5-H124的重组体pPIC9K-CCR5-H124的构建
1、CCR5基因片段的扩增
含基因CCR5的pPIC9重组质粒为模板，以如下引物经PCR扩增人CCR5的N端的编码序列，所用引物如下：
上游引物序列：5′-GTAGATTATCAAGTGTCAAGTCCAAT-3′
下游引物序列：5′-CTTCCTAGGCCCGACAAAGGCATAGATGATG-3′
                      AvrII
PCR反应条件为：94℃变性3分钟后开始循环：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分钟。经35个循环后，72℃延伸5分钟，4℃5分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以1％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到912bp左右的DNA片段。
2、pPIC9K-CCR5-H1融合基因的构建和测序
AvrII酶切步骤1中回收的基因片段CCR5，同时用AvrII和SnaBI酶切pPIC9KH1，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶法分别纯化、回收912bp和9300bp左右的片段。用Gibco-BRL公司(洛克维尔，马里兰州，美国)的连接酶(5u/μl)连接上述获得的两种酶切产物。具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。上述连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。其构建过程如图8所示。经测序表明CCR5-H1融合基因的序列如SEQ ID NO.：8所示。
实施例7  融合基因CD4V1V2-H1、CXCR4-H1和CCR5-H124在甲醇营养型酵母中的表达
1、表达载体的线性化及酵母的转化
所用表达载体为实施例4、5、6制备的pPIC9K-CD4V1V2-H1、pPIC9K-CXCR4-H1及pPIC9K-CCR5-H124，酵母为巴氏毕赤酵母KM71。KM71(黄秉人教授惠赠)是aox-1缺陷型巴氏酵母株，其AOX1基因被野生型ARG4基因插入破坏，基因型为ARG4HIS4(缺陷型)AOX1∷ARG，所有转化子均为Muts。
质粒转化酵母细胞前需经线性化处理。线性化表达载体进入巴氏酵母后，外援基因表达单元可以分别在基因组的his4位点或5‘AOX1位点通过单交换插入酵母染色体产生Mut+(Methanol Utilization Plus)酵母株，也可在AOX1位点通过双交换插入酵母染色体产生Muts酵母株。整合后，表达质粒上的his4替换了酵母宿主细胞基因组上原有的缺陷型his4基因，使酵母株表型转变为HIS+，能在组氨酸(HIS)缺陷的MD培养基上生长。染色体中没有外援基因整合的酵母细胞则不能在HIS缺陷的培养基中生长。因此，转化产物首先需涂布于MD培养基上，以筛选由外援基因整合的转化子。
具体地，酵母细胞的转化方法如下：
(1)转化质粒的准备
取2-3μg大量制备并纯化的质粒DNA，用SalI或BglII(TaKaRa公司)进行单酶切。去少量酶切反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，确证酶切完全。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，70％乙醇脱盐后于超净台无菌条件下晾干备用。
酵母表达载体线性化常用酶：
SalI：于HIS4位点插入基因组。(SMD1168，Mut+或KM71，Muts)
BglII：于AOX1位点取代(SMD1168，Muts)
本发明优选使用SalI。
(2)电转
a.取冷冻的毕赤酵母菌种划线于YPD板，30℃培养2-3天。条取单个菌落接种，于5ml YPD，30℃剧烈振荡(大于200rpm)培养过液。以1/1000-1/1500转接量接种于50ml YPD，再一次培养过夜，至OD600＝1.3-1.5。
b.4℃ 1500g离心5分钟收集细胞。用40ml冰冷的无菌去离子水沉淀。同样条件离心5分钟收集细胞。
c.20ml冰冷的无菌去离子重复上述操作一次。
d.重悬细胞于20冰冷的1mol/L山梨醇溶液中，放置冰上备用。
e.细胞沉淀重悬于400μl冰冷的1mol/L山梨醇溶液中，放置冰上备用。
f.取1.5ml Eppendorf管，每管加入40μl制备好的细胞。分别加入3-5μg线性化的质粒DNA。混匀后转入冰冷的电转杯中，冰浴5分钟以上。
g.设置电穿孔仪以产生7500V/cm，4-5ms的电脉冲。使用Bio-Rad产品是的具体设置为电压1500V，电容25uF，电阻200Ω。电击后立即在电转杯中加入0.8ml冰冷的1mol/L山梨醇，混匀。
h.细胞混悬液涂布于MD培养基上，每个9cm直径平板涂300μl，15cm平板涂600μl。30℃培养至转化子出现。
2、分泌表达目的蛋白的阳性转化子的筛选
挑取在MD培养基上生长的His+转化子于500ml离心管中进行小量培养诱导，以筛选分泌表达目的蛋白的阳性酵母株。诱导3-4天后，离心收集培养上清进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白的表达情况。
各挑取20个KM71/pPIC9K-CD4V1V2-H1、KM71/pPIC9K-CXCR4-H1及KM71/pPIC9K-CCR5-H124的His+转化株进行筛选，分别得到2、2、4个有CD4V1V2-H1分泌表达的转化株。其中，在表达株KM71/CD4V1V2-H1培养上清经SDS-PAGE分析显示，在约30KD处有蛋白带出现，比理论氨基酸序列推算分子量大，考虑由糖基化修饰所致。杂蛋白大多在43KD以上，目的蛋白附近并没有明显杂蛋白带。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白占培养基总蛋白的11％，粗略计算表达量为13mg/L。用同样的方法，对高表达株KM71/pPIC9K-CXCR4-H1和KM71/pPIC9K-CCR5-H124的培养上清进行SDS-PAGE分析显示，分别在约47KD和40KD处有蛋白带出现，比理论推算分子量大，可能由糖基化修饰所致。而pPIC9K空载体相应的位置没有相应的目的条带，经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白占培养上清中总蛋白的6％和8％，粗略计算表达量为8mg/L和10mg/L。
实施例8  融合蛋白的大量制备与纯化
1、大体积培养
将实施例7中获得的菌种接种于2ml BMGY培养基中，30℃剧烈振荡培养过夜后接种于200～500ml BMGY培养基中，培养至OD600＝2-5(约需36小时)。室温3000g离心10分钟收集菌体，换入相应于原体积1/4或1/5的BMMY培养基，30℃诱导培养3～5天，每天补加甲醇至1％，同时加入适当的灭菌去离子水补充蒸发掉的水分。4℃ 6000g离心10分钟收集上清，菌体可重悬于新鲜的BMMY进行第二次甲醇诱导培养。大体积培养时，特别是在甲醇诱导时，要注意通风和温度，所以培养体积不应超过摇瓶体积的1/8，瓶口用两层纱布罩住，控制摇床转速在200-250rpm，温度28-30℃，不得超过30℃。
2、培养上清的处理
收集摇瓶大规模培养诱导后的工程酵母菌培养液，6000g离心后收集培养上清液，于上清液中加入蛋白酶抑制剂PMSF以保护蛋白不被降解，每30ml培养上清液加入300μl PMSF。培养上清液经0.4μm的滤膜过滤处理后，装入透析袋中对水透析2天。注意透析袋留出一半空间，并尽可能排除其中的空气。最初每1小时更换一次透析外液，4小时以后，2～4小时更换一次外液。透析结束后，将装有培养上清液的透析袋置于20mm的培养皿中，在其外面撒适量的8000或10000PEG，于4℃冰箱中浓缩。浓缩液收集至50ml离心管中，加入5倍体积的冰冻丙酮，混匀后于-20℃沉淀蛋白12小时。10000r/min离心蛋白沉淀，蛋白用氮气吹干后，用灭菌去离子溶解，加入2×样品缓冲液，100℃加热3～5分钟，上样12％～15％PAGE凝胶进行电泳。一时不用的蛋白沉淀保存于-20℃冰箱中。
3、从PAGE凝胶中回收目的蛋白
a.凝胶切割：SDS-PAGE电泳后，切下蛋白Marker泳道所在的胶条和少部分样品胶条，将其放入快速染色液中速染15分钟，剩余凝胶用保鲜膜包好置于4℃冰箱。速染的胶条脱色显出条带后，将胶条与剩余的凝胶对比，切下含目的带部分的凝胶条。
b.电洗脱：将切下的凝胶条装入透析袋中并置于水平电泳槽中，加入蛋白电泳缓冲液进行电泳。电泳2～4h后反向电泳5分钟。将透析袋中的缓冲液倒入50ml离心管中，并转入另一透析袋对去离子水透析1天。透析后的溶液转入另一灭菌的干净50ml离心管中
c.痕量SDS的去除：在离心管中加入5倍体积以上的冰冻酸性丙酮-甲醇蛋白沉淀液，20℃沉淀过夜。10,000r/m离心10分钟，去掉上清收集沉淀。将收集的沉淀用蛋白沉淀液洗涤1次。
d.蛋白沉淀的保存：用氮气吹干蛋白沉淀。沉淀干粉置-20℃冰箱可保存1个月。
实施例9  靶向基因药物CCR5-H124或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1+pCMV-PEIIImut的制备及其对SIV感染的CEMX-174的杀伤作用
1、表达型重组体pCMV-PEIIImut分别与蛋白CDV1V2-H1、CXCR4-H124、CCR5-H124的电荷数及质量比
1.1表达型重组体pCMV-PEIIImut和蛋白CDV1V2-H1电荷数及质量比
表达型重组体pCMV-PEIIImut(见实施例1)共有6142bp，其中A+T＝2854，G+C＝3288。根据美国PE公司的DNA分子量计算公式：
MW＝A×312+C×288+G×328+T×303-61
该质粒的分子量为3780557。其所含负电荷数为：2×6142＝12284。其质量电荷比为307.76
蛋白CD4V1V2-H1来自酵母系统，其分子量为28955 Dalton，静电荷数为40，其质量电荷之比应为723.88。
根据电荷相等结合的原则，蛋白质CD4V1V2-H1和表达型重组体pCMV-PEIIImut的质量之比应为：2.35∶1，但考虑到蛋白质的纯度，将此比例定为：2.5∶1。
1.2表达型重组体pCMV-PEIIImut和蛋白CXCR4-H1电荷数及质量比
同样地，蛋白质CXCR4-H1也来自酵母表达系统，其分子量为44409 Dalton，静电荷为40，其质量电荷之比应为1110.23。根据电荷相等结合的原则，融合蛋白CXCR4-H1与表达型重组体pCMV-PEIIImut的质量之比应为3.61∶1，但考虑到蛋白质的纯度等因素，将此比例定为4∶1。
1.3表达型重组体pCMV-PEIIImut和蛋白CCR5-H124电荷数及质量比
同样地，蛋白质CCR5-H124也来自较酵母表达系统，其分子量为37207.55 Dalton，静电荷为21，其质量电荷之比应为1771.79。根据电荷相等结合的原则，融合蛋白CCR5-H124与表达型重组体pCMV-PEIIImut的质量之比应为5.76∶1，但考虑到蛋白质的纯度等因素，将此比例定为6∶1。
2、靶向基因药物(即转染复合物)的制备：
本实施例所用融合蛋白CCR5-H124或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1(见实施例8)既作为靶向蛋白，又作为DNA结合蛋白；所用质粒DNA为实施例1的毒素基因表达载体pCMV-PEIIImut。由于H1富含带正电的赖氨酸，将与带负电性的DNA分子结合，从而使整个复合物分子整体电性趋近于中性，在琼脂糖电泳上表现出电泳迁移率滞后的现象。
具体地，用PIERCE公司(Rockford，伊利诺易州，美国)的蛋白质定量试剂盒分别对上述三种融合蛋白CCR5-H124、CD4V1V2-H1和CXCR4-H1进行定量测定。具体方法按照试剂盒提供的方法进行。再以紫外吸收法测定所制备的pCMV-PEIIImut质粒的浓度。分别将蛋白质和DNA溶于适量无血清的1640培养基，制备蛋白质-DNA复合物。具体如下：
将10μg的表达型重组体pCMV-PEIIImut分别和60、25、40μg的CCR5-H124、CD4V1V2-H1和CXCR4-H1溶于2ml 1640培养基中，在室温下放至4小时，让它们结合。然后，放置4℃过夜。将此蛋白和DNA结合产物用0.8％的琼脂糖电泳进行检测(同时用牛血清白蛋白代替融合蛋白，作对照试验)。紫外灯下观察，可见上述三种蛋白质和DNA的结合明显。
将制备的蛋白质-DNA复合物以0.22μm滤膜过滤除菌，进行以下试验。转染前在混合物中加入1％的胎牛血清。
3、培养基中的正常和被感染的CEMX-174细胞形态
细胞培养基中不含有融合蛋白CCR5-H124和/或CD4V1V2-H1和/或CXCR4-H1与表达型重组体pCMV-PEIIImut的结合物。细胞呈正常状态生长，呈圆形或卵圆形，边缘整齐，细胞内的结构清晰，折光性好，如图9a所示。
感染对照组为经SIV感染后的CEMX-174细胞。显微镜下观察发现，被感染的细胞占75％左右，被感染的细胞呈不规则状，如梭形，皱纸团状等，特征性改变为多个细胞发生融合，形成合胞体细胞；细胞膜发生破裂或皱缩，有时细胞质内见到空泡，严重时细胞的亚结构破坏甚至消失，细胞的折光性差，如图9b所示。
4、毒素基因的转染、表达以及对感染细胞的杀伤作用
4.1模式细胞的制备：
本试验所使用的模式细胞为CEMX-174细胞株(中国医学科学院试验动物研究所病毒室)。具体地，将液氮保存的CEMX-174细胞复苏，转接于含10％胎牛血清(天津三利公司，天津)的1640培养基(Gibco-BRL公司，洛克维尔，马里兰州，美国)的100ml的培养瓶中，37℃、5％CO2的培养箱中培养，48小时后换液，随后在培养液中加入病毒滴度大于5120的SIV，来感染CEMX-174细胞。由于该细胞易于被感染且效率高，所以每隔6-8小时在显微镜下观察细胞被感染情况，包括被感染细胞的百分率以及细胞的形态改变等。通常在加入病毒3-5天后(视加入的病毒量而定)，即可达70％以上的感染率。本实验所使用的模式细胞(CEMX-174细胞)的被感染率为75.8％。在病毒感染72小时后，轻轻弃去上层的培养液，再补加新鲜的培养液，充分混悬细胞，计数细胞数，调整细胞浓度在4×105cells/ml。
4.2实验分组与实施
本实验分7组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA复合物又分三个剂量，即2、4、6微克。7组分别为：A1.感染对照组，为受SIV感染的CEMX-174细胞，用作观察CEMX-174细胞在感染状态下的生长情况；B1.pCMV-PEIIImut组；C1.CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut组；D1.CD4V1V2-H1/pCMV-PEIIImut组；E1.CCR5-H124/pCMV-PEIIImut；F1.(C1+D1)组合；G1.(D1+E1)组合。本实验所使用的培养板为灭菌的一次性24孔细胞培养板(Costar公司，哥本哈根，丹麦)，每孔加入的细胞数为2.0×105/ml，即0.5ml细胞悬液。
转染24小时后，于显微镜下观察细胞生长情况。CCR5-H124或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut复合物处理组的细胞生长状况明显劣于其它各组细胞，细胞数相对较少，出现许多死亡细胞。吸取少量上清进行病毒滴度检测(见实施例11)。48小时后计数存活细胞数。用血球计数器观察计数各孔的存活细胞数。同时取少量细胞涂片作荧光染色，观察被感染细胞的情况(见实施例12)。所得各孔存活细胞数进行方差分析和T检验(T-Test)分析，结果显示，以感染对照组中存活细胞数作对照，计算出各转染复合物对CEMX-174细胞的杀伤率。杀伤百分率(％)＝{(实验组平均细胞数×实验组荧光细胞百分率)÷(对照组平均细胞数×对照组荧光细胞百分率)}×100。
5、加入各处理因素后各组的细胞计数的统计结果
如图9c、9d和9e所示，与感染对照组相比，在细胞培养基中加入融合蛋白-表达型重组体pCMV-PEIIImut结合产物的各组，细胞数显著减少(p＜0.05)。细胞减少的数量随复合物浓度的增加而加剧。此结果表明，这三种融合蛋白-质粒复合物可以显著杀伤被SIV感染的CEMX-174细胞，并具有剂量依赖性。详细数据如表1所示。
表1.CD4V1V2-H1/pCMV-PEIIImut、CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut和CCR5-H124/pCMV-PEIIImut复合物对SIV感染的CMEX-174细胞的杀伤与病毒滴度试验结果(n＝12，x±SD) 分 组 剂 量 μg 细胞数 ×104cell/ml 存活细胞数及其％× 104/ml 荧光细胞数及其％(每 500个细胞) 杀伤 率％ 滴度 A1 19.3±0.9 14.6±0.7，100 381±7.3，76.2±1.5 1∶5120 B1 2 19.0±1.3 14.2±1.0，98.4 372±8.0，74.4±1.6 1∶5120 4 19.3±1.0 14.6±0.8，100 361±6.5，72.2±1.3 1∶5120 6 19.3±1.2 14.6±0.9，100 368±8.4，73.6±1.7 1∶5120 C1 2 13±1.4 6.64±0.8*，67.4 218±7.2*，43.6±1.4*42.8 1∶640 4 11.7±1.3 5.37±0.6*，60.6 186±6.4*，37.2±1.3*51.2 1∶320 6 10.3±0.7 4.17±0.3*，53.4 139±4.2*，35.6±0.8*63.5 1∶320 D1 2 13.7±1.3 7.37±0.7*，71 205±3.7*，41±0.7*46.2 1∶640 4 12.7±1.2 6.33±0.6*，65.8 182±3.9*，36.4±0.8*52.2 1∶640 6 9.7±1.6 3.70±0.6*，50.3 144±5.0*，28.8±1.0*62.2 1∶320 E1 2 15±1.1 8.83±0.6*，77.7 255±7.7*，51±1.5*33.1 1∶1280 4 12.3±0.8 6.95±0.4*，63.7 224±6.4*，44.8±1.3*41.2 1∶640 6 10.7±1.4 4.49±0.6*，55.4 197±3.7*，39.4±0.7*48.3 1∶640 F1 2 15.3±1.0 9.19±0.5*，79.2 182±4.3*，36.4±  0.9*52.2 1∶320 4 12.7±1.2 6.33±0.6*，65.8 151±3.2*，30.2±  0.6*60.4 1∶320 6 9.7±0.8 3.70±0.3*，50.3 107±3.3*，21.4±0.7*71.9 1∶160 G1 2 15±1.4 8.83±0.8*，77.7 201±5.5*，40.2±1.1*47.2 1∶640 4 13±0.9 6.64±0.5*，55.4 188±4.7*，37.6±0.9*50.7 1∶320 6 10.3±1.7 4.17±0.9*，53.4 145±3.8*，29±0.8*61.9 1∶320
说明：
1、每组有3个平行孔，每个孔计数4次细胞，共12次(n＝12)，以减少孔间误差。
2、剂量列中的数值2、4、6μg，以DNA计，同时还包括相应的蛋白质。
3、显著性水准为*p＜0.05。分别与感染对照组比较。
4、数值计算方法，见相应的实施例。
CD4V1V2-H1/pCMV-PEIIImut复合物的2、4、6μg三个剂量组的细胞存活相对于空白对照均明显的减少(p＜0.05)。CCR5-H124/pCMV-PEIIImut、CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut、以及CD4V1V2-H1/CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut、CD4V1V2-H1/CCR5-H124/pCMV-PEIIImut等的三个剂量组与空白对照组相比，存活细胞也显著减少(p＜0.05)，其中CCR5-H124/pCMV-PEIIImut复合物各剂量转染组与CD4V1V2-H186/CCR5-H124/pCMV-PEIII复合物的2μg和4μg DNA剂量转染组的细胞存活数各自相近，后者略低于前者，而CD4V1V2-H186/CCR5-H124/pCMV-PEIIImut复合物的6μg DNA剂量转染组的存活细胞数为1.072×105，明显小于其它各组。
由于所用的CEMX-174细胞在感染组中有约75.8％的细胞感染了SIV，故实际上所用的细胞是正常细胞和SIV感染细胞的混合物，根据正常细胞组的转染结果可知，正常细胞并不受转染复合物的影响。为了更明确地了解所用毒素基因转移系统在多大程度上影响了被SIV感染的细胞的生长，有必要排除正常细胞的遮蔽作用。在此以24.2％的百分含量计算出空白对照组中的正常细胞数，以之作为正常细胞的标准含量，从各组存活细胞数中减去该标准数，得到实际上感染了SIV病毒的细胞(CEMX-174/SIV)的存活数。进一步以空白对照的CEMX-174/SIV存活细胞数作对照，计算出各转染复合物对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率。该数据能更明显地显示出细胞生长所受到的影响。所得数据显示，2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/pCMV-PEIIImut对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率约为46.2％、52.2％、62.2％；三种剂量的CCR5-H124/pCMV-PEIIImut对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率约分别为33.1％、41.2％、48.3％；三种剂量的CXCR4-H186/pCMV-PEIIImut对感染细胞的杀伤率分别为42.8％、51.2％、63.5％；联用组2μg、4μg、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CCR5-H124/pCMV-PEIIImut复合物对CEMX-174/SIV的杀伤率分别为47.2％、50.7％和61.9％。联用组2μg、4μg、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut复合物对CEMX-174/SIV的杀伤率分别为52.2％、60.4％和71.9％。
实施例10  靶向基因药物CCR5-H124或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1+pCMV-PEIIImut的制备及其对SIV感染的CEMX-174细胞和游离SIV的中和作用
1、靶向基因药物(即转染复合物)的制备
制备方法同实施例9中的步骤1。
2、靶向基因药物(即转染复合物)的制备
制备方法同实施例9中的步骤2。
3、培养基中的正常和被感染的CEMX-174细胞形态
制备方法同实施例9中的步骤3。
4、毒素基因的转染、表达以及对被感染的CEMX-174细胞和SIV的中和作用
4.1模式细胞的制备：
本试验所使用的模式细胞为CEMX-174细胞株(中国医学科学院试验动物研究所病毒室)。具体地，将液氮保存的CEMX-174细胞复苏，转接于含10％胎牛血清(天津)的1640培养基(Gibco-BRL公司，洛克维尔，马里兰州，美国)的100ml的培养瓶中，37℃、5％CO2的培养箱中培养，24小时后观察细胞的生长情况，并计数细胞，48小时后换液，继续培养，至细胞数为106cells/ml。弃上清，加入新鲜的培养基，调整细胞浓度至4×105cells/ml。
4.2试验分组与实施
本实验分8组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA复合物又分三个剂量，即2、4、6微克。8组分别为A2.正常对照组，正常对照组为不加任何处理因素(如SIV和各种蛋白质-DNA复合物)的CEMX-174细胞组，用作正常生长对照；B2.感染对照组，SIV+CEMX-174细胞；C2.SIV+CEMX-174细胞+pCMV-PEIIImut组；D2.SIV+CEMX-174细胞+CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut组；E2.SIV+CEMX-174细胞+CD4V1V2-H1/pCMV-PEIIImut组；F2.SIV+CEMX-174细胞+CCR5-H124/pCMV-PEIIImut；G2.(D2+E2)组合；H2.(E2+F2)组合物。本实验所使用的培养板为灭菌的一次性24孔细胞培养板(Costar公司，哥本哈根，丹麦)，每孔加入的细胞数为2.0×105/ml，即0.5ml细胞悬液。然后按照需要分别加入0.5ml分别含有2、4、6μg质粒DNA与相应融合蛋白所形成的复合物的溶液，充分混匀。然后，每孔分别加入0.5ml含有SIV的病毒液，置于二氧化碳孵箱中(95％空气，5％CO2)于37℃孵育，48小时后，观察细胞生长情况，并换液。
7天后，于显微镜下观察细胞生长情况，CCR5-H124或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut复合物处理组的细胞生长状况明显好于感染对照组细胞，正常细胞数相对较多，死亡细胞较感染对照组少，如图10b、10c、10d和10e所示。同时用血球计数器观察计数各孔的存活细胞数。所得各孔存活细胞数进行方差分析和T检验(T-Test)分析，结果显示，以感染对照组中存活细胞数作对照，计算出各复合物对CEMX-174细胞的中和作用。所得数据显示，2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H-PEIIImut对SIV的中和作用为25.9％、36.9％、46.6％；2、4、6μg DNA剂量的CXCR4-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为25.0％、32.6％、39.8％；2、4、6μg DNA剂量的CCR5-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为19.2％、30.1％、36.7％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为26.5％、35.2％、43.1％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CCR5-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为21.8％、29.8％、37.6％。细胞实验结果见表2。
表2.CD4V1V2-H1/pCMV-PEIIImut、CXCR4-H1/pCMV-PEIIImut和CCR5-H124/pCMV-PEIIImut复合物对SIV感染的CMEX-174细胞的中和作用的病毒滴度结果(n＝12，x±SD) 分 组 剂 量 μg 细胞数 ×104cell/ml空泡细胞数及其％ 荧光细胞数及其％(每500 个细胞)中和保护率％ 滴度 A 2 120.7±8.70，0 0 1∶5120 B 2 62±3.25.7，9.19 321±5.2，64.0±1.0 1∶5120 C 2 2 67±2.75.3，7.91 307±6.4，61.4±1.3 1∶5210 4 69.3±4.36.3，9.09 313±4.8，62.6±1.0 1∶5120 6 66±3.75.7，8.64 311±5.1，62.2±1.0 1∶5120 D 2 2 82.7±2.43.3，3.99 166±5.3*，33.2±1.1*25.0 1∶640 4 92±3.73，3.26 144±3.6*，28.8±0.7*32.6 1∶640 6 103±4.11.7，1.65 131±5.7*，26.2±1.7*39.8 1∶320 E2 2 83.7±2.9*3.58，4.76 154±6.7*，30.8±1.3*25.9 1∶640 4 98.3±3.8*3.3，3.36 143±3.8*，28.6±0.8*36.9 1∶640 6 116±2.7*2，1.72 122±3.2*，24.4±0.6*46.6 1∶320 F2 2 76.7±3.5*4.3，5.61 17.9±3.1*，35.8±0.6*19.2 1∶1280 4 88.7±2.2*4.0，4.51 157±4.7*，31.4±0.9*30.1 1∶640 6 98.0±4.4*3.0，3.06 149±3.5*，29.8±0.7*36.7 1∶640 G 2 2 84.3±4.3*2.7，3.20 135±3.7*，27±0.7*26.5 1∶640 4 95.7±3.8*1.3，1.36 120±4.9*，24±1.0*35.2 1∶320 6 109±4.9*1.0，0.92 91±5.7*，18.2±1.3*43.1 1∶160 H 2 2 79.3±2.2*3.3，4.16 153±3.0*，30.6±0.6*21.8 1∶640 4 88.3±3.9*2.7，3.06 138±6.3*，27.6±1.3*29.8 1∶640 6 99.3±2.5*2，2.01 121±2.9*，24.2±0.6*37.6 1∶320
说明：
1.每组有3个平行孔，每个孔计数4次细胞，共12次(n＝12)，以减少孔间误差。
2.剂量列中的数值2、4、6μg，以DNA计，同时还包括相应的蛋白质。
3.显著性水准为*p＜0.05。分别与(正常细胞+SIV)组比较。
4.数值计算方法，见相应的实施例。
实施例11  病毒的滴度试验
1、杀伤试验后的病毒滴度试验
取上述实施例9中的各试验组培养孔中的上清进行倍比稀释，按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120、1∶10240的比例用1640培养基进行稀释。每孔含有培养基量为100μ1，再加入100μl正常的CEMX-174细胞，37℃、5％CO2下培养。7天后计数每个孔中被感染的细胞数，最后出现被感染细胞的孔所对应的稀释倍数即为病毒的滴度。结果显示，CXCR4-H1-PEIIImut三个剂量(2、4、6μg)处理组的病毒滴度分别为1∶640、1∶320、1∶320；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三个剂量组的病毒滴度分别为1∶640、1∶640、1∶320；CCR5-H124-PEIIImut组分别为1∶1280、1∶640、1∶640；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为1∶320、1∶320、1∶160；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-PEIIImut的三个剂量组(2、4、6μg)的滴度分别为1∶640、1∶320、1∶320。而对照组的滴毒大于1∶5120，显著的大于上述各试验组。细胞实验结果见表1。
2、中和试验后的病毒滴度试验
取实施例10中的各培养孔中的上清进行倍比稀释，方法同实施例11中的步骤1。计算出病毒的滴度。结果显示：CXCR4-H1-PEIIImut三个剂量(2、4、6ug)处理组的病毒滴度分别为1∶640、1∶640、1∶320；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三个剂量组的病毒滴度分别为1∶640、1∶640、1∶320；CCR5-H1-24-PEIIImut组分别为1∶1280、1∶640、1∶640；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为1∶640、1∶320、1∶160；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-PEIIImut的三个剂量组(2、4、6μg)的滴度分别为1∶640、1∶640、1∶320。而对照组的滴毒大于1∶5120，显著的大于上述各试验组。细胞实验结果见表2。
实施例12  感染细胞的荧光计数
将杀伤试验和中和试验中各培养孔的细胞充分混悬，取1ml细胞培养液，3000rpm离心3分钟，弃上清。再用1ml的PBS洗一次，弃上清，在逐渐加入PBS，混悬细胞，调整细胞浓度为2×105/ml。取15μl混悬液滴加在载玻片上的环内，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分钟，取出晾干，加入gp120的抗体(猴抗SIV抗体，来自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分钟。然后用pH7.2的PBS冲洗，并置于其中浸泡10分钟，其间不断振摇。取出片子后，再加入用万分之二的Evens兰配制的兔抗猴抗体(即二抗)，37℃水浴30分钟，用PBS冲洗，晾干后在荧光显微镜下观察、计数荧光细胞数并拍照。在荧光显微镜下观察被SIV/HIV感染的细胞在蓝色光的激发下发黄色荧光，可以看到细胞周边呈黄色，而未被感染的细胞则不呈黄色，呈暗红色。杀伤试验组结果为(见表1)，CXCR4-H1-PEIIImut三个剂量(2、4、6ug)处理组的荧光细胞百分数分别为43.6％、37.2％、27.8％；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三个剂量组的荧光细胞百分数分别为41.0％、36.4％、28.8％；CCR5-H1-24-PEIIImut组荧光细胞百分数分别为51.0％、44.8％、39.42％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut的荧光细胞百分数分别为36.4％、30.2％、21.4％；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24-PEIIImut的三个剂量组(2、4、6μg)的荧光细胞百分数分别为40.2％、37.6％、29.0％。而感染对照组的荧光细胞的百分率为76.2％。试验组与对照组相比均显著减小(p＜0.05)。
如表2所示，中和试验组的结果分别为：CXCR4-H1-PEIIImut三个剂量(2、4、6μg)处理组的荧光细胞百分数分别为33.2％、28.8％，26.2％；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三个剂量组的荧光细胞百分数分别为30.8％、28.6％、24.4％；CCR5-H1-24-PEIIImut组荧光细胞百分数分别为35.8％、31.4％、29.8％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut的荧光细胞百分数分别为27.0％、24.0％、18.2％；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24-PEIIImut的三个剂量组(2、4、6μg)的荧光细胞百分数分别为30.6％、27.6％、24.2％。而感染对照组的荧光细胞的百分率为76.2％。试验组与对照组相比均显著减小(p＜0.05)。
实施例13  编码CD4V1区的突变基因的人工合成
为了在大肠杆菌中获得高效表达，根据细菌中的密码子偏爱性原则，将人天然状态下的编码CD4V1区的DNA序列中的不是大肠杆菌嗜好的密码子全部换成大肠杆菌嗜好的密码子。具体地，CD4V1原来的序列如SEQ ID NO.：37所示。
经突变后的CD4V1的DNA序列如SEQ ID NO.：3所示。
为了使融合基因能够在宿主菌中从头表达，在CD4V1的DNA序列前添加一个NdeI位点。为了易于与SON进行拼接和重组体的构建，在CD4V1后依次添加KpnI和SacII位点。由于T载体(Promage公司)中含有NdeI和SacII位点各一个，所以在重组体构建时，借助T载体中的这两个位点，以保证重组体中仅有一个NdeI位点。合成的CD4V1的测序结果为：
    CATATGAAAAAAGTAGTTCTGGGTAAAAAGGGTGACACC
GTTGAACTGACTTGCACCGCTTCCCAGAAAAAGTCTATCCAGT
TCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATCAAAATCCTAGGTAACCA
GGGTTCCTTCCTGACCAAAGGTCCGTCTAAACTGAACGATCGT
GCTGACTCCCGCCGTTCTCTATGGGACCAGGGTAACTTCCCGC
TGATTATCAAAAACCTGAAAATCGAAGATTCCGACACCTACAT
CTGTGAAGTTGAAGACCAGAAAGAAGAAGTTCAACTACTGGTT
TTCGGTCTGGGTACCCCGGGC
实施例14  编码XE的突变基因的人工合成
为了在大肠杆菌中获得高效表达，根据细菌中的密码子偏爱性原则，将人天然状态下的编码XE区的DNA序列中的不是大肠杆菌嗜好的密码子全部换成大肠杆菌嗜好的密码子。具体地，XE天然序列如SEQ ID NO.：38所示。
经突变后的XE的DNA编码序列如SEQ ID NO.：15所示。
XE的氨基酸序列如SEQ ID NO.：13所示。
为了使融合基因能够在宿主菌中从头表达，在XE的DNA序列前添加一个NdeI位点。为了易于与SON进行拼接和重组体的构建，在XE后依次添加KpnI和SacII位点。合成的XE装在T载体中。合成的XE的测序结果为：
    CATATGAACGTTTCCGAAGCTGACGACCGTTACATCTGCG
ACCGTTTCTACCCGAACGACCTGTGGGTTGTGGTTTTCCAGTTC
CAGGGTACCCCGCGG
实施例15  含有融合基因RN-SON的表达型重组体的构建
1、技术路线
含有最适密码子的RN-SON基因是通过长片段引物进行拼接的。具体地，首先将天然状态下的RN-SON编码序列突变成最适密码子，然后将该融合基因分成4部分，两两互补，合成下述4条引物。
RN-SON突变后的序列如SEQ ID NO.：34所示。
在合成引物时，考虑到后续工作时的重组体的构建，故在融合基因的5′端添加NdeI酶切位点，而在其下游(3′端)添加双终止密码子TGATAA和BamHI位点。同时从安全角度考虑，在第一条引物的5′端和第四条引物的3′端分别添加两个保护碱基。具体如下：
(1).
5′-GACATATGGACTACCAGGTTTCCAGCCCGATCTACGACATCA
ACTACTACACTTCCGAACCGTGCCAGAAAATCAACGTTAAAC
AGATCGCTGCTCGTAAAG-3′
(2).
5′-GAAGAGTCACGTTTTTTTTCTTTTTCAAATTTGTCACGGTT
TTTGTTTT
TTTTGGATTTTTCGTGAGTGTCTTTAACTTTACGAGCAGCGAT
CTGTTTAAC-3′
(3).
5 ′-GAAAAAGAAAAAAAACGTGACTCTTCCCTGCGTTCTCGTTC
CAAA
CGTTCCAAATCTTCTGAACACAAATCCCGTAAACGTACTTCCG
AATCTCGTTCTCG-3′
(4).
5′-ATGGATCCTTATCAACGGGAACGGGAACGAGTCTGAGAACG
GTGAG
ATTTGGATTTAGAGGAACGTTTACGAGCACGAGAACGAGATT
CGGAAGTACG-3′
2、拼接
通过PCR技术，将上述4条引物进行拼接。首先将第一、二条引物和第三、四引物分别拼接，然后再将上述两种拼接产物拼接，即可获得融合基因。具体步骤如下：
第一步拼接：拼接条件94℃变性35秒，58℃退火40秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟。使用的扩增酶为高保真Pfu。以2.0％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，分别得到180b左右的DNA片段。
第二步拼接：以上述两种拼接产物为模板，再合成一对分别与上述第一、四条引物互补的、长度为20bp左右的引物(上游引物：5′-GACATATGGACTA CCAGGTTTC-3′；下游引物：5′-ATGGATCCTTATCAACGGGAACGGGAACGAGTCTGAG-3′)，目的是为了获得大量的全长的融合基因。
PCR扩增条件为：94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟，4℃5分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以2.0％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到320bp左右的DNA片段。
3、RN-SON融合基因重组体的构建
将2的扩增产物的3′端加A，使用的酶为Taq DNA聚合酶(5u/μl)，加A后的产物与T载体相连。上述连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。载体命名为pT-RN-SON。
4、含有融合基因RN-SON表达型重组体的构建
将5.3所获得阳性克隆的质粒DNA用NdeI和BamHI进行双酶切，纯化回收目的片段(小片段)，同时用NdeI和BamHI双酶切载体pCW111(陈伟京等人，在大肠杆菌中以融合蛋白高效表达基因工程产品人心钠素，中国医学科学院报，2001，23(6)：573-579)，纯化回收大片段。将所获得大、小两片段用连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性的阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。载体命名为pCW-RN-SON，构建过程如图11所示。经测序表明RN-SON融合基因的序列如SEQ ID NO.：33所示。
实施例16  SON基因重组体的构建
以实施例5中的表达载体pCW-RN-SON为模板扩增SON，所用引物如下：
上游引物：5′-CGTTACCAAAGTTAAGGACACTCACGAAAAAAG-3′
下游引物：5′-ATGGATCCTTATCAACGGGAACGGGAACGAGTCTGAG-3′
PCR反应条件为：94℃变性3分钟后开始循环：94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟。使用的扩增酶高保真Pfu。以2.0％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到235bp左右的DNA片段。
加A：利用Taq酶可以自动在DNA的3’端加A的特性，在上述PCR产物后添加A。具体地，使用的Taq DNA聚合酶(5u/μl)为百灵克公司产品，在反应体系中加入0.2mM的dATP，70℃30分钟。将加A后的产物与T载体相连。上述连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与目的基因相符。载体命名为pT-SON。经测序表明编码SON的DNA序列如SEQ IDNO.：20所示。
实施例17  含有融合基因CD4V1-SON表达型重组载体的pCW-CD4V1-SON的构建
1、含有CD4V1-SON融合基因的过渡载体的构建
用NdeI和KpnI分别酶切实施例13中的载体pT-CD4V1，回收目的片段(小片段)，同时用NdeI和KpnI分别酶切实施例16中的载体pT-SON，回收目的片段(大片段)，连接上述大小片段，连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备阳性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。载体命名为pT-CD4V1-SON。经测序表明CD4V1-SON融合基因的序列如SEQ ID NO.：32所示。
2、含有CD4V1-SON融合基因的表达载体的构建
用NdeI和BamHI酶切pT-CD4V1-SON回收目的片段(小片段)，同时用NdeI和BamHI分别酶切pCW111，回收目的片段(大片段)。将上述大、小两个片段用连接酶进行连接，连接产转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备阳性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。载体命名为pCW-CD4V1-SON，其构建过程如图12所示。经测序表明CD4V1-SON融合基因的序列如SEQ ID NO.：32所示。
实施例18  含有融合基因XE-SON表达型重组载体的pCW-XE-SON的构建
用与实施例17相同的方法，可以获得表达型重组体pCW-XE-SON。简述如下：
1、含有XE-SON融合基因的过渡载体的构建
用NdeI和KpnI分别酶切实施例14中的载体pT-XE，回收目的片段(小片段)，同时用NdeI和KpnI分别酶切实施例16中的载体pT-SON，回收目的片段(大片段)，连接上述大小片段，连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备阳性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。载体命名为pT-XE-SON。经测序表明XE-SON融合基因的序列如SEQ ID NO.：33所示。
2、含有XE-SON融合基因的表达载体的构建
用NdeI和BamHI酶切pT-XE-SON回收目的片段(小片段)，同时用NdeI和BamHI分别酶切pCW111，回收目的片段(大片段)。将上述大、小两个片段用连接酶进行连接，连接产转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备阳性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。载体命名为pCW-XE-SON，其构建过程如图13所示。经测序表明XE-SON融合基因的序列如SEQ ID NO.：33所示。
实施例19  融合蛋白CD4V1-SON、XE-SON和RN-SON在大肠杆菌中的表达
1、目的蛋白的表达与鉴定
将工程菌接种于5ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的氨苄青霉素，32℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种两管5mlLB/Amp+培养液。在32℃下振摇培养至OD600约为0.6时。然后分出一管置于42℃摇床，振摇培养诱导5h；另一管继续在32℃振荡培养5h，作为对照。4000g离心收集菌体，加入上样缓冲液(50mmol/LTris-HCl，pH6.8，100mmol/L DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，混匀，置于100℃沸水浴保持5min。10000g离心1min，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。目的蛋白质表达量通过Chromscan3快速凝胶扫描仪于626nm波长处扫描，并计算表达量。详细方法参见参见卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》第二版，365-387页。
2、结果：
经SDS-PAGE分析显示，pCW-CD4V1-SON工程菌所表达的目的蛋白在约18KD处有明显的蛋白带出现，比理论氨基酸序列推算的分子量略小。而对照空载体再相应位置上没有该条带，初步断定为所要的目的蛋白。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白占细胞总蛋白的25％。用同样的方法，对工程菌pCW-XE-SON和pCW-RN-SON所表达蛋白进行SDS-PAGE分析显示，分别在约14KD和15KD处有蛋白带出现，但均比理论推算分子量大，而pCW111空载体相应位置上没有明显带出现。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白分别占细胞总蛋白的21％和14％。
实施例20  融合蛋白的大量制备与纯化
1、大体积培养：
工程菌pCW-CD4V1-SON、pCW-XE-SON和pCW-RN-SON的菌分别种接种于50ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的氨苄青霉素，32℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种于两瓶分别含有500ml LB/Amp+培养液的2L三角瓶中。在32℃下振摇培养至OD600约为0.6时。然后置于42℃继续振摇培养诱导5h。4000g离心、收集菌体，置于-20℃反复冻融。
2、包含体的制备
2.1洗涤细胞：
6000g×15分钟离心收集细菌，称重湿菌体。
用3％Triton X-100洗涤菌体，搅拌器上搅匀30分钟，6000g×15分钟离心收集用量为10ml-50ml缓冲液/1g湿菌体(包括下列各种洗涤缓冲液)。
2.2破细胞
用缓冲液将细胞悬浮，缓冲液配制：50mmol/L Tris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％Triton X-100，溶菌酶1mg/ml)。用搅拌器在室温下搅拌，使得悬浮液因溶菌酶的作用而粘稠。
2.3超声处理
每次超打10秒，间隔15秒，20-50次作用(视菌体浓度而定)，至菌体不再粘稠为止。然后离心收集，6000g×15分钟。上述操作应在冰水中进行，为防止炭化，超声功率不宜过大，在玻璃烧杯中进行较好，超声波探头深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。
2.4 5％Triton X-100洗涤
用缓冲液彻底悬浮沉淀，搅拌并超声波处理30次，参见上述步骤2.3。缓冲液为：50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，2mmol/L EDTA，5％Triton X-100。离心收集沉淀，6000g×15分钟。
2.5包含体的保存与溶解：
2.5.1用少量8M尿素逐渐溶解包含体，取20μl溶液加入2×上样缓冲液，混匀，沸水中煮3-5分钟。取20ul进行SDS-PAGE电泳分析。其余包含体可冻存于-70℃。
2.5.2如果过柱纯化，应按下述步骤操作：用含体溶解液(50mmol/LTris.Cl，pH8.0，2mmol/L EDTA，10mMDTT，7M盐酸胍)溶解包含体，包含体浓度约为10mg/ml。将溶解的包含体12000g离心后，取上清，得到可以上柱的样品溶液。
3、目的蛋白的纯化
取2.3步骤中所制备的包含体溶液，加入等体积2×上样缓冲液中，进行15％的SDS-PAGE电泳。
a.凝胶切割：切下蛋白Marker泳道所在的胶条和少部分样品胶条，将其放入快速染色液中速染15分钟，剩余凝胶用保鲜膜包好置于4℃冰箱。速染的胶条脱色显出条带后，将胶条与剩余的凝胶对比，切下含目的带部分的凝胶条。
b.电洗脱：将切下的凝胶条装入透析袋中并置于水平电泳槽中，加入蛋白电泳缓冲液进行电泳。电泳2～4h后反向电泳5分钟。将透析袋中的缓冲液倒入50ml离心管中，并转入另一透析袋对去离子水透析1天。透析后的溶液转入另一灭菌的干净50ml离心管中
c.痕量SDS的去除：在离心管中加入5倍体积以上的冰冻酸性丙酮-甲醇蛋白沉淀液，20℃沉淀过夜。10,000r/m离心10分钟，去掉上清收集沉淀。将收集的沉淀用蛋白沉淀液洗涤1次。
d.蛋白沉淀的保存：用氮气吹干蛋白沉淀。沉淀干粉置-20℃冰箱可保存1个月。
实施例21  靶向基因药物RN-SON或CD4V1-SON或XE-SON+pCMV-PEIIImut复合物的制备及其对SIV感染的CEMX-174的杀伤作用
1、质粒pCMV-PEIIImut分别与蛋白CDV1-SON、XE-SON、RN-SON的电荷数及质量比
1.1质粒pCMV-PEIIImut和蛋白CDV1-SON电荷数及质量比
质粒pCMV-PEIIImut(见实施例1)共有6142bp，其中A+T＝2854，G+C＝3288。根据美国PE公司的DNA分子量计算公式：
MW＝A×312+C×288+G×328+T×303-61
该质粒的分子量为3780557。其所含负电荷数为：2×6142＝12284。
其质量电荷比为：307.76
蛋白CD4V1-SON来自大肠杆菌系统，其分子量为20218 Dalton，净电荷数为27，其质量电荷之比应为748.81。
根据电荷相等结合的原则，蛋白质CD4V1-SON和质粒pCMV-PEIIImut的质量之比应为：2.43∶1，但考虑到蛋白质的纯度，将此比例定为：2.5∶1。
1.2质粒pCMV-PEIIImut和蛋白XE-SON电荷数及质量比。
同样地，蛋白质XE-SON也来自大肠杆菌表达系统，其分子量为12206 Dalton，净电荷为21，其质量电荷之比应为581.24。根据电荷相等结合的原则，融合蛋白XE-SON与质粒pCMV-PEIIImut的质量之比应为1.89，但考虑到蛋白质的纯度等因素，将此比例定为2∶1。1.3质粒pCMV-PEIIImut和蛋白RN-SON电荷数及质量比
同样地，蛋白质RN-SON也来自大肠杆菌表达系统，其分子量为12216 Dalton，净电荷为24，其质量电荷之比应为509。根据电荷相等结合的原则，融合蛋白RN-SON与质粒pCMV-PEIIImut的质量之比应为1.65∶1，但考虑到蛋白质的纯度等因素，将此比例定为2∶1。
2、靶向基因药物(即转染复合物)的制备：
本实施例所用融合蛋白RN-SON或CD4V1-SON或XE-SON(见实施例22)既作为靶向蛋白，又作为DNA结合蛋白；所用质粒DNA为实施例1的毒素基因表达载体pCMV-PEIIImut。由于SON富含带正电的赖氨酸，将与带负电性的DNA分子结合，从而使整个复合物分子整体电性趋近于中性，在琼脂糖电泳上表现出电泳迁移率滞后的现象。
具体地，用PIERCE公司的蛋白质定量试剂盒分别对上述三种融合蛋白RN-SON、CD4V1-SON和XE-SON进行定量测定。具体方法按照试剂盒提供的方法进行。再以紫外吸收法测定所制备的pCMV-PEIIImut质粒的浓度。分别将蛋白质和DNA溶于适量无血清的1640培养基，制备蛋白质-DNA复合物。具体如下：
将10μg的质粒pCMV-PEIII分别和20、25、20μg的RN-SON、CD4V1-SON和XE-SON溶于2ml 1640培养基中，在室温下放至4小时，让它们结合。然后，放置4℃过夜。将此蛋白和DNA结合产物用0.8％的琼脂糖电泳进行检测(同时用牛血清白蛋白代替融合蛋白，作对照试验)。紫外灯下观察，可见上述三种蛋白质和DNA复合物泳动速度滞后的条带。
将制备的蛋白质-DNA复合物以0.22μm滤膜过滤除菌，进行以下试验。转染前在混合物中加入1％的胎牛血清。
3、培养基中的正常和被感染的CEMX-174细胞形态
细胞培养基中不含有融合蛋白RN-SON和/或CD4V1-SON和/或XE-SON与质粒pCMV-PEIIImut的复合物。细胞呈正常状态生长，呈圆形或卵圆形，边缘整齐，细胞内的结构清晰，折光性好。
感染对照组为经SIV感染后的CEMX-174细胞。显微镜下观察发现，被感染的细胞占75％左右，被感染的细胞呈不规则状，如梭形，皱纸团状等，特征性改变为多个细胞发生融合，形成合胞体细胞；细胞膜发生破裂或皱缩，有时细胞质内见到空泡，严重时细胞的亚结构破坏甚至消失，细胞的折光性差。
4、毒素基因的转染、表达以及对感染细胞的杀伤作用
4.1模式细胞的制备：
本试验所使用的模式细胞为CEMX-174细胞株(中国医学科学院试验动物研究所病毒室)。具体地，首先将液氮保存的CEMX-174细胞复苏，转接于含10％胎牛血清(天津三得利公司)的1640培养基(Gibco-BRL公司，洛克维尔，马里兰州，美国)的100ml的培养瓶中，37℃、5％CO2的培养箱中培养，48小时后换液，随后在培养液中加入病毒滴度大于5120的SIV，来感染CEMX-174细胞。由于该细胞易于被感染且效率高，所以每隔6-8小时在显微镜下观察细胞被感染情况，包括被感染细胞的百分率以及细胞的形态改变等。通常在加入病毒3-5天后(视加入的病毒量而定)，即可达70％以上的感染率。本实验所使用的模式细胞(CEMX-174细胞)的被感染率为75.8％。在病毒感染72小时后，轻轻弃去上层的培养液，再补加新鲜的培养液，充分混悬细胞，计数细胞数，调整细胞浓度在4×105cells/ml。
4.2分组与实施
本实验分7组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA复合物由分为三个剂量，按DNA计，为2、4、6微克。7组分别为A3.感染对照组，为受SIV感染的CEMX-174细胞，用作观察CEMX-174细胞在感染状态下的生长情况；B3.pCMV-PEIII组；C3.XE-SON-pCMV-PEIII组；D3.CD4V1-SON/pCMV-PEIII组；E3.RN-SON/pCMV-PEIIImut；F3.(D3+C3)组合；G3.(D3+E3)组合。本实验所使用的培养板为灭菌的一次性24孔细胞培养板(Costar公司产品，丹麦哥本哈根)，每孔加入的细胞数为2.0×105/ml，即0.5ml细胞悬液。
转染24小时后，于显微镜下观察细胞生长情况。RN-SON或CD4V1-SON或XE-SON/pCMV-PEIIImut复合物处理组的细胞生长状况明显劣于其它各组细胞，细胞数相对较少，出现许多死亡细胞。吸取少量上清进行病毒滴度检测(见实施例22)。48小时后计数存活细胞数。用血球计数器观察计数各孔的存活细胞数。同时取少量细胞涂片作荧光染色，观察被感染细胞的情况(见实施例23)。所得各孔存活细胞数进行方差分析和T检验(T-Test)分析，以感染对照组中存活的被感染细胞数作对照，计算出各转染复合物对CEMX-174细胞的杀伤率。杀伤百分率(％)＝{(实验组平均细胞数×实验组荧光细胞百分率)÷(对照组平均细胞数×对照组荧光细胞百分率)}×100。
5、加入各处理因素后各组的细胞计数的统计结果
与感染对照组相比，在细胞培养基中加入融合蛋白-质粒pCMV-PEIIImut复合物的各组，细胞数显著减少(p＜0.05)。细胞减少的数量随复合物浓度的增加而加剧。此结果表明，这三种融合蛋白-质粒复合物可以显著杀伤被SIV感染的CEMX-174细胞，并具有剂量依赖性。详细的数据见下表4。
CD4V1-SON/pCMV-PEIIImut复合物的2、4、6μg三个剂量组的细胞存活相对于空白对照均明显的减少(p＜0.05)。RN-SON/pCMV-PEIIImut、XE-SON/pCMV-PEIIImut、以及CD4V1-SON/XE-SON/pCMV-PEIIImut、CD4V1-SON/RN-SON/pCMV-PEIIImut等的三个剂量组与空白对照组相比，存活细胞也显著减少(p＜0.05)，其中RN-SON/pCMV-PEIIImut复合物各剂量转染组与CD4V1-SON/RN-SON/pCMV-PEIII复合物的2μg和4μg DNA剂量转染组的细胞存活数各自相近，后者略低于前者，而CD4V1-SON/RN-SON/pCMV-PEIIImut复合物的6μg DNA剂量转染组的存活细胞数为1.93×105cells/ml，明显小于其它各组，结果如表3所示。
由于所用的CEMX-174细胞在感染组中有约75.8％的细胞感染了SIV，故实际上所用的细胞是正常细胞和SIV感染细胞的混合物，根据正常细胞组的转染结果可知，正常细胞并不受转染复合物的影响。为了更明确地了解所用毒素基因转移系统在多大程度上影响了被SIV感染的细胞的生长，有必要排除正常细胞的遮蔽作用。在此以24.2％的百分含量计算出空白对照组中的正常细胞数，以之作为正常细胞的标准含量，从各组存活细胞数中减去该标准数，得到实际上感染了SIV病毒的细胞(CEMX-174/SIV)的存活数。进一步以空白对照的CEMX-174/SIV存活细胞数作对照，计算出各转染复合物对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率(见表3)。该数据能更明显地显示出细胞生长所受到的影响。所得数据显示，2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON/pCMV-PEIIImut对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率约为43％、47.5％、59.1％；三种剂量的RN-SON/pCMV-PEIIImut对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率约分别为35.7％、42.8％、47.2％；三种剂量的XE-SON/pCMV-PEIIImut对感染细胞的杀伤率为：39.4％、43.8％、53.3％；联用组2μg、4μg、6μg DNA剂量的CD4V1-SON/RN-SON/pCMV-PEIIImut复合物对CEMX-174/SIV的杀伤率分别为38.3％、43.8％和57.2％。联用组2μg、4μg、6μg DNA剂量的CD4V1-SON/XE-SON/pCMV-PEIIImut复合物对CEMX-174/SIV的杀伤率分别为43.8％、50.9％和60.9％。
表3 CD4V1-SON/pCMV-PEIIImut、XE-SON/pCMV-PEIIImut、RN-SON/pCMV-PEIIImut复合物对SIV感染的174细胞的杀伤作用结果(n＝12，x±SD) 分 组 剂 量 μg 细胞数 ×104cell/ml 存活细胞数及其％× 104/ml 荧光细胞数及其％(每 500个细胞)杀伤率％ 滴度 A3 19.3±0.9 14.6±0.7，100 381±7.3，76.2±1.5 1∶5120 B3 2 19.0±1.3 14.2±1.0，98.4 372±8.0，74.4±1.6 1∶5120 4 19.3±1.0 14.6±0.8，100 361±6.5，72.2±1.3 1∶5120 6 19.3±1.2 14.6±0.9，100 368±8.4，73.6±1.7 1∶5120 C3 2 14.7±0.8 8.49±0.5*，76.2 231±6.3*，46.2±1.3*39.4 1∶640 4 12.7±1.3 6.33±0.6*，65.8 214±5.4*，42.8±1.1*43.8 1∶320 6 10.0±1.1 3.93±0.4*，51.8 178±4.7*，35.6±0.9*53..3 1∶320 D3 2 13.3±0.7 6.95±0.4*，68.9 217±3.9*，43.4±0.8*43 1∶640 4 11±1.8 4.75±0.8*，57.0 200±3.8*，40±0.8*47.5 1∶320 6 9.3±1.1 3.40±0.4*，48.2 156±4.6*，31.2±0.9*59.1 1∶320 E3 2 15.3±0.6 9.20±0.4*，79.3 245±5.1*，49±1.0*35.7 1∶1280 4 13.3±0.8 6.95±0.4*，68.9 218±4.7*，43.6±0.9*42.8 1∶640 6 10±1.1 3.93±0.4*，51.8 201±4.4*，40.2±0.9*47.2 1∶320 F3 2 12.3±1.3 5.94±0.6*，63.7 214±5.7*，42.8±1.1*43.8 1∶640 4 11.2±1.1 5.0±0.5*，58.5 187±4.0*，37.4±0.8*50.9 1∶320 6 8.7±0.7 2.97±0.2*，45.1 149±4.2*，29.8±0.8*60.9 1∶160 G3 2 14±0.7 7.69±0.4*，72.5 235±6.3*，47±1.3*38.3 1∶640 4 10.7±1.3 4.93±0.5*，55.4 214±3.8*，42.8±0.8*43.8 1∶640 6 9.7±0.7 3.7±0.3*，50.3 163±4.7*，32.6±0.9*57.2 1∶320
说明：
1.每组有3个平行孔，每个孔计数4次细胞，共12次(n＝12)，以减少孔间误差。
2.剂量列中的数值2、4、6μg，以DNA计，同时还包括相应的蛋白质。
3.显著性水准为*p＜0.05。分别与感染对照组比较。
4.数值计算方法，见相应的实施例。
实施例22  靶向基因药物RN-SON或CD4V1-SON或XE-SON+pCMV-PEIIImut的制备及其对游离SIV的中和作用。
因为上述各复合物种分别含有CD4、CXCR4、CCR5的相关片段，它们均具有结合并中和HIV/SIV的功能。
1、靶向基因药物即转染复合物的制备：
制备方法同实施例11中的步骤1。
2、靶向基因药物(即转染复合物)的制备：
制备方法同实施例11中的步骤2。
3、培养基中的正常和被感染的CEMX-174细胞形态
制备方法同实施例11中的步骤3。
4、各组融合蛋白-毒素基因重组体复合物对SIV的中和作用
4.1模式细胞的制备：
本试验所使用的模式细胞为CEMX-174细胞株(中国医学科学院试验动物研究所病毒室)。具体地，将液氮保存的CEMX-174细胞复苏，转接于含10％胎牛血清(天津)的1640培养基(Gibco-BRL公司，洛克维尔，马里兰州，美国)的100ml的培养瓶中，37℃、5％CO2的培养箱中培养，24小时后观察细胞的生长情况，并计数细胞，48小时后换液，继续培养，至细胞数为106cells/ml。弃上清，加入新鲜的培养基，调整细胞浓度至4×105cells/ml。
4.2试验分组与实施
本实验分7组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA复合物分为三个剂量，按DNA计为2、4、6微克。8组分别为A4.正常对照组，正常对照组为不加任何处理因素(如SIV和各种蛋白质-DNA复合物)的CEMX-174细胞组，用作正常生长对照；B4.SIV+CEMX-174细胞组；C4.SIV+CEMX-174细胞+pCMV-PEIII组；D4.SIV+CEMX-174细胞+XE-SON/pCMV-PEIII组；E4.SIV+CEMX-174细胞+CD4V1-SON/pCMV-PEIII组；F4.SIV+CEMX-174细胞+RN-SON/pCMV-PEIIImut；G4.(E4+D4)组合；H4.(E4+F4)组合。本实验所使用的培养板为灭菌的一次性24孔细胞培养板(Costar公司产品，丹麦哥本哈根)，每孔加入的细胞数为2.0×105/ml，即0.5ml细胞悬液。然后按照需要分别加入0.5ml分别含有2、4、6μg质粒DNA与相应融合蛋白所形成的复合物的溶液，充分混匀。然后，每孔分别加入0.5ml含有SIV的病毒液，置于二氧化碳孵箱中(95％空气，5％CO2)于37℃孵育，48小时后，观察细胞生长情况，并换液。
7天后，于显微镜下观察细胞生长情况，RN-SON或CD4V1-SON或XE-SON/pCMV-PEIIImut复合物处理组的细胞生长状况明显好于受SIV感染对照组细胞，正常细胞数相对较多，死亡细胞较感染对照组少。同时用血球计数器观察计数各孔的存活细胞数。所得各孔存活细胞数进行方差分析和T检验(T-Test)分析，以感染对照组中存活细胞数作对照，计算出各复合物对CEMX-174细胞的中和作用。所得数据显示，2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON-PEIII对SIV的中和作用为31.3％、40.4％、46.6％；2、4、6μg DNA剂量的XE-SON-PEIII对SIV的中和作用为29.3％、35.9％、41.1％；2、4、6μg DNA剂量的RN-SON-PEIII对SIV的中和作用为31.6％、37.4％、43.8％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON/XE-SON-PEIII对SIV的中和作用为26.2％、37.4％、42.6％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON/RN-SON-PEIII对SIV的中和作用为27.7％、34.9％、44％。细胞实验结果见表4。
表4 CD4V1-SON/pCMV-PEIIImut、XE-SON/pCMV-PEIIImut、RN-SON/pCMV-PEIIImut复合物对SIV感染的174细胞的中和作用试验结果(n＝12，x±SD) 分 组 剂 量 μg 细胞数 ×104cell/ml空泡细胞数及其％ 荧光细胞数及其％(每500 个细胞)中和保护率％ 滴度 A 4 120.7±8.70，0 0 1∶5120 B 4 62±3.25.7，9.19 321±5.2，64.0±1.0 1∶5120 C 4 2 67±2.75.3，7.91 307±6.4，61.4±1.3 1∶5210 4 69.3±4.36.3，9.09 313±4.8，62.6±1.0 1∶5120 6 66±3.75.7，8.64 311±5.1，62.2±1.0 1∶5120 D 4 2 87.7±4.14，4.56 174±5.6*，34.8±1.1*29.3 1∶640 4 96.7±3.62.7，2.79 166±4.1*，33.2±0.8*35.9 1∶320 6 105.3±4.42，1.90 138±2.9*，27.6±0.6*41.1 1∶320 E4 2 90.3±2.4*4.3，4.76 169±5.4*，33.8±1.1*31.3 1∶640 4 104±3.5*3，2.88 143±3.8*，28.6±0.8*40.4 1∶320 6 116±2.7*2，1.72 129±4.0*，25.8±0.8*46.6 1∶160 F4 2 90.7±5.2*4，4.42 174±3.3*，34.8±0.7*31.6 1∶640 4 99±3.7*3.7，3.74 158±3.7*，31.6±0.7*37.4 1∶640 6 110.3±5.5*2.7，2.45 137±2.9*，27.4±0.6*43.8 1∶320 G 4 2 84±3.3*4，4.76 154±3.0*，30.8±0.6*26.2 1∶640 4 99±4.1*2.7，2.73 136±4.4*，27.2±0.9*37.4 1∶320 6 108±2.9*2.3，2.13 123±3.9*，24.6±0.8*42.6 1∶160 H 4 2 85.7±3.0*3.7，4.32 178±4.3*，35.6±0.9*27.7 1∶640 4 95.3±4.4*3.3，3.46 155±2.4*，31±0.5*34.9 1∶320 6 110.7±3.5*2.3，2.08 137±4.1*，27.4±0.8*44 1∶320
说明：
1.每组有3个平行孔，每个孔计数4次细胞，共12次(n＝12)，以减少孔间误差。
2.剂量列中的数值2、4、6μg，以DNA计，同时还包括相应的蛋白质。
3.显著性水准为*p＜0.05。分别与(正常细胞+SIV)组比较。
4.数值计算方法，保护率＝(实验组-对照组)/实验组×100％。
实施例23  病毒的滴度试验
1.杀伤试验后的病毒滴度试验
取上述实施例19中的各试验组培养孔中的上清进行倍比稀释，按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120、1∶10240的比例用1640培养基进行稀释。每孔含有培养基量为100μl，再加入100μl正常的CEMX-174细胞，37℃、5％CO2下培养。7天后计数每个孔中被感染的细胞数，最后出现被感染细胞的孔所对应的稀释倍数即为病毒的滴度。结果显示，CD4V1-SON-PEIII三个剂量(2、4、6μg)处理组的病毒滴度分别为1∶640、1∶640、1∶320；XE-SON-PEIII的三个剂量组的病毒滴度分别为1∶640、1∶320、1∶320；RN-SON-PEIII组分别为1∶1280、1∶640、1∶320；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON/XE-SON-PEIII对SIV的中和作用为1∶640、1∶320、1∶160；CD4V1-SON/RN-SON-PEIII的三个剂量组(2、4、6μg)的滴度分别为1∶640、1∶640、1∶320。细胞实验结果见表3。
2.中和试验后的病毒滴度试验
取实施例10中的各培养孔中的上清进行倍比稀释，方法同实施例11中的步骤1。计算出病毒的滴度。结果显示：CD4V1-SON-PEIII三个剂量(2、4、6μg)处理组的病毒滴度分别为1∶640、1∶320、1∶160；XE-SON-PEIII的三个剂量组的病毒滴度分别为1∶640、1∶640、1∶320；RN-SON-PEIII组分别为1∶1280、1∶640、1∶320；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON/XE-SON-PEIII对SIV的中和作用为1∶640、1∶320、1∶160；CD4V1-SON/RN-SON-PEIII的三个剂量组(2、4、6μg)的滴度分别为1∶640、1∶320、1∶320。细胞实验结果见表4。
实施例24  感染细胞的荧光计数
将杀伤试验和中和试验中各培养孔的细胞充分混悬，取1ml细胞培养液，3000rpm离心3分钟，弃上清。再用1ml的PBS洗一次，弃上清，在逐渐加入PBS，混悬细胞，调整细胞浓度为2×105/ml。取15μl混悬液滴加在载玻片上的环内，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分钟，取出晾干，加入gp120的抗体(猴抗SIV抗体，来自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分钟。然后用pH7.2的PBS冲洗，并置于其中浸泡10分钟，其间不断振摇。取出片子后，再加入用万分之二的Evens兰配制的兔抗猴抗体(即二抗)，37℃水浴30分钟，用PBS冲洗，晾干后在荧光显微镜下观察、计数荧光细胞数并拍照。在荧光显微镜下观察被SIV/HIV感染的细胞在蓝色光的激发下发黄色荧光，可以看到细胞周边呈黄色，而未被感染的细胞则不呈黄色，呈暗红色。杀伤试验组结果为(见表3)，CD4V1-SON-PEIII三个剂量(2、4、6μg)处理组的荧光细胞百分数分别为43.4％，40.0％，31.2％；XE-SON-PEIII的三个剂量组的荧光细胞百分数分别为46.2％，42.8％，35.6％；RN-SON-PEIII组荧光细胞百分数分别为49.0％，43.6％，40.2％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON/XE-SON-PEIII的荧光细胞百分数分别为42.8％，37.4％，29.8％；CD4V1-SON/RN-SON-PEIII的三个剂量组(2、4、6μg)的荧光细胞百分数分别为47.0％，42.8％，32.6％。而感染对照组的荧光细胞的百分率为76.2。试验组与对照组相比均显著减小(p＜0.05)。
中和试验组的结果分别为(见表4)：CD4V1-SON-PEIII三个剂量(2、4、6μg)处理组的荧光细胞百分数分别为33.8％、28.6％、25.8％；XE-SON-PEIII的三个剂量组的荧光细胞百分数分别为34.8％、33.2％、27.6％；RN-SON-PEIII组荧光细胞百分数分别为34.8％、31.6％、27.4％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON/XE-SON-PEIII的荧光细胞百分数分别为30.8％、27.6％、24.6％；CD4V1-SON/RN-SON-PEIII的三个剂量组(2、4、6μg)的荧光细胞百分数分别为35.6％、31.0％、27.4％。而对照组的荧光细胞的百分数为64.2％。统计分析显示，上述各试验组与对照组相比，荧光细胞的百分数均显著降低(p＜0.05)。说明上述融合蛋白与pCMV-PEIII的复合物，对游离的SIV/HIV具有显著的中和作用，并对被SIV/HIV感染的细胞具有杀伤作用。
实施例25  重组质粒PDYP-1-PEIIImut的构建
在实施例2中构建的pYL-PEIIImut质粒的基础上，用SalI和EcoRV进行双酶切，得到一粘和一平的大片段并对其回收，同时在pLHY16(4220bp)的质粒中用SalI和SmaI切取Intron片段(640bp)，将这个640bp的片断与pYL-PEIIImut大片段连接，转化获得pDYP-PEIIImut，其构建过程如图14所示。
实施例26  含有融合基因XE-RN-SON表达型重组载体的pCW-XE-RN-SON的构建
在实施例18中构建的pCW111-XE-SON的基础上，用KpnI和BamHI(TaKaRa公司)酶切pCW111-XE-SON质粒并回收目的大片段，同时用KpnI和BamHI分别酶切pT-RN-SON，回收目的小片段。将上述大、小两个片段用连接酶进行连接，连接产转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备阳性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。载体命名为pCW-XE-RN-SON，其构建过程如图15所示。其正确序列图如图16所示。
经测序表明融合基因pCW-XE-RN-SON的序列如SEQ ID NO.：35所示。
实施例27  融合基因pCW-XE-RN-SON在大肠杆菌中的表达
1、目的蛋白的表达与鉴定
将工程菌接种于5ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的氨苄青霉素，32℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种两管5mlLB/Amp+培养液。在32℃下振摇培养至OD600约为0.6时。然后分出一管置于42℃摇床，振摇培养诱导5h；另一管继续在32℃振荡培养5h，作为对照。4000g离心收集菌体，加入上样缓冲液(50mmol/LTris-HCl，pH6.8，100mmol/L DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，混匀，置于100℃沸水浴保持5min。10000g离心1min，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，其电泳图谱如图9所示。目的蛋白质表达量通过Chromscan3快速凝胶扫描仪于626nm波长处扫描，并计算表达量。详细方法参见参见卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》第二版，365-387页。
2、结果：
经SDS-PAGE分析显示，工程菌pCW-XE-RN-SON所表达蛋白进行SDS-PAGE分析显示，分别在约22KD处有蛋白带出现，但比理论推算的16KD分子量大，而pCW111空载体相应位置上没有明显带出现。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白分别占细胞总蛋白的13-15％。只所以目的带分子量与理论计算的分子量大，可能是由于目的蛋白还有较多的阳性氨基酸，带有较多的正电荷，等电点为11左右，在电泳迁移的过程中较为缓慢。纯化后测定其分子量和氨基酸序列，经过飞行质谱检测发现，处于22KD左右的明显条带分子量为15.703K，其飞行质谱如图17所示。证明该条带确实是目的带。经过对融合蛋白N-末端15个氨基酸序列进行测定发现，该目的带的氨基酸序列与理论预测的序列完全一致，结果如图18所示。
实施例28  融合蛋白pCW-XE-RN-SON大量制备与色谱纯化
1、大体积培养：
工程菌pCW-XE-RN-SON接种于5ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的氨苄青霉素，32℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种于两瓶分别含有500ml LB/Amp+培养液的2L三角瓶中。在32℃下振摇培养至OD600约为0.6时。然后置于42℃继续振摇培养诱导5h。4000g离心、收集菌体，置于-20℃反复冻融。
2、包含体的制备
2.1洗涤细胞：
6000g×15分钟离心收集细菌，称重湿菌体。
用3％Triton X-100洗涤菌体，搅拌器上搅匀30分钟，6000g×15分钟离心收集用量为10ml-50ml缓冲液/1g湿菌体(包括下列各种洗涤缓冲液)。
2.2破细胞
用缓冲液将细胞悬浮，缓冲液配制：50mmol/L Tris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％Triton X-100，溶菌酶1mg/ml)。用搅拌器在室温下搅拌，使得悬浮液因溶菌酶的作用而粘稠。
2.3超声处理
每次超打10秒，间隔15秒，20-50次作用(视菌体浓度而定)，至菌体不再粘稠为止。然后离心收集，6000g×15分钟。上述操作应在冰水中进行，为防止炭化，超声功率不宜过大，在玻璃烧杯中进行较好，超声波探头深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。
2.4 5％Triton X-100洗涤
用缓冲液彻底悬浮沉淀，搅拌并超声波处理30次，参见上述步骤2.3。缓冲液为：50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，2mmol/L EDTA，5％Triton X-100。离心收集沉淀，6000g×15分钟。
2.5包含体的保存与溶解：
用少量7M尿素逐渐溶解包含体，取20μl溶液加入2×上样缓冲液，混匀，沸水中煮3-5分钟。取20ul进行SDS-PAGE电泳分析。其余包含体可冻存于-70℃。
3、目的蛋白的纯化
包含体用7MGnCL或8M尿素溶解后，静止过夜。本发明拟利用反向柱进行第一步纯化，然后收集高蛋白峰进行第二步阳离子交换柱纯化。在第一步反向柱纯化过程中，通过梯度洗脱发现该蛋白的洗脱峰在30％左右，因此收集该峰并进行冻干。将冻干样品溶解于生理盐水中，0.22μm过滤膜后电泳以观察该重组蛋白的溶解情况，电泳发现该蛋白能够完全溶解于生理盐水中，当含有杂蛋白时，会出现乳白色沉淀。阳离子柱交换层析后，收集峰电泳后银染观察发现没有杂蛋白出现，然后将收集到的蛋白冻干后放置于-20℃
3.1反向柱纯化融合蛋白
层析注：Waters AP-1空柱自填6ml Sourcel 5RPC树脂；
起始缓冲液RA：10％乙睛，0.05％TFA；
洗脱缓冲液RB：90％乙睛，0.05％TFA；
样品：每次上样2ml；
流速：2ml；
梯度：0-100％，15min
收集：目的蛋白主要在30％RB处被洗脱；收集目的蛋白峰并冻干过夜，反向柱纯化图谱如图11所示，相应的电泳图谱如图12所示。
3.2目的蛋白的阳离子柱层析
由于该重组蛋白的等电点在11左右，采用阳离子交换层析是非常合适的选择。本实验共实验了三种缓冲体系：即柠檬酸缓冲体系(PH2.5-6.2)；磷酸缓冲体系(PH6.4)和Tris缓冲体系(PH7.4)，相比较而言，磷酸缓冲体系(pH7.5)比较合适。
层析注：RESOURES预装柱；
起始缓冲液RA：0.03M磷酸氢二钠；
洗脱缓冲液RB：0.03M磷酸氢二钠，2M的NaCl；
样品：每次上样10ml；
流速：1ml；
梯度：0-100％，25min
收集：目的蛋白主要在50％RB处被洗脱；收集目的蛋白峰，用透析带透析过夜后，-70℃冻干保存，阳离子柱层析图谱如图19，相应的电泳图谱如图20所示。
经过两相柱纯化后，纯化后的蛋白，进行质谱分析，氨基酸分析以及波谱扫描分析，质谱分析图谱如17所示，氨基酸分析如图18所示。
实施例29  靶向基因药物XE-RN-SON-DNA复合物的制备及其对SIV感染的CEMX-174的杀伤
1、转染复合物的制备
本发明所用融合蛋白中的DNA结合部分为SON片段。所使用的融合蛋白的共同特点为既作靶向蛋白，又作为DNA结合蛋白；所用质粒DNA为毒素基因表达载体pCMV-PEIIImut和pDYP-1。在此根据DNA结合蛋白与质粒DNA所带电荷摩尔数比为1∶1制备转染用复合物。本发明所使用的融合蛋白除了XE-RN-SON蛋白以外，还使用了本研究室已经具有的CD4V1蛋白，以观察两种蛋白协同作用的影响。蛋白质与DNA的电荷计算见表5：
表5：细胞试验所用蛋白和质粒DNA的电荷计算
种类             分子量     长度      净电荷数         质量/电荷    蛋白质/质粒
                 kD         AA
CD4V1-SON        20.22      175       +27              748.81       2.43∶1(2.5∶1)
XE-RN-SON        15.69      132       +21              747.14       2.30∶1(2.3∶1)
PDYP-1           4.48×106D/6900bp    -13,864(净电荷数)
pCMV-PEIIImut   3.99×106D/6142bp    -12,284(净电荷数)
根据蛋白质与质粒DNA所带电荷数推知，转染1μg PDYP-1质粒DNA理论上所需的CD4V1-SON、XE-RN-SON分别为2.43μg、2.3μg。转染1μg pCMV-PEIIImut质粒DNA理论上所需的CD4V1-SON、XE-RN-SON分别为2.43μg和2.3μg。制备转染复合物时，按照上述比例根据转染所需质粒DNA的用量计算所需靶向蛋白质的用量，当联合使用(具体分组见下述)融合蛋白共同介导基因转染时，各蛋白的用量减半，如联合使用CD4V1SON和XE-RN-SON共同介导2μg pDYP-1时，CD4V1-SON和XE-RN-SON各取2.4μg和2.3μg。
取适量的蛋白质溶于含有2μM还原型谷胱苷肽和0.2μM氧化型谷胱苷肽，pH7.0的生理盐水中于室温进行复性，复性液的pH必须大于7.0以上，这样可以防止自由巯基的质子化作用，从而影响正确配对的二硫键的形成。将以上复性后的蛋白产物稀释于RPMI 1640培养基中，然后缓慢滴加至含有质粒DNA(pCMV-PEIIImut或pDYP-1)的RPMI 1640溶液中，以使带正电荷的组分能均匀接近质粒DNA，放置37℃保温60分钟，放4℃过夜后用于转染。转染前在混合物中加入1％的胎牛血清。为了进一步证实蛋白质与DNA的结合，正式实验前将结合产物进行琼脂糖凝胶电泳，看看是否有电泳迁移率滞后现象(见图17)，选择能完全滞留的复合物进行细胞实验。
2、培养基中的正常和被感染的CEMX-174细胞形态
细胞培养基中不含有融合蛋XE-RN-SON与质粒DNA的复合物。细胞呈正常状态生长，呈圆形或卵圆形，边缘整齐，细胞内的结构清晰，折光性好。
感染对照组为经SIV感染后的CEMX-174细胞。显微镜下观察发现，被感染的细胞占75％左右，被感染的细胞呈不规则状，如梭形，皱纸团状等，特征性改变为多个细胞发生融合，形成合胞体细胞；细胞膜发生破裂或皱缩，有时细胞质内见到空泡，严重时细胞的亚结构破坏甚至消失，细胞的折光性差。
3、毒素基因的转染、表达以及对感染细胞的杀伤作用
3.1模式细胞的制备：
本试验所使用的模式细胞为CEMX-174细胞株(中国医学科学院试验动物研究所病毒室)。具体地，首先将液氮保存的CEMX-174细胞复苏，转接于含10％胎牛血清(天津三得利公司)的1640培养基(Gibco-BRL公司，洛克维尔，马里兰州，美国)的100ml的培养瓶中，37℃、5％CO2的培养箱中培养，48小时后换液，随后在培养液中加入病毒滴度大于5120的SIV，来感染CEMX-174细胞。由于该细胞易于被感染且效率高，所以每隔6-8小时在显微镜下观察细胞被感染情况，包括被感染细胞的百分率以及细胞的形态改变等。通常在加入病毒3-5天后(视加入的病毒量而定)，即可达70％以上的感染率。本实验所使用的模式细胞(CEMX-174细胞)的被感染率为75.8％。在病毒感染72小时后，轻轻弃去上层的培养液，再补加新鲜的培养液，充分混悬细胞，计数细胞数，调整细胞浓度在4×105cells/ml。
3.2实验设计与结果
本实验分7组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA复合物又分四个剂量，即1、2、4微克(以DNA量计)。具体分组如下：A6.感染对照组，为受SIV感染的CEMX-174细胞，用作观察CEMX-174细胞在感染状态下的生长情况；B6.XE-RN-SON蛋白组；C6.pDYP-1质粒组；D6.XE-RN-SON/pDYP-1组；E6.XE-RN-SON/pCMV-PEIIImut；F6.XE-RN-SON+CD4V1SON/pDYP-1组合；G6.XE-RN-SON+CD4V1SON/pCMV-PEIIImut组合。本实验所使用的培养板为灭菌的一次性24孔细胞培养板以及96孔细胞培养板(Costar公司产品)
在24孔板中加入稀释好的蛋白或蛋白-DNA复合物，然后加入已被感染的CEMX-174细胞，细胞数为2.0×105/ml细胞数。在这些感染的CEMX-174细胞中，仍然含有部分未感染的正常细胞，细胞的感染率为75.3％，未感染的细胞仍然可以被SIV感染，也可以与已被感染的细胞形成合胞体。48小时后，于显微镜下观察细胞生长情况。吸取20μL上清进行病毒滴度检测。同时取少量细胞涂片作荧光染色，观察被感染细胞的情况。然后每孔加入100μL MTT溶液，4小时后检测剩余活细胞的数目，测定活细胞的OD值。
同样方法进行药物与正常细胞的对照实验。分5组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA复合物又分三个剂量，即1、2、4微克(以DNA量计)。具体分组如下：A5.正常细胞(NC)对照组，为正常的CEMX-174细胞；B5.XE-RN-SON蛋白组+NC；C5.XE-RN-SON+pDYP-1质粒组+NC；D5XE-RN-SON+CD4V1SON/pCMV-PEIIImut组合+NC；E5.XE-RN-SON+CD4V1SON/pDYP-1组合+NC。结果见表6所示。
所得各孔存活细胞数OD值计算杀伤率，并进行方差分析和T检验(T-Test)分析，结果显示，融合蛋白-质粒复合物在单独或联合应用时，对正常细胞没有杀伤作用(p＞0.20)。与感染对照组相比，在细胞培养基中加入融合蛋白-质粒复合物的各组，OD数显著减少(p＜0.05)。细胞减少的数量随复合物浓度的增加而增加。此结果表明，这些融合蛋白-质粒复合物在单独或联合应用时，均可显著地杀伤被SIV感染的CEMX-174细胞，并具有剂量依赖关系。
由于所用的CEMX-174细胞在感染组中有约75％的细胞感染了SIV，故实际上所用的细胞是正常细胞和SIV感染细胞的混合物。根据正常细胞组的转染结果可知，正常细胞并不受蛋白DNA复合物的影响。所得数据显示，1、2、4μg DNA剂量的XE-RN-SON/pDYP-1对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率约为27.91％、37.21％、50.54％；三种剂量的XE-RN-SON/pCMV-PEIIImut对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率约分别为18.45％、39.54％、68.53％；三种剂量的XE-RN-SON+CD4V1SON/pCMV-PEIIImut对感染细胞的杀伤率为：12.97％、24.36％、43.64％；三种剂量的XE-RN-SON+CD4V1SON/pDYP-1对感染细胞的伤率分别为18.67％、28.47％和49.95％，表现出一定的剂量依赖关系。结果见表7。杀伤率＝(对照组OD×荧光感染率-药物处理组OD×荧光感染率)/(对照组OD-调零组OD)×100％
表6 蛋白DNA复合物对正常细胞的作用结果(调零组OD值＝0.061)    分组    剂量μg    OD    T检验    A5    NC    /    1.002±0.011    /    B5    XE-RN-SON蛋白组+NC    9.2    1.004±0.011    1.836    4.6    1.012±0.005    0.945    2.3    1.000±0.006    0.874    C5    XE-RN-SON+pDYP-1质粒    组+NC    9.2/4    0.968±0.012    0.752    4.6/2    0.982±0.004    0.824    2.3/1    0.976±0.009    0.796    D5    XE-RN-SON+CD4V1SON/p    CMV-PEIIImut组合+NC    4.6+4.8/4    0.963±0.003    0.641    2.3+2.4/2    0.957±0.005    0.457    1.15+1.2/1    0.974±0.021    0.748    E5    XE-RN-SON+CD4V1SON/p    DYP-1组合+NC    4.6+4.8/4    0.978±0.011    0.803    2.3+2.4/2    0.976±0.010    0.795    1.15+1.2/1    0.965±0.005    0.744
表7 蛋白DNA复合物对SIV感染的174细胞的杀伤作用结果(调零组OD值＝0.061) 分组 剂量μg OD 感染率 ％ 杀伤率％ 滴度 A6感染对照组(NC+SIV) / 0.490±0.003 75.3 / 1∶1280 B6XE-RN-SON蛋白(被SIV感染的细胞) 9.2 0.524±0.011 74.5 / 1∶20 4.6 0.477±0.005 74.6 / 1∶20 2.3 0.480±0.006 76.1 / 1∶80 C6pDYP-1质粒(被SIV感染的细胞) 4 0.503±0.012 76.8 / 1∶640 2 0.483±0.004 75.6 / 1∶640 1 0.483±0.009 75.4 / 1∶640 D6XE-RN-SON/pDYP-1(被SIV感染的细胞) 9.2/4* 0.327±0.003 55.8 50.54 1∶160 4.6/2* 0.370±0.005 62.6 37.21 1∶320 2.3/1 0.400±0.021 66.5 27.91 1∶320 E6XE-RN-SON/pCMV-PEIIImut(被SIV感染的细胞) 9.2/4* 0.269±0.011 43.2 68.53 1∶80 4.6/2* 0.456±0.010 48.9 39.54 1∶320 2.3/1 0.487±0.005 61.8 18.45 1∶320 F6XE-RN-SON+CD4V1SON/pDYP-1组合(被SIV感染的细胞) 4.6+4.8/4* 0.446±0.003 46.6 43.64 1∶40 2.3+2.4/2 0.500±0.008 55.8 24.36 1∶80 1.15+1.2/1 0.518±0.009 62.1 12.97 1∶80 G6XE-RN-SON+CD4V1SON/pCMV-PEIIImut组合(被SIV感染的细胞) 4.6+4.8/4* 0.450±0.029 41.0 49.95 1∶40 2.3+2.4/2 0.480±0.009 54.9 28.47 1∶80 1.15+1.2/1 0.514±0.021 58.4 18.67 1∶80
说明：
1.每组有3个平行孔。
5.剂量列中的数值1、2、4μg，以DNA计，同时还包括相应的蛋白质。
6.显著性水准为*p＜0.05。分别与感染对照组比较。
7.数值计算方法，见正文内容。
实施例30  靶向基因药物XE-RN-SON-DNA复合物的制备及其对SIV感染的CEMX-174的保护作用
1、转染复合物的制备
制备方法同实施例29中的步骤1。
2、培养基中的正常和被感染的CEMX-174细胞形态
形态观察同实施例29中的步骤2。
3、毒素基因的转染、表达以及对感染细胞的保护作用
3.1模式细胞的制备：
制备方法同实施例29中的步骤
3.2实验设计与结果
本实验分8组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA复合物分为三个剂量，按DNA计为1、2、4微克。8组分别为A7.正常对照组，正常对照组为不加任何处理因素(如SIV和各种蛋白质-DNA复合物)的CEMX-174细胞组，用作正常生长对照；B7.SIV+正常CEMX-174细胞；C7.SIV+CEMX-174细胞+XE-RN-SON组；D7.SIV+CEMX-174细胞+XE-RN-SON+CD4V1SON组；E7.SIV+CEMX-174细胞+XE-RN-SON/pDYP-1组；F7.SIV+CEMX-174细胞+XE-RN-SON/pCMV-PEIIImut；G7.SIV+CEMX-174细胞+XE-RN-SON+CD4V1SON/pDYP-1；H7.SIV+CEMX-174细胞+XE-RN-SON+CD4V1SON/pCMV-PEIIImut组合。
处理7天后，于显微镜下观察细胞生长情况，各组分别取20μl上清作滴度实验，并取一定量的细胞作荧光涂片。以MTT法测活细胞数进行方差分析和T检验(T-Test)分析，以感染对照组中存活细胞OD数作对照，计算出各复合物对CEMX-174细胞的保护作用。蛋白组或蛋白DNA复合物处理组的细胞生长状况明显好于受SIV感染对照组细胞，正常细胞数相对较多，死亡细胞较感染对照组少。同时MTT法测量溶液OD值。所得数据显示，2.3、4.6、9.2μg剂量的XE-RN-SON蛋白对SIV的保护作用为2.4％、10.33％、20.22％；2.3、4.6、9.2μg剂量的XE-RN-SON+CD4V1SON蛋白对SIV的保护作用为-7.4％、4.8％、18.75％；1、2、4μg DNA剂量的XE-RN-SON/pDYP-1对SIV的保护作用为-4.3％、3.1％、10.33％；1、2、4μg DNA剂量的XE-RN-SON/pCMV-PEIIImut对SIV的保护作用为0.5％、2.3％、7.3％；1、2、4μg DNA剂量的XE-RN-SON+CD4V1SON/pDYP-1对SIV的保护作用为-6.4％、15.89％、22.5％；1、2、4μg DNA剂量的XE-RN-SON+CD4V1SON/pCMV-PEIIImut保护作用为-2.3％、3.1％、21.94％。上述各组药物与空白对照组相比，存活细胞数显著增多，即被SIV感染的细胞数显著减少。同一种药物对SIV的中和作用，具有剂量依赖关系。实验结果见8。
保护率＝(实验组OD值-对照组OD值)/(实验组OD值-调零组OD值)×100％
表8 蛋白和蛋白DNA复合物对SIV感染的174细胞的保护作用结果(调零组OD值＝0.061) 分组 剂量μg OD 保护率％ 滴度 A7 CEMX-174细胞 2.812±0.004 B7 SIV+正常 CEMX-174细胞 1.145±0.011 1∶1280 C7 XE-RN-SON蛋白 组(SIV+正常 CEMX-174细胞) 9.2* 1.425±0.006 20.22 1∶320 4.6 1.274±0.007 10.33 1∶1280 2.3 1.120±0.004 2.4 1∶1280 D7 XE-RN-SON+ CD4V1SON蛋白 组(SIV+正常 CEMX-174细胞) 4.6+4.8* 1.406±0.012 18.75 1∶80 2.3+2.4 1.204±0.006 4.8 1∶320 1.15+1.2 1.078±0.013 -7.4 1∶1280 E7 XE-RN-SON/pDY P-1组(SIV+正常 CEMX-174细胞) 9.2/4* 1.274±0.004 10.33 1∶160 4.6/2 1.183±0.008 3.1 1∶640 2.3/1 1.106±0.014 -4.3 1∶1280 F7 XE-RN-SON/pCM V-PEIIImut(SIV+正 常CEMX-174细 胞) 9.2/4 1.234±0.005 7.3 1∶20 4.6/2 1.179±0.007 2.3 1∶80 2.3/1 1.157±0.001 0.5 1∶320 G7 XE-RN-SON+CD4 V1SON/pDYP-1(SI V+正常 CEMX-174细胞) 4.6+4.8/4* 1.463±0.016 22.5 1∶80 2.3+2.4/2 1.354±0.009 15.89 1∶640 1.15+1.2/1 1.082±0.004 -6.4 1∶1280 H7 XE-RN-SON+ CD4V1SON/pCM V-PEIIImut(SIV+正 常CEMX-174细 胞) 4.6+4.8/4* 1.451±0.008 21.94 1∶80 2.3+2.4/2 1.180±0.020 3.1 1∶640 1.15+1.2/1 1.129±0.005 -2.3 1∶1280
1.每组有3个平行孔，以减少孔间误差。
2.剂量列中的数值1、2、4μg，以DNA计，同时还包括相应的蛋白质。
3.显著性水准为*p＜0.05。分别与(正常细胞+SIV)组比较。
4.数值计算方法，见正文说明。
实施例31  病毒的滴度试验
1、杀伤试验后的病毒滴度试验
将杀伤试验和中和试验中各培养孔的细胞充分混悬，取1ml细胞培养液，3000rpm离心3分钟，弃上清。再用1ml的PBS洗一次，弃上清，在逐渐加入PBS，混悬细胞，调整细胞浓度为2×105/ml。取15μl混悬液滴加在载玻片上的环内，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分钟，取出晾干，加入gp120的抗体(猴抗SIV抗体，来自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分钟。然后用pH7.2的PBS冲洗，并置于其中浸泡10分钟，其间不断振摇。取出片子后，再加入用万分之二的Evens兰配制的兔抗猴抗体(即二抗)，37℃水浴30分钟，用PBS冲洗，晾干后在荧光显微镜下观察、计数荧光细胞数并拍照。在荧光显微镜下观察被SIV/HIV感染的细胞在蓝色光的激发下发黄色荧光，可以看到细胞周边呈黄色，而未被感染的细胞则不呈黄色，呈暗红色。杀伤试验组结果中的荧光感染率见表7。杀伤试验中试验前后的荧光照片见图20a和20b。
这些感染的CEMX-174细胞在加入药物48小时后，于显微镜下观察细胞生长情况。吸取20μL上清进行病毒滴度检测。结果显示XE-RN-SON组三个剂量(2.3、4.6、9.2μg)处理组的病毒滴度分别为1∶80、1∶20、1∶20；pDYP-1质粒组的三个剂量(1，2，4μg)的病毒滴度分别为1∶640、1∶640、1∶640；XE-RN-SON/pDYP-1组分别为1∶320、1∶320、1∶160；1、2、4μg DNA剂量的XE-RN-SON/pCMV-PEIIImut对SIV的中和作用为1∶320、1∶320、1∶80；XE-RN-SON+CD4V1SON/pCMV-PEIIImut组合的三个剂量组(1、2、4μg)的滴度分别为1∶80、1∶80、1∶40；XE-RN-SON+CD4V1SON/pDYP-1组合的三个剂量组(1、2、4μg)的滴度分别为1∶80、1∶80、1∶40。细胞实验结果见表7。
2、中和试验后的病毒滴度试验
未感染的CEMX-174细胞，在加入药物和SIV病毒作用7天后，于显微镜下观察细胞生长情况。吸取20μL上清进行病毒滴度检测。结果显示：XE-RN-SON组三个剂量(2.3、4.6、9.2μg)处理组的病毒滴度分别为1∶1280、1∶1280、1∶320；XE-RN-SON+CD4V1蛋白组三个剂量的病毒滴度分别为1∶1280、1∶320、1∶80；XE-RN-SON/pDYP-1组分别为1∶1280、1∶640、1∶160；XE-RN-SON/pCMV-PEIIImut对SIV的中和作用为1∶320、1∶80、1∶20；XE-RN-SON+CD4V1SON/pDYP-1的滴度分别为1∶1280、1∶640、1∶80；XE-RN-SON+CD4V1-SON/pCMV-PEIIImut的滴度分别为1∶1280、1∶640、1∶80。细胞实结果见表8。
实施例32  感染细胞的荧光计数及显微照相
将杀伤试验和中和试验中各培养孔的细胞充分混悬，取1ml细胞培养液，3000rpm离心3分钟，弃上清。再用1ml的PBS洗一次，弃上清，逐渐加入PBS，混悬细胞，调整细胞浓度为2×105/ml。取15μl混悬液滴加在载玻片上的环内，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分钟，取出晾干，加入gp120的抗体(猴抗SIV抗体，来自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分钟。然后用pH7.2的PBS冲洗，并置于其中浸泡10分钟，其间不断振摇。取出片子后，再加入用万分之二的Evens兰配制的兔抗猴抗体(即二抗)，37℃水浴30分钟，用PBS冲洗，晾干后在荧光显微镜下观察、计数荧光细胞数并拍照。在荧光显微镜下观察被SIV/HIV感染的细胞在蓝色光的激发下发黄色荧光，可以看到细胞周边呈黄色，而未被感染的细胞则不呈黄色，呈暗红色。杀伤试验组结果中的荧光感染率见表7。杀伤试验和保护试验中试验前后的荧光照片见图21a和21b。
上述研究的结果可以总结如下：
生物学活性检测生物学活性检测
1.复合物的杀伤作用(已被感染细胞+复合药物，48小时后观察)：三型十四种复合物各4μg(以DNA计)分别对受SIV感染的CEMX-174细胞(2×107/ml细胞)的杀伤率均约为50％～65％。

滴度：对照1∶5120    复合物1∶320(个别为1∶160；1∶80)
2.复合物的中和作用(模拟体内情况：正常细胞+病毒+复合药物，一周后观察)：
14种复合物各4μg(以DNA计)的中和保护率(使这部分细胞免受感染，MTT法)均约为20％。保护率有剂量依赖关系。滴度从对照的1∶5120降至1∶320(个别为1∶160，1∶80)。

                          序列表
<110>中国医学科学院基础医学研究所
<120>一个系列的非病毒载体以及包含其的药物组合物
<130>I20031336CB
<160>38
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>543
<212>DNA
<213>人
<400>1
cagggaaaga aagtggtgct gggcaaaaaa ggggatacag tggaactgac ctgtacagct     60
tcccagaaga agagcataca attccactgg aaaaactcca accagataaa gattctggga    120
aatcagggct ccttcttaac taaaggtcca tccaagctga atgatcgcgc tgactcaaga    180
agaagccttt gggaccaagg aaacttcccc ctgatcatca agaatcttaa gatagaagac    240
tcagatactt acatctgtga agtggaggac cagaaggagg aggtgcaatt gctagtgttc    300
ggattgactg ccaactctga cacccacctg cttcaggggc agagcctgac cctgaccttg    360
gagagccccc ctggtagtag cccctcagtg caatgtagga gtccaagggg taaaaacata    420
caggggggga agaccctctc cgtgtctcag ctggagctcc aggatagtgg cacctggaca    480
tgcactgtct tgcagaacca gaagaaggtg gagttcaaaa tagacatcgt ggtgctagct    540
ttc                                                                  543
<210>2
<211>181
<212>PRT
<213>人
<400>2
Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu
1               5                   10                  15
Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys
        35                  40                  45
Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp
    50                  55                  60
Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp
65                  70                  75                   80
Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln
                85                  90                  95
Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln
            100                 105                 110
Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro
        115                 120                 125
Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys
    130                 135                 140
Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr
145                 150                 155                 160
Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile
                165                 170                 175
Val Val Leu Ala Phe
            180
<210>3
<211>300
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
aaaaaagtag ttctgggtaa aaagggtgac accgttgaac tgacttgcac cgcttcccag     60
aaaaagtcta tccagttcca ctggaaaaac tccaaccaga tcaaaatcct aggtaaccag    120
ggttccttcc tgaccaaagg tccgtctaaa ctgaacgatc gtgctgactc ccgccgttct    180
ctatgggacc agggtaactt cccgctgatt atcaaaaacc tgaaaatcga agattccgac    240
acctacatct gtgaagttga agaccagaaa gaagaagttc aactactggt tttcggtctg    300
<210>4
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>4
Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys
1               5                   10                  15
Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn
            20                  25                  30
Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro
        35                  40                  45
Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln
    50                  55                  60
Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu
                85                  90                  95
Val Phe Gly Leu
            100
<210>5
<211>927
<212>DNA
<213>人
<400>5
aactacaccg aggaaatggg ctcaggggac tatgactcca tgaaggaacc ctgtttccgt     60
gaagaaaatg ctaatttcaa taaaatcttc ctgcccacca tctactccat catcttctta    120
actggcattg tgggcaatgg attggtcatc ctggtcatgg gttaccagaa gaaactgaga    180
agcatgacgg acaagtacag gctgcacctg tcagtggccg acctcctctt tgtcatcacg    240
cttcccttct gggcagttga tgccgtggca aactggtact ttgggaactt cctatgcaag    300
gcagtccatg tcatctacac agtcaacctc tacagcagtg tcctcatcct ggccttcatc    360
agtctggacc gctacctggc catcgtccgc gccaccaaca gtcagaggcc aaggaagctg    420
ttggctgaaa aggtggtcta tgttggcgtc tggatccctg ccctcctgct gactattccc    480
gacttcatct ttgccaacgt cagtgaggca gatgacagat atatctgtga ccgcttctat    540
cccaatgact tgtgggtggt tgtgttccag tttcagcaca tcatggttgg ccttatcctg    600
cctggtattg tcatcctgtc ctgctattgc attatcatct ccaagctgtc acactccaag    660
ggccaccaga agcgcaaggc cctcaagacc acagtcatcc tcatcctggc tttcttcgcc    720
tgttggctgc cttactacat tgggatcagc atcgactcct tcatcctcct ggaaatcatc    780
aagcaagggt gtgagtttga gaacactgtg cacaagtgga tttccatcac cgaggcccta    840
gctttcttcc actgttgtct gaaccccatc ctctatgctt tccttggagc caaatttaaa    900
acctctgccc agcacgcact cacctct                                        927
<210>6
<211>309
<212>PRT
<213>人
<400>6
Asn Tyr Thr Glu Glu Met Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu
1               5                   10                  15
Pro Cys Phe Arg Glu Glu Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro
            20                  25                  30
Thr Ile Tyr Ser Ile Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu
        35                  40                  45
Val Ile Leu Val Met Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp
    50                  55                  60
Lys Tyr Arg Leu His Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr
65                  70                  75                  80
Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn
                85                  90                  95
Phe Leu Cys Lys Ala Val His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser
            100                 105                 110
Ser Val Leu Ile Leu Ala Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile
        115                 120                 125
Val Arg Ala Thr Asn Ser Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys
    130                 135                 140
Val Val Tyr Val Gly Val Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro
145                 150                 155                 160
Asp Phe Ile Phe Ala Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys
                165                 170                 175
Asp Arg Phe Tyr Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln
            180                 185                 190
His Ile Met Val Gly Leu Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys
        195                 200                 205
Tyr Cys Ile Ile Ile Ser Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys
    210                 215                 220
Arg Lys Ala Leu Lys Thr Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala
225                 230                 235                 240
Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu
                245                 250                 255
Leu Glu Ile Ile Lys Gln Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys
            260                 265                 270
Trp Ile Ser Ile Thr Glu Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn
        275                 280                 285
Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln
    290                 295                 300
His Ala Leu Thr Ser
305
<210>7
<211>900
<212>DNA
<213>人
<400>7
gattatcaag tgtcaagtcc aatctatgac atcaattatt atacatcgga gccctgccaa     60
aaaatcaatg tgaagcaaat cgcagcccgc ctcctgcctc cgctctactc actggtgttc    120
atctttggtt ttgtgggcaa catgctggtc atcctcatcc tgataaactg caaaaggctg    180
aagagcatga ctgacatcta cctgctcaac ctggccatct ctgacctgtt tttccttctt    240
actgtcccct tctgggctca ctatgctgcc gcccagtggg actttggaaa tacaatgtgt    300
caactcttga cagggctcta ttttataggc ttcttctctg gaatcttctt catcatcctc    360
ctgacaatcg ataggtacct ggctgtcgtc catgctgtgt ttgctttaaa agccaggacg    420
gtcacctttg gggtggtgac aagtgtgatc acttgggtgg tggctgtgtt tgcgtctctc    480
ccaggaatca tctttaccag atctcaaaaa gaaggtcttc attacacctg cagctctcat    540
tttccataca gtcagtatca attctggaag aatttccaga cattaaagat agtcatcttg    600
gggctggtcc tgccgctgct tgtcatggtc atctgctact cgggaatcct aaaaactctg    660
cttcggtgtc gaaatgagaa gaagaggcac agggctgtga ggcttatctt caccatcatg    720
attgtttatt ttctcttctg ggctccctac aacattgtcc ttctcctgaa caccttccag    780
gaattctttg gcctgaataa ttgcagtagc tctaacaggt tggaccaagc tatgcaggtg    840
acagagactc ttgggatgac gcactgctgc atcaacccca tcatctatgc ctttgtcggg    900
<210>8
<211>300
<212>PRT
<213>人
<400>8
Glu Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser
1               5                   10                  15
Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu Leu
            20                  25                  30
Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met
        35                  40                  45
Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met Thr
    50                  55                  60
Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu Leu
65                  70                  75                  80
Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe Gly
                85                  90                  95
Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe Phe
            100                 105                 110
Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala
        115                 120                 125
Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly
    130                 135                 140
Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu
145                 150                 155                 160
Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr
                165                 170                 175
Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe
            180                 185                 190
Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Val
        195                 200                 205
Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg
    210                 215                 220
Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile Met
225                 230                 235                 240
Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu Leu
                245                 250                 255
Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn
            260                 265                 270
Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His
        275                 280                 285
Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly
    290                 295                 300
<210>9
<211>258
<212>DNA
<213>人
<400>9
gccaagaagc ccaagaaggt ggctggcgcc gctaccccga agaaaagcat caaaaagact     60
cctaagaagg taaagaagcc agcaaccgct gctgggacca agaaagtggc caagagtgcg    120
aaaaaggtga aaacacctca gccaaaaaaa gctgccaaga gtccagctaa ggccaaagcc    180
cctaagccca aggcggccaa gcctaagtcg gggaagccga aggttacaaa ggcaaagaag    240
gcagctccga agaaaaag                                                  258
<210>10
<211>86
<212>PRT
<213>人
<400>10
Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser
1               5                   10                  15
Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly
            20                  25                  30
Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro
        35                  40                  45
Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys
    50                  55                  60
Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys
65                  70                  75                  80
Ala Ala Pro Lys Lys Lys
                85
<210>11
<211>72
<212>DNA
<213>人
<400>11
gccaagaagc ccaagaaggt ggctggcgcc gctaccccga agaaaagcat caaaaagact     60
cctaagaagg ta                                                         72
<210>12
<211>24
<212>PRT
<213>人
<400>12
Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser
1               5                   10                  15
Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val
            20
<210>13
<211>27
<212>PRT
<213>人
<400>13
Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro
1               5                   10                  15
Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln
            20                  25
<210>14
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>14
Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser
1               5                   10                  15
Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg
            20                  25                  30
<210>15
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
aacgtttccg aagctgacga ccgttacatc tgcgaccgtt tctacccgaa cgacctgtgg     60
gttgtggttt tccagttcca g                                               81
<210>16
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
gactaccagg tttccagccc gatctacgac atcaactact acacttccga accgtgccag     60
aaaatcaacg ttaaacagat cgctgctcgt                                      90
<210>17
<211>60
<212>PRT
<213>人工序列
<400>17
Met Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr
1               5                   10                  15
Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln Gly Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser Glu Pro
        35                  40                  45
Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg
    50                  55                  60
<210>18
<211>180
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
atgaacgttt ccgaagctga cgaccgttac atctgcgacc gtttctaccc gaacgacctg     60
tgggttgtgg ttttccagtt ccagggtacc gactaccagg tttccagccc gatctacgac    120
atcaactact acacttccga accgtgccag aaaatcaacg ttaaacagat cgctgctcgt    180
<210>19
<211>72
<212>PRT
<213>人
<400>19
Lys Val Lys Asp Thr His Glu Lys Ser Lys Lys Asn Lys Asn Arg Asp
1               5                   10                  15
Lys Gly Glu Lys Glu Lys Lys Arg Asp Ser Ser Leu Arg Ser Arg Ser
            20                  25                  30
Lys Arg Ser Lys Ser Ser Glu His Lys Ser Arg Lys Arg Thr Ser Glu
        35                  40                  45
Ser Arg Ser Arg Ala Arg Lys Arg Ser Ser Lys Ser Lys Ser His Arg
    50                  55                  60
Ser Gln Thr Arg Ser Arg Ser Arg
65                  70
<210>20
<211>216
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
aaagttaaag acactcacga aaaatccaaa aaaaacaaaa accgtgacaa aggtgaaaaa     60
gaaaaaaaac gtgactcttc cctgcgttct cgttccaaac gttccaaatc ttctgaacac    120
aaatcccgta aacgtacttc cgaatctcgt tctcgtgctc gtaaacgttc ctctaaatcc    180
aaatctcacc gttctcagac tcgttcccgt tcccgt                              216
<210>21
<211>269
<212>PRT
<213>人工序列
<400>21
Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu
1               5                   10                  15
Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys
        35                  40                  45
Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp
    50                  55                  60
Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp
65                  70                  75                  80
Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln
                85                  90                  95
Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln
            100                 105                 110
Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro
        115                 120                 125
Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys
    130                 135                 140
Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr
145                 150                 155                 160
Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile
                165                 170                 175
Val Val Leu Ala Phe Gly Thr Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly
            180                 185                 190
Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys
        195                 200                 205
Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys
    210                 215                 220
Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys
225                 230                 235                 240
Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro
                245                 250                 255
Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys
            260                 265
<210>22
<211>397
<212>PRT
<213>人工序列
<400>22
Asn Tyr Thr Glu Glu Met Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu
1               5                   10                  15
Pro Cys Phe Arg Glu Glu Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro
            20                  25                  30
Thr Ile Tyr Ser Ile Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu
        35                  40                  45
Val Ile Leu Val Met Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp
    50                  55                  60
Lys Tyr Arg Leu His Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr
65                  70                  75                  80
Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn
                85                  90                  95
Phe Leu Cys Lys Ala Val His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser
            100                 105                 110
Ser Val Leu Ile Leu Ala Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile
        115                 120                 125
Val Arg Ala Thr Asn Ser Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys
    130                 135                 140
Val Val Tyr Val Gly Val Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro
145                 150                 155                 160
Asp Phe Ile Phe Ala Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys
                165                 170                 175
Asp Arg Phe Tyr Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln
            180                 185                 190
His Ile Met Val Gly Leu Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys
        195                 200                 205
Tyr Cys Ile Ile Ile Ser Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys
    210                 215                 220
Arg Lys Ala Leu Lys Thr Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala
225                 230                 235                 240
Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu
                245                 250                 255
Leu Glu Ile Ile Lys Gln Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys
            260                 265                 270
Trp Ile Ser Ile Thr Glu Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn
        275                 280                 285
Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln
    290                 295                 300
His Ala Leu Thr Ser Gly Thr Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly
305                 310                 315                 320
Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys
                325                 330                 335
Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys
            340                 345                 350
Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys
        355                 360                 365
Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro
    370                 375                 380
Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys
385                 390                 395
<210>23
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<400>23
Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser
1               5                   10                  15
Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu Leu
            20                  25                  30
Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met
        35                  40                  45
Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met Thr
    50                  55                  60
Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu Leu
65                  70                  75                  80
Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe Gly
                85                  90                  95
Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe Phe
            100                 105                 110
Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala
        115                 120                 125
Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly
    130                 135                 140
Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu
145                 150                 155                 160
Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr
                165                 170                 175
Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe
            180                 185                 190
Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Val
        195                 200                 205
Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg
    210                 215                 220
Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile Met
225                 230                 235                 240
Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Ash Ile Val Leu Leu Leu
                245                 250                 255
Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn
            260                 265                 270
Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His
        275                 280                 285
Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Gly Thr Ala Lys
    290                 295                 300
Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys
305                 310                 315                 320
Lys Thr Pro Lys Lys Val
                325
<210>24
<211>175
<212>PRT
<213>人工序列
<400>24
Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr
1               5                   10                  15
Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser
            20                  25                  30
Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly
        35                  40                  45
Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp
    50                  55                  60
Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser
65                  70                  75                  80
Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu
                85                  90                  95
Leu Val Phe Gly Leu Gly Thr Lys Val Lys Asp Thr His Glu Lys Ser
            100                 105                 110
Lys Lys Asn Lys Asn Arg Asp Lys Gly Glu Lys Glu Lys Lys Arg Asp
        115                 120                 125
Ser Ser Leu Arg Ser Arg Ser Lys Arg Ser Lys Ser Ser Glu His Lys
    130                 135                 140
Ser Arg Lys Arg Thr Ser Glu Ser Arg Ser Arg Ala Arg Lys Arg Ser
145                 150                 155                 160
Ser Lys Ser Lys Ser His Arg Ser Gln Thr Arg Ser Arg Ser Arg
                165                 170                 175
<210>25
<211>102
<212>PRT
<213>人工序列
<400>25
Met Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr
1               5                   10                  15
Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln Gly Thr Lys Val
            20                  25                  30
Lys Asp Thr His Glu Lys Ser Lys Lys Asn Lys Asn Arg Asp Lys Gly
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Lys Lys Arg Asp Ser Ser Leu Arg Ser Arg Ser Lys Arg
    50                  55                  60
Ser Lys Ser Ser Glu His Lys Ser Arg Lys Arg Thr Ser Glu Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ser Arg Ala Arg Lys Arg Ser Ser Lys Ser Lys Ser His Arg Ser Gln
                85                  90                  95
Thr Arg Ser Arg Ser Arg
            100
<210>26
<211>103
<212>PRT
<213>人工序列
<400>26
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr
1               5                   10                  15
Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Lys
            20                  25                  30
Val Lys Asp Thr His Glu Lys Ser Lys Lys Asn Lys Asn Arg Asp Lys
        35                  40                  45
Gly Glu Lys Glu Lys Lys Arg Asp Ser Ser Leu Arg Ser Arg Ser Lys
    50                  55                  60
Arg Ser Lys Ser Ser Glu His Lys Ser Arg Lys Arg Thr Ser Glu Ser
65                  70                  75                  80
Arg Ser Arg Ala Arg Lys Arg Ser Ser Lys Ser Lys Ser His Arg Ser
                85                  90                  95
Gln Thr Arg Ser Arg Ser Arg
            100
<210>27
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<400>27
Met Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr
1               5                   10                  15
Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln Gly Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser Glu Pro
        35                  40                  45
Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Lys Val Lys Asp
    50                  55                  60
Thr His Glu Lys Ser Lys Lys Asn Lys Asn Arg Asp Lys Gly Glu Lys
65                  70                  75                  80
Glu Lys Lys Arg Asp Ser Ser Leu Arg Ser Arg Ser Lys Arg Ser Lys
                85                  90                  95
Ser Ser Glu His Lys Ser Arg Lys Arg Thr Ser Glu Ser Arg Ser Arg
            100                 105                 110
Ala Arg Lys Arg Ser Ser Lys Ser Lys Ser His Arg Ser Gln Thr Arg
        115                 120                 125
Ser Arg Ser Arg
    130
<210>28
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<400>28
Met Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln
1               5                   10                  15
Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu
            20                  25                  30
Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala
        35                  40                  45
Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp
    50                  55                  60
Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn
                85                  90                  95
Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe
            100                 105                 110
Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val
        115                 120                 125
Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr
    130                 135                 140
Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro
145                 150                 155                 160
Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro
                165                 170                 175
Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu
            180                 185                 190
Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Asp Pro
        195                 200                 205
Pro Lys Asp Glu Leu
    210
<210>29
<211>807
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
cagggaaaga aagtggtgct gggcaaaaaa ggggatacag tggaactgac ctgtacagct     60
tcccagaaga agagcataca attccactgg aaaaactcca accagataaa gattctggga    120
aatcagggct ccttcttaac taaaggtcca tccaagctga atgatcgcgc tgactcaaga    180
agaagccttt gggaccaagg aaacttcccc ctgatcatca agaatcttaa gatagaagac    240
tcagatactt acatctgtga agtggaggac cagaaggagg aggtgcaatt gctagtgttc    300
ggattgactg ccaactctga cacccacctg cttcaggggc agagcctgac cctgaccttg    360
gagagccccc ctggtagtag cccctcagtg caatgtagga gtccaagggg taaaaacata    420
caggggggga agaccctctc cgtgtctcag ctggagctcc aggatagtgg cacctggaca    480
tgcactgtct tgcagaacca gaagaaggtg gagttcaaaa tagacatcgt ggtgctagct    540
ttccctaggg ccaagaagcc caagaaggtg gctggcgccg ctaccccgaa gaaaagcatc    600
aaaaagactc ctaagaaggt aaagaagcca gcaaccgctg ctgggaccaa gaaagtggcc    660
aagagtgcga aaaaggtgaa aacacctcag ccaaaaaaag ctgccaagag tccagctaag    720
gccaaagccc ctaagcccaa ggcggccaag cctaagtcgg ggaagccgaa ggttacaaag    780
gcaaagaagg cagctccgaa gaaaaag                                        807
<210>30
<211>1272
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
aactacaccg aggaaatggg ctcaggggac tatgactcca tgaaggaacc ctgtttccgt     60
gaagaaaatg ctaatttcaa taaaatcttc ctgcccacca tctactccat catcttctta    120
actggcattg tgggcaatgg attggtcatc ctggtcatgg gttaccagaa gaaactgaga    180
agcatgacgg acaagtacag gctgcacctg tcagtggccg acctcctctt tgtcatcacg    240
cttcccttct gggcagttga tgccgtggca aactggtact ttgggaactt cctatgcaag    300
gcagtccatg tcatctacac agtcaacctc tacagcagtg tcctcatcct ggccttcatc    360
agtctggacc gctacctggc catcgtccgc gccaccaaca gtcagaggcc aaggaagctg    420
ttggctgaaa aggtggtcta tgttggcgtc tggatccctg ccctcctgct gactattccc    480
gacttcatct ttgccaacgt cagtgaggca gatgacagat atatctgtga ccgcttctat    540
cccaatgact tgtgggtggt tgtgttccag tttcagcaca tcatggttgg ccttatcctg    600
cctggtattg tcatcctgtc ctgctattgc attatcatct ccaagctgtc acactccaag    660
ggccaccaga agcgcaaggc cctcaagacc acagtcatcc tcatcctggc tttcttcgcc    720
tgttggctgc cttactacat tgggatcagc atcgactcct tcatcctcct ggaaatcatc    780
aagcaagggt gtgagtttga gaacactgtg cacaagtgga tttccatcac cgaggcccta    840
gctttcttcc actgttgtct gaaccccatc ctctatgctt tccttggagc caaatttaaa    900
acctctgccc agcacgcact cacctctaac gtttccgaag ctgacgaccg ttacatctgc    960
gaccgtttct acccgaacga cctgtgggtt gtggttttcc agttccagcc tagggccaag   1020
aagcccaaga aggtggctgg cgccgctacc ccgaagaaaa gcatcaaaaa gactcctaag   1080
aaggtaaaga agccagcaac cgctgctggg accaagaaag tggccaagag tgcgaaaaag   1140
gtgaaaacac ctcagccaaa aaaagctgcc aagagtccag ctaaggccaa agcccctaag   1200
cccaaggcgg ccaagcctaa gtcggggaag ccgaaggtta caaaggcaaa gaaggcagct   1260
ccgaagaaaa ag                                                       1272
<210>31
<211>978
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
gattatcaag tgtcaagtcc aatctatgac atcaattatt atacatcgga gccctgccaa     60
aaaatcaatg tgaagcaaat cgcagcccgc ctcctgcctc cgctctactc actggtgttc    120
atctttggtt ttgtgggcaa catgctggtc atcctcatcc tgataaactg caaaaggctg    180
aagagcatga ctgacatcta cctgctcaac ctggccatct ctgacctgtt tttccttctt    240
actgtcccct tctgggctca ctatgctgcc gcccagtggg actttggaaa tacaatgtgt    300
caactcttga cagggctcta ttttataggc ttcttctctg gaatcttctt catcatcctc    360
ctgacaatcg ataggtacct ggctgtcgtc catgctgtgt ttgctttaaa agccaggacg    420
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ccaggaatca tctttaccag atctcaaaaa gaaggtcttc attacacctg cagctctcat    540
tttccataca gtcagtatca attctggaag aatttccaga cattaaagat agtcatcttg    600
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aagactccta agaaggta                                                  978
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<212>DNA
<213>人工序列
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cagaaaaagt ctatccagtt ccactggaaa aactccaacc agatcaaaat cctaggtaac    120
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tctctatggg accagggtaa cttcccgctg attatcaaaa acctgaaaat cgaagattcc    240
gacacctaca tctgtgaagt tgaagaccag aaagaagaag ttcaactact ggttttcggt    300
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ggggagaaag agaagaaaag agactcttca ttaagatctc gaagtaagcg ttccaaatct    420
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tctaagtcca agtctcatcg ctctcagaca cgttcacggt cacgttgata a             531
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