包含功能性缺失的基因组的冠状病毒样颗粒.pdf

本发明涉及冠状病毒及其诊断、治疗用途以及由其衍生的疫苗。本发明提供了可复制的冠状病毒和可复制的病毒样颗粒(VLP)，其中的基因组(至少功能性的)大部分缺失，但没有丢失其复制能力。所述的缺失优选地导致至少一种功能性缺失，原因在于相应的基因不表达或仅部分表达，由此产生的基因产物是无功能性的或与相应的野生型基因产物比较至少是功能性不同的。具有在此所述的缺失的VLP的一个显著的结果在于所述发生缺失的VLP虽然在体外和体内可以复制，但其通常被大大减毒了，其不会在靶宿主中导致疾病，这使得它们非常适合于治疗用途，例如作为基因和其他运载物的输送工具(其中需要时可以提供特异性定向)以及作为疫苗使用，所述疫苗是减毒的，同时携带可辅助引发免疫应答的重要免疫原决定簇。

权利要求书
1、  一种分离的或重组的具有复制能力的病毒样颗粒，所述颗粒来源于一种冠状病毒，其中至少一个编码除聚合酶或结构蛋白N、M、E或S之外的一种病毒基因产物的核酸的功能性片段被缺失。

2、  来源于冠状病毒I群的权利要求1的颗粒，其中所述核酸编码基因产物3a、3b、3c、7a或7b。

3、  来源于冠状病毒II群的权利要求1的颗粒，其中所述核酸编码基因产物2a、HE、4a、4b或5a。

4、  来源于冠状病毒III群的权利要求1的颗粒，其中所述核酸编码基因产物3a、3b、5a或5b。

5、  一种分离的或重组的具有复制能力的病毒样颗粒，所述颗粒来源于一种冠状病毒，其中结构蛋白的基因不以5′-S-E-M-N-3′的顺序出现。

6、  权利要求5的颗粒，其中至少一个编码除聚合酶或结构蛋白N、M、E或S之外的一种病毒基因产物的核酸的功能性片段被缺失。

7、  权利要求1至6中任一项的颗粒，其具有至少一种具有生物学活性的、与所述病毒样颗粒表面相关的、不同于原始冠状病毒任何一种蛋白的天然外部结构域(ectodomain)的蛋白或其片段。

8、  权利要求1至6中任一项的颗粒，其具有至少一种具有生物学活性的、与所述病毒样颗粒内部相关的、不同于原始冠状病毒任何一种蛋白的天然内部结构域(endodomain)的蛋白或其片段。

9、  权利要求1至6中任一项的颗粒，其具有至少一种与所述病毒样颗粒表面相关的、不同于原始冠状病毒的天然刺突蛋白的功能性定向手段。

10、  权利要求1至9中任一项的颗粒，其中所述颗粒具有一种冠状病毒基因组，其中所述基因组中插入了一种外源基因或其部分。

11、  权利要求1至10中任一项的颗粒，其是减毒的。

12、  权利要求1至11中任一项的颗粒，其是基因运载工具。

13、  权利要求1至11中任一项的颗粒，其是抗原或表位运载工具。

14、  用于治疗用途的包含权利要求1至13中任一项的颗粒的组合物。

15、  作为免疫原或疫苗用途的包含权利要求1至13中任一项的颗粒和药学可接受的载体的组合物。

16、  用于诊断用途的包含权利要求1至13中任一项的颗粒的组合物。

17、  用于抑制或阻断冠状病毒或冠状病毒样颗粒(VLP)感染的方法，包括用如图20所示的7氨基酸重复肽或其功能性片段来治疗生物体。

说明书包含功能性缺失的基因组的冠状病毒样颗粒
本发明涉及冠状病毒(coronavirus)及其诊断、治疗用途及由其衍生的疫苗的领域。
冠状病毒有相当简单的结构。它们由脂膜包围的核壳(nucleocapsid)组成。螺旋状的核壳是由一种核壳蛋白N包裹的RNA基因组构成。病毒包膜(envelope)通常包含3种膜蛋白：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)。一些冠状病毒在膜上存在第四种蛋白，即血凝素酯酶蛋白(HE)。如同所有的病毒，冠状病毒编码广泛多样的不同基因产物和蛋白。显然，其中最重要的是负责病毒复制和病毒体(virion)的结构相关功能的蛋白质。但是，除了这些基本功能，病毒通常具有许多功能未知但是已知或猜想对病毒某方面有益的蛋白。这些蛋白质既可以是必需的——其作用可定义为是病毒在细胞培养物中进行复制所需的——也可以是非必需的。冠状病毒组成一个大的、正义(positive sense)RNA病毒家族，其常常在许多不同的物种中导致呼吸道和肠道感染。依据抗原性、遗传和结构蛋白标准，他们被分为3种不同的群(group)：I群，II群和III群。实际上，由于这三群之间的存在很大不同，负责ICTV的研究组正在讨论把他们划为三个不同的属。所有这些病毒共有的特征是有一套特异性的编码复制和结构功能的必需基因。在这三个群中，散在和在这些基因侧翼的序列具有很大不同，对于各个群，它们或多或少是特异性的。在这些基本基因(elementary gene)中，最主要的一个基因占据了大约2/3的基因组。位于5’末端，这个被称为聚合酶的基因编码2个大前体，其许多功能性的裂解产物共同负责RNA的复制和转录。其他基本基因包括基本结构蛋白N、M、E和S。核壳蛋白(N)包裹形成病毒体核心的病毒RNA。这种RNP的结构被脂膜包围，丰富的膜蛋白(M)在脂膜上呈现稠密的基质。和M蛋白相关的是小包膜蛋白(E)和刺突蛋白(S)，后者形成了涉及病毒与细胞和细胞与细胞的融合的病毒包膜突起(peplomer)。这些结构蛋白的基因在病毒基因组中总是以5’-S-E-M-N-3’的顺序出现。
冠状病毒核壳在被感染细胞的胞质中组装。病毒核壳和在内质网中合成后在中间小室——位于内质网(ER)和高尔基体之间的一种膜系统——中积累的病毒包膜蛋白相互作用。这个膜蛋白系统作为出芽的位点：核壳与病毒包膜蛋白的相互作用导致了病毒颗粒的收缩，从而以胞外分泌的方式释放出细胞。
最近，我们证明冠状病毒颗粒的组装并不需要核壳参与。当病毒包膜蛋白基因共表达时，缺失核壳的颗粒可在细胞中组装。病毒样颗粒(VLP)形成的最低要求是M蛋白和E蛋白：S蛋白不是必需的，但如果存在则通过和M蛋白相互作用被整合。生化和电子显微镜分析揭示VLP，在尺寸上是均一的，并和真正的冠状病毒具有相同的尺度。显然，M蛋白和E蛋白有能力在细胞膜表面作用，引起曲率的改变，导致随后分泌出细胞的特殊的“囊泡”的出芽。描述这些结果的一篇文章发表在EMBO杂志上(vol.15，pp.2020-2028，1996)。
而另外一篇文章显示，不缺失核壳的冠状病毒样颗粒，并不发生不依赖于核壳的组装(Bos等，Virology 218，52-60，1996)。此外，RNA的包装不是非常有效。而且，这两篇文章都没有提供足够的使VLP适合作为治疗载体的靶向和输送特征，例如，具备特异性的靶向信息和/或遗传或非遗传的信息。
但是，冠状病毒在作为载体使用方面确实具有几个比其他的病毒表达系统独特的理论上的优点(见WO98/49195)：(i)冠状病毒是单链RNA病毒，可在细胞质内复制，不需要DNA作为中间状态，因此不太可能将病毒的基因组整合到宿主细胞的染色体中；(ii)这些病毒具有大的RNA基因组，已知其存在原则上可以插入大的外源性基因地空间；(iii)因为冠状病毒通常感染呼吸道和肠道的黏膜表面，他们可以用于诱导产生一个强分泌型免疫反应；(iv)冠状病毒的定向可通过操纵刺突蛋白S加以修饰，所以可对载体的定向和毒性进行遗传工程化操纵；(v)感染大多数物种的非致病性冠状病毒株可用来发展表达系统。
以冠状病毒基因组为基础，已经发展了两种表达载体。一种需要两种组分(辅助依赖)而另外一种通过定向重组或利用一个编码感染性RNA的cDNA进行修饰的单基因组。辅助依赖表达系统，也称为微型基因组(minigenome)，已经通过使用这3群冠状病毒的成员得到发展。冠状病毒衍生的微型基因组，理论的克隆容量接近25kb，因为大约3kb的微型基因组RNA被辅助病毒有效地扩增和包装，病毒基因组约有30kb。原则上，这是基于RNA病毒基因组的载体的最大克隆容量。
辅助病毒和非复制或复制型冠状病毒来源的RNA之间的定向重组使反向遗传学成为可能(9)。通过一个到两个交换(cross-over)介导定向重组。在修饰MHV致病性的S基因中引入改变。利用定向重组将编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因插入S和E基因之间的MHV，结果产生带有最大的已知的RNA病毒基因组(1d)的载体。在E和M基因内的定向诱变产生的突变表明这些基因在装配过程中的重要作用。
构建全长基因组cDNA克隆可以极大地提高对冠状病毒基因的操纵。构建一个感染性的TGEV cDNA克隆在最近成为可能(1c)。为了获得感染性的cDNA，运用了3个策略：(i)从可被辅助病毒稳定而高效复制的DI开始构建全长的cDNA。使用这个DI，可以完成全长的基因组的构建，且在每一步骤后都验证扩大的基因组的效能。这个方法可以鉴定对于细菌宿主有毒性的cDNA片段，这一发现对于在最后的克隆步骤中将毒性片段再引入病毒cDNA是很有利的；(ii)为了表达长的冠状病毒基因组和加上5’帽子，使用了一种由病毒复制酶驱动的2步法扩增系统，其偶联了核中从CMV启动子的转录与细胞质中的第二次扩增；以及(iii)为了增加病毒cDNA在细菌中的稳定性，cDNA被克隆成为细菌人工染色体(BAC)，在每个细胞中只产生1或2个质粒。全长的cDNA被分成2个质粒，因为如果将它们融合成为一个会降低cDNA的稳定性。一个质粒含有除去包含在第二个BAC中的大约5kb的ClaI片段外的全部病毒序列。将ClaI片段插入到其余的TGEV cDNA序列中，形成一个全功能性的感染性的cDNA克隆，导致产生一个可以感染肠道和呼吸道的致命病毒。
如述，基于两个组分的辅助依赖的表达系统以及通过定向重组或使用感染性cDNA构建的单基因组都已被发展。调控转录的序列已经被描述。我们已经完成高产量异源抗原的表达(1-8μg/106细胞)。表达水平可保持大约10代。这些表达水平足够引发保护性的免疫应答。
构建的单基因组冠状病毒载体，可以高效地表达外源基因，例如GFP。因此，我们开拓了利用具有独特特性的冠状病毒的一个新的途径，其特性包括：长的基因组，肠嗜性。其作为表达载体，引起了人们的极高兴趣。如果用于疫苗发展和基因治疗，其他条件需要满足，特别是构建载体对宿主的毒性和构建载体在细胞培养物中的存活性是明显的局限性。另一方面，载体不需要保持剧烈的毒性，但是，应该至少具有减弱的毒性，使其在对宿主或研究对象进行的治疗中作为基因运载工具或疫苗用于体内复制。另外，至少在商业用途中，在细胞培养物中，载体可进行顺利的复制。
本发明提供了可复制的冠状病毒和可复制的冠状病毒样颗粒(VLP)，它们的大部分基因组(至少在功能性上)是缺失和/或重排的，但并没有丧失它们的复制能力。所述缺失最好导致一个至少是功能性的缺失，因为相应的基因没有或只有部分表达，结果基因产物缺失，丧失功能，或导致至少和相应的野生型基因产物的功能显著不同。鉴于此处提供的缺失或重排的VLP，一个惊人的结果是所述缺失或重排的VLP，尽管可以在体外和体内复制，却被很好的减毒，所以在靶宿主中，它不能(或极少)导致疾病，使它非常适合治疗用途，例如作为基因或其他药物的运载工具(其在需要时提供特异的定位)，或作为疫苗，减毒的并带有重要的免疫原性决定簇而诱导免疫反应。这样的决定簇可能来源于一个(同源或异源)冠状病毒，也可能来源于其他的病原体。换句话，本发明提供了部分缺失和/或重排的基因组的可复制的VLP作为载体的应用。一个外源核酸序列可被导入载体。这个外源基因序列编码一个(部分)蛋白。就是这个由插入的序列编码的蛋白或其一部分，可作为一个免疫原或“靶位点”(可以结合受体的配体)。
在一个更优选的实施方式中，此处提供的所述VLP用多种方法之一对基因组或它的蛋白组成做进一步的修饰，由此在它们表面暴露不同的生物或靶分子和/或在颗粒内带有需要保护或屏蔽的生物活性的分子和/或包含整合了外源基因或序列的基因组。目前，医药上的主要需求之一是体内治疗药物的定向输送系统。因此，发展可以将运载物(cargo)直接运送到指定的细胞群并介导该运载物进入细胞，以便于发挥它的生物活性的载体是生物医学领域主要的挑战。人们付出了巨大的努力发展和检验以脂质体、微球体和抗体等为基础的输送药物、基因、肽和蛋白的系统。虽然，大部分的方法是有前途的，但目前实际的成功非常有限。此处提供VLP的基因组被缺失和/或重排到不丧失复制活性的程度，使其可以很好地作为运载工具运输上述运载物。将所述运载物提供给VLP或以VLP作为载体可通过，例如插入一个外源性基因序列而完成，该基因编码一个所需分子，例如一个配体或者结合分子，无论这是一个免疫原或受体结合分子或者任何其他的蛋白或肽。在一个更优选的实施方式中，所述运载物包含一个整合了所需外源性基因或序列的核酸。外源基因可被一个VLP通过在基因组中插入了所述基因或通过缺失非必需基因产生的遗传空间来表达。为了进一步提高使用冠状样病毒的基因输送治疗的安全性，例如使用此处提供的VLP，本发明提供了一个方法用于大体上抑制或阻止冠状病毒特别是冠状病毒样颗粒的感染，包括用如此处提供的所谓7氨基酸重复肽(heptad repeat peptide)来治疗处于冠状病毒或VLP感染危险中的或已经被感染的有机体或细胞。所有的冠状病毒在它们的S蛋白上都包含1或2个特异性的7聚体重复区域，它可帮助冠状病毒进入细胞。来源于近膜测的7聚体重复区域的肽(HR2；例如，MHV株A59的肽由S蛋白的第1216-1254位氨基酸组成，并请参见图20)在抑制感染和感染性细胞与周围细胞融合方面存在显著效果，如说明书中确定的，说明了所提供的优点。当然，肽治疗不局限于此处提供的基因治疗或运载载体治疗，其通常也可以被用在预防或治疗冠状病毒感染上。
在另一个实施方式中，本发明提供了一个本发明的可复制的VLP，其一种病毒蛋白的外部结构域(ectodomain)和/或内部结构域(endodomain)被修饰。例如，通过修饰刺突蛋白的外部结构域，提供的VLP拥有修饰的生物分子，该分子作为定位手段，用于指导VLP和其他生物分子相互作用，所述生物分子可反映(mirror)或与定位手段相互作用，例如，细胞上的受体蛋白，其可以是激素受体、B细胞上的特异的免疫球蛋白、T细胞和其他细胞上的MHC分子以及与MHC相关的分子、转运蛋白或其他已被细胞表面分子领域的专业人员熟知的受体分子。还提供了可与作为已选择的酶的底物蛋白或其它分子上的选择的酶的已知结合位点相互作用的定位手段。
本发明更进一步的实施方式中，提供的可复制的VLP暴露一个免疫原决定簇，如一种细菌毒素或一种含有对病原特异的相关抗原决定簇的异源病毒或细菌的蛋白。这个例子说明VLP可以作为免疫原或疫苗，这里例如，针对细菌毒素。在这种情况下，在表面携带相应免疫球蛋白的B淋巴细胞成为VLP的靶细胞，一旦被B淋巴细胞识别，这种细胞将增殖并产生适当的抗体。
修饰过的刺突蛋白的VLP或冠状病毒的制备可通过基因工程修饰病毒基因组实现，所以它在感染细胞中表达修饰过的S蛋白。这里，我们也提供以不同方法、通过在额外被冠状病毒感染的细胞中表达修饰S基因而制备含有改变了的刺突的冠状病毒。突变刺突的共同整合使病毒具有新的定位手段。在一个实施方式中，本发明提供了一种冠状病毒样病毒颗粒(VLP)，其包含一个基因组，其中不属于聚合酶功能基因(ORF1a/1b)或结构蛋白N、M、E和S基因的几个基因或基因簇中的至少一个基因的一个片段缺失，但没有导致复制能力完全丧失，因而在治疗用途上，这些VLP具备有利的特性，例如，用作基因运输目的载体或用作疫苗，运送一个恰当的抗原或表位并在所需宿主中引发免疫反应。换句话，冠状病毒的非必需基因在体外生长中不是必要的，但它决定病毒毒性。通过缺失非必需基因获得的减毒株提供了极好的病毒疫苗和治疗载体。现在，可以使用冠状病毒输送基因或接种疫苗，并可确信，用于运送基因或所需抗原的病毒样颗粒已足够减毒到不会导致特异性冠状病毒性疾病。当然，除了通过缺失任何一个或几个以上提及的非必需基因得到一个VLP，本发明也提供了一个VLP，其具有任何或编码结构蛋白的基因的缺失，优选地是功能性的，原因在于原有氨基酸的至少4个、优选为至少40个的重要的氨基酸肽段不表达，具体而言，在结构蛋白上的这样一个缺失可导致一个具有修饰的S蛋白(S)的VLP，编码刺突蛋白的部分核酸缺失，被外源基因序列任选地取代，因此，例如，为上述刺突提供了一种不同于原始冠状病毒刺突蛋白的天然外部结构域(或内部结构域)的结构域。
病毒I群(猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)可能是最复杂的成员)的典型的基因定位于S和E基因之间和N-基因的下游，例如，在N-基因和3’UTR(非翻译区)之间。病毒II群(鼠肝炎病毒(MHV)属于此群)，它们特异性的基因位于聚合酶和S基因之间和编码S和E蛋白的基因之间。在该群中，一个特异性的编码蛋白是血凝素酯酶(HE)蛋白，它掺入病毒，已经证明具有血凝素和酯酶的活性。HE活性不是必需的，它们的重要性有待于阐明。最后，病毒III群(冠状病毒原型-传染性支气管炎病毒(IBV)是代表)，序列位于S基因和E基因之间，也存在于M基因和N基因之间。然而对一些类型特异的基因，没有表达产物可在感染细胞中检测到，其他(例如MHV的HE基因)自然存在的毒性突变株中观察到缺失这些基因，可能是就其本身而言，一些基因不是蛋白产物而是其他基因产物，例如核苷酸序列(DNA或RNA)是重要或必需的。
依据它们的基因组结构，3群冠状病毒可被区分，本发明对I群(FCoV)提供了一个重组VLP，其中3a，3b，3c，7a或7b基因的一个片段(优选为导致至少一个功能性缺失，因为相应基因不表达或部分表达，因此导致基因产物缺失，功能丧失或至少与相应野生型基因产物功能性不同)或所述基因整体缺失。所述缺失的VLP，虽然在体内和体外具有复制能力，但已被大大减毒，使它基本上不能导致宿主疾病，使其非常适合治疗用途，例如，可用作基因或其他药物的运载工具(其中在所需时提供特异的定位)，和用作疫苗，被减毒株带有辅助引发免疫反应的重要免疫原决定簇。这样一个缺失的病毒I群，特别是猫科冠状病毒，如FIPV、它的3c和/或7b基因相应片段被缺失，特别可以直接用作疫苗，因为它通过它的结构蛋白(a.o.刺突)表达相关抗原和免疫原决定簇，并且通过这种方法的功能性缺失完成减毒可产生一个安全和有效的疫苗。这些活的减毒病毒仍然诱导最大的保护抗感染和/或疾病的体液和细胞免疫反应。而且，这样一个用于预防猫科疾病的缺失VLP，可以拥有异源性蛋白(或其功能性片段)，如猫白血病病毒(糖)蛋白、猫杯状病毒(糖)蛋白、猫疱疹病毒(糖)蛋白，可以产生二价的或多价疫苗。需要时，其他免疫或治疗的重要多肽，例如细胞因子，可被取代或同时整合。
此外，本发明为II群(MHV)提供一个重组VLP，其中优选的基因2a，HE，4a，4b，或5a的一个片段(优选的导致至少有一个功能性缺失)或所述基因作为整体被缺失。这样一个缺失的病毒II群，特别是MHV，为治疗用途提供有利的特性，例如，特别是作为运送载体。这样一个缺失的VLP，虽然在体内和体外具有复制能力，它的毒性被大大削弱，所以它基本上不能导致宿主感染疾病，使它非常适于治疗用途，作为基因或其他药物(其中在所需时提供特异的定位)的运载工具，作为疫苗使用，减毒后带有重要的免疫原决定簇，可以辅助诱导一个免疫反应。
对于III群(IBV)，提供了一个重组VLP，其中优选的基因3a，3b，5a或5b的一个片段(优选地导致至少一个功能缺失)或所述基因作为整体被缺失。在另一实施方式中，对于I，II，或III群，本发明提供一个具有复制能力的病毒样颗粒，所述颗粒来源于一个冠状病毒其中结构蛋白基因不以5′-S-E-M-N-3′顺序出现。这样一个具有基因顺序重排的可复制的VLP有2个重要的特性。一是安全性，来自于是VLP基因组和非重要领域病毒的同源重组不可能产生可存活的新子代的事实。另一个是由于基因改组而产生的减毒作用。这样一个具有基因重组顺序的可复制的VLP，为疫苗或基因输送用途提供很好的减毒的VLP，在此提供的也具有非必需基因的缺失。在此显示，对冠状病毒基因组中的决定聚合酶功能(ORF1a/1b)和结构蛋白S，E，M和N的基因的所谓的不可变的顺序进行改变具有令人惊奇的很好的耐受性，例如含有基因顺序S，M，E，N或E，S，M，N的VLP很容易获得。同时，外源性基因可插入病毒基因组不同位点，或者作为额外的基因或取代缺失的非必需基因；这些基因可表达并可在病毒传代中保持稳定。
另外一个实施方式中，本发明提供了一种重组的VLP，其中编码S蛋白的核酸已经被修饰或至少部分缺失。这些病毒的S蛋白负责结合细胞受体，随后将病毒和细胞膜融合，使病毒进入。这两个功能出现在分子的不同区域：氨基末端的受体结合和羧基末端的融合部分。因此，通过使用具有不同靶特异性的生物分子取代(部分取代)受体结合区域可以使冠状病毒与很多靶分子，例如在细胞表面表达的，相互作用。这样做没有影响S蛋白的融合功能，依据本发明的VLP可以融合或穿入不能被原始病毒感染的细胞。
本发明提供了来源于冠状病毒的病毒样颗粒(VLP)，它的一个或多个病毒膜蛋白拷贝被修饰，以便于包含外源病毒(冠状病毒性或非冠状病毒性)或非病毒来源的蛋白部分，该蛋白部分取代VLP膜蛋白的部分或整合入这些VLP膜蛋白形成它们的一个完整部分。通过这种方法，VLP拥有新的生物特性例如新定位手段，或免疫学的信息，或包含在病毒样颗粒里的具有特异性生物活性的蛋白，这些生物特性与紧邻或取代原始冠状病毒的天然刺突蛋白的VLP相关。
本发明的一个实施方式中，提供了具有缺失和/或重排的基因组的重组VLP，其中刺突蛋白的(一部分)外部结构域内(也就是病毒颗粒外表面被暴露部分)被另一种冠状病毒的刺突蛋白相应的结构域(或其部分)取代。因此，VLP获得另外一个细胞底物特异性，其具有进入对原始冠状病毒是不可接近的或不敏感的细胞的能力。本发明的另一个实施方式中，提供了由鼠肺炎冠状病毒(MHV)M和E蛋白组成的VLP，它包含MHV S跨膜+羧基端结构域组成的嵌合体刺突分子，但是不含猫感染腹膜炎冠状病毒(FIPV)的刺突蛋白外部结构域。这些VLP可进入猫细胞并输送MHV样颗粒。具有这些嵌合体刺突的颗粒通过编码氨基端结构域的区域被FIPV的相应结构域所取代的冠状病毒MHV S基因构建体产生。这些构建体被插入质粒中噬菌体T7聚合酶启动子的后面。然后，这个构建体和带有也是位于T7启动子后面的MHV M和E基因的质粒共转染，到表达T7聚合酶的已被重组疫苗病毒感染的OST-7细胞中。所得VLP包含嵌合体MHV/FIPV S蛋白。本发明的另一个实施方式中，用以上方法提供了一个具有感染性支气管炎冠状病毒(IBV)的刺突蛋白外部结构域或任何不属于冠状病毒的包膜病毒的包膜蛋白的外部结构域(或其部分)的VLP。例如，本发明提供了基于MHV的VLP，其在表面携带假狂犬病病毒(PRV)糖蛋白gD的外部结构域，而不是MHV刺突外部结构域或任一非病毒的I型膜蛋白的鲁米若(也就是氨基末端)结构域(或其部分)。用这种方法，提供了对鸡细胞或猪细胞或具有I型膜蛋白反应活性的细胞具有特异性的VLP。
本发明的另一个实施方式中，产生了具有颗粒内修饰的可复制的VLP。这通过以整合修饰的任何冠状病毒蛋白S、M、E和HE的构建体来获得。在冠状病毒颗粒中，这些蛋白使它们的羧基末端结构域附着在病毒包膜内部。因此，整合、附加或取代羧基末端结构域上的外源蛋白序列也附着其上。利用这个方法提供了包含来源于其他病毒或非病毒蛋白如激素、促红细胞生成素的蛋白部分或其片段的VLP。这可以产生包含一个生物活性蛋白或其片段的VLP，其被病毒包膜屏蔽，稍后当病毒膜降解或与其他膜融合时被释放和/或回收。这允许在细胞中进行体外、或在体内通过分泌腺体例如乳腺，产生具有生物活性的物质，否则这些物质将对产生这些物质的细胞是有害的或毒性的，或者这些物质由于其他原因需要以屏蔽形式产生。
如另一个实施方式中，以MHV为基础的VLP在它们的表面或内部带有一种酶活性分子如弗林蛋白酶(furin)、或细胞因子、或激素受体、或具有生物活性的另一种病毒或非病毒多肽。在这些实施方式中，VLP具有(额外的)定位手段，可直接将VLP定位到原始的冠状病毒不可到达的细胞。本发明提供了重组获得的可复制的VLP，可对其任何病毒蛋白的外部结构域和/或外部结构域做进一步修饰。通过修饰刺突蛋白的外部结构域，提供了具有作为定位手段的修饰的生物分子的VLP，该定位手段直接用于使VLP与其他反映或可以和定位手段相互作用的生物分子相互作用，例如细胞上的受体蛋白、比如是激素受体、B细胞上的特异性免疫球蛋白、呈现在T细胞和其他细胞上的MHC分子和MHC相关分子、转运蛋白或其他被细胞表面受体领域专业技术人员熟知的受体分子。定位手段也可以与蛋白上选择的酶的已知结合位点或其他作为选择的酶的底物的分子相互作用。
通过基因工程修饰病毒基因组，可以制备带有修饰的刺突的VLP或冠状病毒，因而它在感染的细胞内表达修饰的S蛋白。我们提供了制备包含以不用的方法改变刺突的冠状病毒，这是通过在另外的冠状病毒感染的细胞内表达修饰的S基因。突变刺突的共整合使病毒拥有了新的定位手段。例如，我们证明产生的MHV颗粒包含嵌合的MHV/FIPV S蛋白。嵌合的S基因构建体在L细胞中表达，该细胞随后被野生型MHV A59株(MHV-A59)或它的突变株感染。包含修饰的S蛋白的子代病毒从细胞里释放出来。为了证明定位改变，用病毒感染天然对MHV不敏感的猫细胞。通过免疫荧光法显示细胞被感染和产生正常的MHV。另一个实施方式中，我们证明生成的包含嵌合的S蛋白的MHV中，部分S外部结构域已经被人CD4分子相应的部分(也就是，鲁米若或氨基末端结构域)取代，这是一个非病毒蛋白的例子。这些修饰的冠状病毒通过CD4和HIVgp120复合体的特异性识别获得了感染被HIV感染的细胞和表达HIV包膜糖蛋白的细胞能力。结果，HIV感染细胞将被裂解性感染，有效地降低了体内被HIV感染的细胞的数量，因而降低疾病的严重性，甚至终止感染。
另一个实施方式中，我们证明依据本发明产生的VLP包含刺突分子，该刺突分子的氨基末端部分被单链抗体片段取代，该片段特异性识别通常不被冠状病毒感染的细胞表面表达的表面蛋白修饰的病毒可以感染这些难感染的细胞。这个实施例阐明这个方法的原理，既通过在病毒刺突中插入特异性定位信息，冠状病毒可以直接选择细胞或组织。例如，单链抗体片段可在噬菌体展示系统，或在其本领域已知的单链抗体片段克隆选择系统中被挑选出来。
本发明的另一方面涉及所述可复制的VLP或冠状病毒用作基因运载工具。这可以通过不同的方法来实现。一种方法是将外源性基因或序列整合入病毒基因组，以便病毒进入细胞时，这些基因被表达或插入的序列变成具有生物活性(如在细胞内病毒生成的核酶或反义RNA)。其他的方法是利用冠状病毒包装信号，使VLP包裹外源RNA进入颗粒。外源序列整合到冠状病毒基因组可通过操纵使用一个感染性的(c-)DNA克隆的基因操纵可以完成，该克隆是病毒基因组的全长DNA拷贝。这也可以通过RNA重组实现，其中把代表病毒基因组和包含外源基因的RNA引入被感染的细胞中，外源性序列通过同源重组发生整合。因为冠状病毒通常会杀死被它感染的细胞，在大多数的情况下减毒作用是非常重要的，以使它们不杀死与之作用的细胞。通过基因工程缺失或重排改变病毒，可以完成减毒作用。
本发明举例说明，减毒作用是通过重组缺失必需基因制备一个MHV突变体来完成的。一个鼠细胞系通过染色体整合MHVE基因允许E蛋白通过基因表达产生。通过重组在正常鼠细胞中产生了一个缺乏E基因的MHV，这使用了合成的包含一个除了缺少一个完整的E基因的MHV基因3’末端完整拷贝的RNA。E缺损型病毒只能在补充了缺陷的细胞里生长。产生的减毒病毒使它能感染其他鼠细胞，但没有生产性：E蛋白的缺失阻止子代组装。本发明随后举例说明将外源性基因序列整合入已减毒的或未减毒的VLP或冠状病毒中及其表达的原理。一个MHV衍生的VLP中重组了一个嵌合了MHV/FIPV S基因的报道基因如LacZ或绿色荧光蛋白。基因表达通过VLP感染的细胞分别被兰色或绿色荧光染色显示和该细胞获得的感染猫细胞的能力显示。另一个获得以冠状病毒为基础的输送工具的方法是，利用包含外源性RNA序列的VLP。将外源性RNA序列整合入颗粒要求将其包装进核壳内。通过核壳(N)蛋白分子的病毒RNA包装被特异性序列，N蛋白包装信号识别。在MHV中，包装信号包含1B基因中一个69核苷酸长的区域。外源(非冠状病毒的)的包含冠状病毒包装信号，或这些信号被保留但是外源性序列整合了的缺陷冠状病毒基因组的RNA在导入表达N，M和E(±S)基因的细胞时装配进VLP。VLP可将具有多种功能之一的确定的RNA介导进入靶细胞。例如本发明提供的例子是一个作为mRNA和确定一个特异性蛋白如毒素或凋亡诱导物或一个抗体片段的RNA。另一个例子是一个反义RNA或具有核酶活性的RNA。大多情况下，在每个细胞中获得多拷贝RNA以达到所需结果是必需的。VLP仅仅携带一个或一些假NC，这不一定是可行的。因此本发明提供了具有扩增信号的RNA以便于它们在靶细胞中增殖。为达到这个目的，使用Semliki森林病毒(SFV)复制序列作为RNA构建的基础。还包含冠状病毒衣壳化序列和确定报道蛋白的SFV来源的mRNA被装配进入VLP。SFV驱动的扩增允许报道蛋白在细胞内合成；在动物中报道蛋白抗体的出现证实VLP内容物的生产性输送。本发明还提供了一个VLP，其是一个抗体或表位运载工具，可诱导特异性的、细胞的和/或体液的、系统性的和/或局部的免疫反应，包括诱导和产生针对蛋白的特异性抗体，从而达到对抗病毒性的或非病毒性的病原体的感染来完成保护作用。例如，本发明提供了诱导抗如以上所描述的SFV来源的mRNA的报道蛋白的抗体，其还包含冠状病毒衣壳化序列和决定一个报道蛋白。另一个实施例通过对VLP的免疫证明在小鼠中可诱导抗如上所述的FIPV刺突和PRV gD的抗体。因此，可诱导出对VLP改变的基因组编码的蛋白和/或在VLP中因整合定位手段而部分或全部取代原有刺突蛋白的蛋白的免疫反应。实施例说明了诱导针对各种不同的蛋白(例如病毒、细菌、寄生虫、细胞和激素来源)的免疫反应的应用。
本发明还提供了完全保留了原有刺突蛋白的VLP，但是其被基因工程改变以减毒VLP和/或编码需要在原始的冠状病毒定位的细胞内运送的核苷酸序列。例如，用这种方法，通常可分别被TGEV或PRCV感染的肠上皮细胞，或呼吸上皮细胞，可与来源于TGEV或PRCV，如需要或其他细胞特异性冠状病毒的VLP相互作用而表达通常所述病毒不表达的蛋白。用这种方法，例如，囊性纤维化病人的呼吸上皮细胞可以被诱导表达由VLP改变的基因组编码的肺表面活性剂分子。为了进一步证明，本发明在说明书中提供了多个实施例，但其无意于限制本发明。
附图说明
图1：
A.顶端部分显示RNA重组技术的原理。猫细胞被fMHV感染(MHV衍生物带有一个嵌合的S蛋白，具有一个FIPV S蛋白的外部结构域，允许病毒在猫细胞中生长)并用带有完整的MHV S基因的合成的RNA转染。正确的RNA重组导致病毒获得同源刺突而重新具有在鼠科动物细胞中生长的能力。下面部分显示，在左边，图示产生供体RNA的质粒构建体的相关部分。在右边，描绘了使用这些供体RNA生成重组病毒的基因结构。
B.核苷酸序列显示在质粒构建体中产生了新的连接(导致病毒)，其位置和数量在A部分(左侧)已指出。
图2：
基因缺失的重组病毒的RT-PCR分析。从克隆的病毒中分离基因组RNA，使用合适的引物(1092和1127)采用RT方法制备cDNA，PCR使用引物1261+990或1173+1260来分别分析4a/b/5a基因或2a+HE基因区域。分析的要点在右边显示，PCR产物的琼脂糖凝胶的分析结果在左边显示。病毒分析显示在胶上部。右边的泳道内是标记DNA。
图3：
通过抽提总细胞质RNA分析病毒RNA在不同MHV缺失突变体感染的细胞内的合成，在放线菌素D存在时用33P正磷酸代谢标记，随后在1％琼脂糖凝胶中电泳。在顶端显示缺失病毒基因组的组成，在右边根据遗传组成指明次基因组RNA种类。
图4：
重组缺失病毒的一步生长曲线。使用缺失病毒和MHV-WT，高感染复数(m.o.i.)感染LR7细胞后，在不同时间，从每种培养基中取出样品，采用滴定方法分析这些样品的感染活性。
图5：
与图1一样，描述了基因顺序重排的病毒的构建。在左边是质粒构建体的相关部分：它们的MHV cDNA序列的基因组构成和质粒名称。在右边，是各个病毒的基因组结构和它们的名称。
图6：
通过重排基因组的重组病毒的一步生长曲线。使用病毒MHV-2aHE(DELTA2aHE)、MHIbMS、MHV-MSmN、或MHV-WT高感染复数感染LR7细胞，在不同的时间，从每种培养基中取出样品，用滴定方法分析这些样品的感染活性。
图7：
A.与图1一样，描述了插入了外源性基因的病毒的构建。左边表示，不同的质粒(载体)构建体，和他们的名称。右边表示，通过在猫细胞中被RNA重组的质粒获得的病毒的遗传构成和它们的名字。下面：用于引入位于海洋腔肠动物(renilla)荧光素酶(RL)和萤火虫荧光素酶(FL)基因前面的一个基因间启动子序列(IGS)的引物序列(和编号)。
B.RT-PCR分析携带RL基因的重组病毒。采用反转录技术，对病毒RNA用引物1412制备cDNA；对每个病毒，两个独立来源的病毒(以A1A和B1A；A2和B1；A7A和B2D的拓展命名)进行平行分析。随后，用PCR方法扩增所得cDNA和用于产生病毒的质粒(见图7A)，引物对在图片的底部指示。对于每组实验包括一个阴性对照样品(H2O)。给出了PCR片段和DNA标准参照(两侧泳道)的琼脂糖凝胶分析并在右边给出了产物的大小。
图8：
携带外源基因的重组病毒的一步生长曲线。用病毒高感染复数感染LR7细胞后，在不同的时间，从每个培养基中取出样品，通过滴定方法分析这些样品的感染活性。
A.携带海洋腔肠动物荧光素酶基因和MHV-WT的不同病毒生长曲线比较。
B.得自携带有萤火虫荧光素酶基因的MHV-EFLM病毒两个独立克隆与MHV-WT的生长比较。
图9：
通过重组病毒表达荧光素酶。LR7细胞被表达海洋腔肠动物荧光素酶(A)或萤火虫(B)荧光素酶的病毒和MHV-WT感染，并且在细胞内产生的荧光素酶的活性随着时间被监测。在B中，得自MHV-EFLM病毒的两个独立克隆与MHV-WT相比较。
图10：
携带外源基因的病毒的稳定性。LR7细胞被低感染复数感染重组病毒MHV-ERLM和MHV-EFLM(每个实验中独立获得2个克隆)传代8次。每一次传代后，在收获的培养基中，病毒的感染活性(TCID50)被测定。收集这样获得的病毒以5感染复数平行接种在LR7细胞中，感染后8小时，定量细胞中荧光素酶的表达量。结果用传代次数的函数图给出。
图11：
用HR2肽抑制MHV感染。LR2细胞在不同浓度的HR2肽存在下接种病毒MHV-EFLM，一个对应于病毒S蛋白的1003-1048氨基酸残基的肽作为对照。接种一个小时，洗细胞，并在没有肽的条件下进一步孵育。接种后4小时，分析荧光素酶表达量来评价感染细胞是否成功。以荧光素酶活性对所用肽的不同浓度为函数作图。
图12：
通过HR2肽抑制细胞与细胞的融合。在用MHV-A59接种培养的LR7细胞后，细胞被含有不同浓度HR2肽的琼脂培养基覆盖，次日记数噬斑数。
图13：
A.原始质粒载体pBRDI1的基因结构与它来源的亲代病毒的基因结构比较。顶部显示FIPV79-1146株的基因组组构。散点部分(也就是5’-最大的702碱基和3’-来源的9262碱基)被装配进入pBRDII的cDNA构建体；在这个质粒中，病毒cDNA位于噬菌体T7启动子序列的后面，插入序列两端有X7zoI(5′端)和NotI(3′端)的限制性位点。
B.质粒pBRDI2来源于pBRDI1，pBRDI1中的FIPV S基因已经被取代为嵌合的S基因(命名为mS)，它编码MHV-A59 S外部结构域并保留FIPV S蛋白跨膜和内部结构域序列。pBRDI2质粒可通过在质粒pBRDI1中用pTMFS1相应的片段取代SacI-Af1II片段得到。后者质粒来源于pTMFS(12)质粒，它包含嵌合基因序列，SacI-StuI片段被克隆进来从而用与FIPV pol1B 3’末端相应的序列延展MHV S序列5’端。
图14：
pBRDI构建体的详细序列。
A.FIPV基因组序列真正5′末端附近的pBRDI1和pBRDI2的核苷酸序列：XI-bol位点和T7噬菌体序列后跟一个G三联体，随后是FIPV序列。
B.在pol1A/pol1B连接的序列。
C.cDNA构建体的真正的3′末端核苷酸序列。3′端非翻译区域(3′UTR)后连接一段腺嘌呤核苷酸和NotI序列。
D.FIPV pol1B-MHV S核苷酸序列在pTMFS1和pBRDI2中转变。
图15：
在猫细胞中通过重组FIPV基因组RNA和pBRDI2来源的合成RNA来生成mFIPV的示意图。示出每个RNA的遗传结构，以及在鼠细胞中生长的重组体(也就是，包含嵌合mS)的病毒的选择。
图16：
分析mFIPV结构蛋白。鼠LR7细胞被mFIPV和MHV-A59感染，MHV-A59用作对比；猫FCWF细胞被FIPV79-1146株感染。感染细胞被35S氨基酸标记5-7小时p.i.，裂解细胞，用不同的抗体进行免疫沉淀反应，抗体包括：抗FIPV(泳道1，6和10)和MHV(泳道3，4，8和12)的多克隆抗体，抗猫S蛋白(Sf；泳道2，7和11)和鼠S蛋白(Sm；泳道5，9和13)的单克隆抗体。用12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白。MHV和FIPV蛋白在胶上的位置分别显示在左边和右边。mFIPV S蛋白被MHV S特异性血清沉淀，不被那些沉淀FIPV S蛋白的血清沉淀，它在胶里的迁移与MHV S蛋白类似。
图17：
mFIPV与MHV比较的一步生长曲线。LR7细胞被两种病毒高感染复数感染后，在不同的时间，从每个培养基中取出样品，采用滴定方法分析这些样品的感染活性。
图18：
FIPV缺失突变体的产生。在顶端显示了这个方法的原理：用合成的pBRDI来源的带有完整FIPV S基因的供体RNA和mFIPV RNA重组。下面描述了，构的pBRDI1质粒(左边)和生成的病毒(右边)的遗传组成。箭头指示使用引物的位置(和数量)，开放三角形表示缺失。在右边，碱基对(bp)的数量显示用所示引物预测获得的PCR片段的大小。
图19：
重组FIPV缺失病毒的遗传学分析。基因组RNA从缺失病毒和野生型FIPV重组体中分离出来。进行RT和PCR反应，使用引物1和9分析3ABC基因区域(A组)，使用引物10和11分析7AB基因区域(B组)。指出了DNA片段在琼脂糖凝胶上的位置，在凝胶的边上指出了他们的预测大小(c.f.图18，右)。右边，分析不同的泳道的病毒RNA。
图20：
冠状病毒刺突蛋白中七氨基酸重复区域(HR)和它们的氨基酸序列。
A.冠状病毒MHV-A59刺突结构示意图。刺突(S)糖蛋白包含一个N-末端信号序列(SS)和一个靠近C-末端的跨膜区域(TM)。S蛋白被蛋白水解(箭头)为一个S1和S2亚基，它们是非共价键连接。如示，S2包含2个保守的七氨基酸重复区域，HR1和HR2。
B.MHV-A59，HCV-OC43(人类冠状病毒株OC43)，HCV-229E(人类冠状病毒株229E)，FIPV和IBV(感染支气管炎病毒株Beaudette)的HR1和HR2结构域的序列对比。对比结果显示，在HCV-229E和FIPV的HR1和HR2存在一个明显的2个七氨基酸重复(14个氨基酸)的精确插入，这存在于所有1型病毒的S蛋白中。预测的疏水的7氨基酸重复a和d残基在序列上被指出来。在HR1中，一个“口吃(stutter)”引起预测的7氨基酸重复的移码。星号指出保守的残基。在这个研究中使用HR1，HR1a，HRIb，HRIc和HR2肽的氨基酸序列，它们对比下面用斜体字表示。括号中指出了GST融合蛋白产生N末端残基的蛋白水解位点。
图21＝表1：
序列是通过在图5中描述的质粒和这些质粒获得的病毒生成的连接显示的。在质粒中，相应于连接数的数字用箭头指出。(图5，左边)。
图22＝表2：
引物用于剪接重叠延伸的(SOE)-PCR和构建和分析重组FIPV的RT-PCR。它们在FIPV基因组上的位置：见图18，其中它们的数量和顺反义用箭头指出。引物的编号在pBRDI1序列中谈到。
图23＝附录1：
质粒pBRDI1的核苷酸序列。序列从XhoI位点(ctcgag)开始，随后是噬菌体T7聚合酶启动子序列和G三联体序列，其后跟随5′FIPV cDNA序列。
图24＝附录2：
质粒pBRDI2的核苷酸序列。序列从XhoI位点(ctcgag)开始，随后是噬菌体T7聚合酶启动子序列和G三联体序列，其后跟随5′FIPV cDNA序列。
图25：
感染MHV重组体的C57B1/6小鼠的存活。4周龄小鼠颅内接种不同稀释度的野生型和缺失型病毒重组体(每个病毒n＝5)并检测存活。给出了小鼠感染了2.5×105PFU的数据。动物感染MHV-WT后，第7天全部死亡，所有接种缺失突变体病毒的小鼠存活到感染后第21天。
图26A：
感染的17C11细胞在放线菌素D存在下被[33P]正磷酸代谢性标记，如(4，10)所述。使用Ultraspec试剂盒(Biotecx)纯化总细胞质RNA样品，用甲醛和甲酰胺变性，通过含甲醛的1％琼脂糖电泳分离，通过荧光自显影显示。不同RNA种类用与表4(＝图42)相应数字指示。
图26B
小鼠腹膜内接种1×106TCID5 MHV重组体，感染后4天，小鼠处以安乐死，在肝脏内病毒复制可通过定量噬斑实验分析。
图27
PT-PCR分析MHV-EFLM和MHV-minFL重组体病毒。病毒RNA与引物1475通过RT反应制备cDNA；对于每个病毒，两个独立来源的病毒(扩展命名为A1A和B1A，A6F和B4A)进行平行分析。随后，对cDNA和用来生成病毒的质粒(见图7A)用一对引物935和1474做PCR。琼脂糖凝胶分析PCR片段，并显示了一个标准分子量DNA。
图28：
RT-PCR分析MHV-EFLM和MHVminFL重组病毒。使用引物1412，对病毒RNA进行RT反应制备cDNA。对于每个病毒，2个独立来源的病毒(扩展命名为A2E和B4D)进行平行分析。随后，对cDNA和用来生成病毒的质粒(见图7A)用一对图底指示的引物来进行PCR。琼脂糖凝胶分析PCR片段，并显示了一个标准分子量的DNA。
图29-31：
重组体MHV的RNA合成。重组体病毒的基因组在顶部描述，它们被观察到的RNA表达模式显示在下面。
感染的17C11细胞在放线菌素D必须存在的条件下被[33P]正磷酸代谢性标记，如(4，10)所述。使用Ultraspec试剂(Biotecx)纯化总细胞质RNA样品，用甲醛和甲酰胺变性，通过含甲醛的1％琼脂糖电泳分离，通过荧光自显影显示。注意此图中次基因组RNA种属通过他们的组成命名，而不是RNA2到RNA7，因为数字命名对突变体不明确。
图29：MHV-WT，MHV-ERLM和MHV-EFLM
图30：MHV-EFLM和MHV-minFL
图31：MHV-MRLN、MHV-ERLM、MHV-2aRLS、MHV-MSmNRL、和MHV-MSmN
图32：
在体外，携带外源基因的重组体病毒的复制。病毒(顶部：MHV-MRLN、MHV-ERLM、MHV2aRLS；中间：MHV-EFLM、MHV-minFL；底部：MHV-ERLM、MHV-MSmNRL)高感染复数感染LR7细胞，感染9小时后从每个培养基中取出样品，用滴定分析这些样品的感染活性。
图33：
荧光素酶通过重组体病毒的表达。感染9小时后，一些重组病毒的萤火虫和海洋腔肠动物荧光素酶的细胞内表达量参照厂商的说明书(Promega)进行测定。顶部：MHV-EFLM和MHV-minFL；底部：MHV-ERLM和MHV-MSmNRL。
图34：
萤火虫荧光素酶体内的表达。在实验中使用8周龄的，MHV阴性，雌性BALB/c小鼠。小鼠内鼻腔被接种MHV-EFLM。每个剂量使用4只动物(106TCID50)。感染第4天，处死小鼠，取出肝和脑。器官被迅速冻存在液氮里，在细胞培养裂解试剂盒中匀浆，该试剂盒是荧光素酶分析系统(Promega)提供的。依据生产厂商的说明书，使用发光计(LumacBiocounter M2500)检测FL活性。
图35：
用不同缺失突变体：FIPV79-1146、r-wtFIPV、FIPVA3abc、FIPVA7a；和FIPVA3abc+7ab(100pfu)接种猫后观察存活率。
图36：
用FIPV缺失变体接种猫后，在不同的时间点，进行FIPV中和抗体滴定检验。
图37：
被FIPV79-1146(100pfu)感染的猫的存活率。没有预先接种(□)的猫(N＝4)；预先接种了FIPVA3abc(◆)的猫(N＝5)；预先接种了FIPVA7ab(□)的猫(N＝5)；预先接种了FIPVA3abc+7ab(□)的猫(N＝5)。
图38：
携带外源基因的重组FIPV病毒一步生长曲线。被病毒高感染复数感染的FCWF细胞，在不同的时间，从每种培养基中取出样品，滴定分析这些样品的感染活性。重组体nr.1(□)和nr.9(◆)。
图39：
通过重组病毒表达的荧光素酶的表达。FCWF细胞被表达海洋腔肠动物荧光素酶(nr.1□；和nr.9◆)的病毒和wt-rFIPV(EI)感染，随时间，检测细胞内生成的荧光素酶活性。
图40：
缺失非必需基因的重组FIPV病毒的一步生长曲线。FCWF细胞被病毒高感染复数感染后，在不同的时间，从每种培养基中取出样品，滴定分析这些样品的感染活性。
图41＝表3：
携带缺失非必需基因的重组MHV的RNA合成的定量。
图42＝表4：
具有重排基因组的重组MHV的RNA合成的定量。
图43＝表5：
接种疫苗和攻击后的临床表现得分表格。
图44＝表6：
用不同FIPV791146突变体进行初始接种后，总的临床得分。
图45＝表7：
FIPV79-1146攻击后，总的临床得分。
图46A：
携带2个外源基因的重组病毒的复制。用病毒(MHV-RLFL，MHV-2aRLS和MHV-EFLM)高感染复数感染LR7细胞，在感染后第9小时，从每个培养基中取出样品，滴度分析这些样品的感染活性。
图46B：
通过重组病毒表达的荧光素酶的表达。在感染的第9小时，重组病毒的萤火虫和海洋腔肠动物荧光素酶的细胞内表达量依据厂商(Promega)的说明书测定。(MHV-RLFL，MHV2aRLS，和MHV-EFLM)。
具体实施方式
I.小鼠肝炎病毒(MHV)，A59株(MHV-A59)。
1.活的减毒病毒的产生
a.缺失基因的重组MHV的构建
b.重组体基因型的确认
c.通过MHV缺失突变体的RNA合成
d.组织培养物的生长表型
e.重组病毒对小鼠的毒性
2.具有基因顺序重排的重组病毒的产生
a.基因顺序重排的重组病毒的构建
b.基因顺序重排的MHV突变体的RNA的合成
c.组织培养物的生长表型
d.重组病毒在小鼠中的复制
3.表达外源基因的重组病毒的产生
a.携带报道基因的重组病毒的构建
b.通过重组病毒的RNA合成
c.表达海洋腔肠动物或萤火虫荧光素酶的病毒复制
d.在细胞培养物中表达海洋腔肠动物和萤火虫荧光素酶
e.外源基因在病毒传代过程中的保持
f.在小鼠中表达萤火虫荧光素酶
g.自一个基因组中表达2个外源基因的MHV的产生
h.表达嵌合刺突-GFP基因的MHV的产生
4.来源于刺突蛋白的肽对感染和细胞融合的抑制
II.猫感染腹膜炎病毒(FIPV)，79-1146株
1.在小鼠细胞中生长的猫冠状病毒mFIPV的产生
a.构建一种合成的RNA转录载体
b.通过RNA重组产生mFIPV
c.mFIPV蛋白分析
d.mFIPV生长特性
2.通过基因缺失产生活的减毒的FIPV疫苗
a.构建合成的RNA转录载体
b.缺失基因的重组FIPV的产生
c.缺失基因的重组FIPV的遗传学分析
d.缺失基因的FIPV的生长特性
e.重组病毒对猫的毒性
f.重组病毒诱导的免疫反应
g.FIPV缺失病毒用作减毒活疫苗
3.插入和表达外源基因
a.携带报道基因的重组病毒的构建
b.病毒的一步生长
c.海洋腔肠动物荧光速酶的表达
4.多价的基于FIPV的疫苗的产生
a.基于FIPV载体的一种多价猫白血病病毒(FeLV)疫苗的构建
b.基于FIPV载体的一种多价猫免疫缺陷病毒(FIV)疫苗的构建
c.基于FIPV载体的一种多价猫杯状病毒(FCV)疫苗的构建
d.基于FIPV载体的一种多价猫传染性粒细胞缺乏症病毒(FPV)疫苗的构建
e.基于FIPV载体的一种多价猫疱疹病毒(FHV)疫苗的构建
f.基于FIPV血清II型载体的一种多价FIPV血清I型和II型疫苗的构建
5.具有重排基因序列的重组病毒的产生
6.抗犬病原体的FIPV为基础的疫苗的产生
a.抗犬瘟热病的FIPV为基础的疫苗的产生
b.抗犬细小病毒症的FIPV为基础的疫苗的产生
c.抗传染性犬肝炎病的FIPV为基础的疫苗的产生
d.抗小狗出血热病的FIPV为基础的疫苗的产生
III.传染性胃肠炎病毒(TGEV)
1.一个抗TGEV的活的减毒的疫苗的产生
2.TGEV多价疫苗的产生
a.基于TGEV载体的一种多价猪细小病毒(PPV)疫苗的构建
b.基于TGEV载体的一种多价猪流行性感冒病毒疫苗的构建
c.基于TGEV载体的一种多价非洲猪发热病毒疫苗的构建
d.基于TGEV载体的一种多价猪环病毒2型疫苗的构建
e.基于TGEV载体的一种多价猪呼吸与繁殖综合症病毒疫苗的构建
3.基因顺序重排的重组病毒的产生
IV.鸟传染性支气管炎病毒(IBV)
1.用减毒的IBV产生一个活的疫苗
2.产生多价IBV疫苗
aI.基于IBV载体构建一种保护并抗不止一种的IBV血清型的多价疫苗
aII.基于IBV载体构建一种保护并对抗新城疫的多价疫苗
b.基于IBV载体构建一种保护并对抗鸟流行性感冒的多价疫苗
c.基于IBV载体构建一种保护并对抗鸡贫血病毒(CAV)疾病的多价疫苗
d.基于IBV载体构建一种保护并对抗鸟呼吸道和肠道疾病的多价疫苗
e.基于IBV载体构建一种保护并对抗传染性华氏囊病的多价疫苗
f.基于IBV载体构建一种保护并对抗马立克病(Marek’s病)的多价疫苗
g.基于IBV载体构建一种保护并对抗传染性喉气管炎的多价疫苗
3.携带基因顺序重排的重组病毒的产生
V.人类冠状病毒(HCoV)株229E(HCoV-229E)
1.基于减毒的HCoV-229E构建一个活疫苗
2.一个抗HCoV株OC43的活的减毒的疫苗
3.多价HcoV疫苗的产生
a.基于HcoV载体构建一种保护并对抗呼吸道合胞病毒(RSV)的多价疫苗
b.基于HcoV载体构建一种保护并对抗轮状病毒的多价疫苗
c.基于HcoV载体构建一种保护并对抗诺沃克样病毒的多价疫苗
d.基于HcoV载体构建一种保护并对抗流感病毒的多价疫苗
4.基因顺序重排的重组病毒的产生
I.小鼠肝炎病毒(MHV)A59株(MHV-A59)
I.1.活的减毒病毒的产生
总体目标：确定是否不属于决定聚合酶功能(ORF1a/1b)或结构蛋白N、M、E、和S的基因或基因簇的冠状病毒基因组的缺失是耐受的并产生可存活的病毒，即使将这些基因序列一起去除，确定当接种到小鼠体内，是否这样的缺失在病毒中存在减毒的作用。
I.1.a.缺少基因的重组MHV的构建
具体目的：产生MHV-A59缺失突变体，它缺乏2a+HE基因(MHD□Δ2aHE)，4a+4b+5a基因(MHV-□Δ45a)，和2a+HE+4a+4b+5a基因(MHV-min)。
方法：使用fMHV定位RNA重组体(3，9，10)，MHV-A59衍生物感染猫细胞(FCWF)不感染(LR7)细胞(7)，合成的供体RNA携带有意的缺失(图.1A，顶部)。
步骤：用质粒pMH54(7)构建用于产生合成的供体RNA的转录载体，该质粒编码一个失控转录，包括MHV-A59(467nt)基因组5’末端与HE基因的密码子28融合，到达基因组3’末端(图1)。质粒pMH54用于重构建重组WT-MHV，一个fMHV衍生物又可感染鼠细胞。转录载体pXH□Δ45a缺少开放阅读框架4a，4b和5a。为了构建这个质粒，使用了引物1089(5ACCTGCAGGACTAATCTAAACTTTATTCTTTTTAGGGCCACGC-3′)，从质粒pB59(2)中获得一个PCR产物，该引物编码一个PstI/Sse8387I限制性位点，一个基因间序列(IGS)与E或5b基因的上游序列互补，引物1092(5′-CCTTAAGGAATTGAACTGC-3′)与M蛋白编码区5’末端互补。PCR产物被克隆进入pGEM-T Easy(Promega)，依据厂商的说明书，产生pXH0803。PCR产物随后被PstI和EcoRV切除下来，克隆进入已经被Sse8387I和EcoRV处理过的pMH54，结果产生pXH□Δ45a。转录载体pXH□Δ2aHE缺少开放阅读框架2a和HE，并包含了大约1200bp的融合到S基因的聚合酶基因3’末端。为了构建这个质粒，通过剪接重叠延伸PCR获得一个PCR产物。从质粒p96(1)获得一个PCR产物，通过使用引物1128(5′-ACGGTCCGACTGCGCGCTTGAACACGTTG3′)，它编码一个RsrII限制性位点，并和开放阅读框架1b停止密码子上游的1200bp互补，另一引物为1130(5′-CATGCAAGCTTTATTTGACATTTACTAGGCT-3′)，它与聚合酶编码区3’末端和S基因上游IGS区互补。从质粒pMH54可获得其他的PCR产物，使用引物1129(5GTCAAATAAAGCTTGCATGAGGCATAATCTAAAC-3′)，它与引物1130互补，和另一引物1127(5′-CCAGTAAGCAATAATGTGG-3′)，它与S基因5’末端互补。PCR产物纯化和混合后，使用引物1128和1127扩增。在第二次PCR后所得产物被克隆进入pGEM-T Easy，可生成pXH1802。PCR产物被RsrII和AvrII切开，克隆进入已被同样酶处理过的pMH54，结果生成pXH□Δ2aHE。转录载体pXHmin具有融合进S基因的开放阅读框架1b 3’末端并且缺失开放阅读框架4a，4b和5a。使用PstI和EcoRV切开pXH0803，所得片段被克隆进入已被Sse83871和EcoRV处理过的pXH□Δ2aHE，可构建这个载体。所有PCR生成片段的组成都通过测序来证实。
产生缺失突变体病毒，pMH54来源的质粒转录出供体RNA，用电穿孔法转染进入已经被fMHV感染的猫FCWF细胞。这些被感染和转染的细胞被培养在单层小鼠LR7(7)细胞上。37C孵育24小时，去除细胞培养物上清夜收获子代病毒，通过2次LR7细胞内的噬菌体纯化挑选候选的重组体。
结果：使用每个合成的供体RNA可获得清晰的噬菌体。
结论：获得了重组体病毒，其可重新获得在鼠细胞内生长的能力。
I.1.b.重组体基因型的证实
目的：采用RT-PCR证实所获重组体病毒的遗传组成。
步骤和结果：克隆的重组体病毒，一个来自重组实验，在LR7细胞中产生，分离病毒RNA，采用标准方法对基因组RNA进行RT-PCR，见图2。为了证实开放阅读框架4和5a的缺失，使用引物1092(5CCTTAAGGAATTGAACTGC-3′)进行RT反应，这段引物与M基因的5”末端互补，而使用引物1261(5′-GCTGCTTACTCCTATCATAC-3′)和990(5′-CCTGATTTATCTCTCGATTTC-3′)完成RCR反应，这对引物分别与E和S基因的3’末端互补。在重组体MHV-WT中，观察到一个具有预期1328bp相应大小的RT-PCR产物(图2，顶部)。如期望，对于MHV-□Δ2aHE，观察到一个相同长度的PCR产物。相反，对于MHV-□Δ45a和MHV-min，观察到一个小得多的RT-PCR产物。小片段的RT-PCR产物相应于736bp缺失。用相似的方法分析开放阅读框架2a和HE的缺失。使用引物1127(5′CCAGTAAGCAATAATGTGG-3′)进行RT反应，它与S基因的5’末端互补。使用引物1173(5′-GACTTAGTCCTCTCCTTGA-3′)和1260(5′-CTTCAACGGTCTCAGTGC-3′)进行PCR反应，它们分别与1b基因的3’末端和S基因的5’末端互补。对于MHV-WT和MHV-□Δ45a，检测到一个比MHV-Δ2aHE和MHV-min的产物大很多大很多的PCR产物(见图2，底部)。大小的不同相应于2164bp的缺失。最后，最新生成的连接，出现在缺失突变体病毒的基因组中(图1A[三角形]和图1B[序列])，通过对RT-PCR产物测序进行分析。最后PCR产物被克隆进入pGEM-T easy载体(Promega)。所获得的序列与预想的完全一致。
结论：构建的病毒突变体具有意欲的遗传缺失。
I.1.c.通过MHV缺失突变体的RNA合成
目的：证实被突变体病毒感染的细胞内的RNA合成的模式。
步骤：被感染的17C11细胞在放线菌素D必须存在的条件下用[33P]正磷酸进行代谢性标记，如(4，10)所述。细胞质总RNA样品的纯化使用Ultraspec试剂盒(Biotecx)，使用甲醛和甲酰胺变性，采用含有甲醛的1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果通过荧光自显影显示出来(图3，注意在该图中，次基因组RNA种类以它们的组成命名，而不是从RNA2到RNA7，因为数字法命名对于缺失突变体是不明确的)。
结果：对于重组体MHV-WT，RNA模式和6个次基因组(sg)RNA种属及基因组(g)RNA的摩尔数量与先前报道的MHV(10)(4)(5)(8)十分相似，有一个明显例外。4-5a/E-M-N sgRNA，通常表示为RNA4，比起先前在野生型MHV中观察到的要极为丰富。
这大概是因为在共有序列转录调控信号(5′AAUCUAAAC3′)上游13，15，和18位置上3个核苷酸的改变，该信号在基因4前边(图1)，该基因导入转录载体pMH54产生S基因下游的Sse8387I位点(7)。对于缺失突变体，所有不同的sgRNA具有相对于它们预期大小的迁移率(图3和表3)，没有发现显著的特别的种类。突变SgRNA种类相关的摩尔数量与来源于相应的转录调控信号的野生型对应物非常的相似。
结论：结果证实重组体病毒的基因型并证明它们预期在RNA水平上的表型。
I.1.d.组织培养物生长表型
目的：比较体外生长表型。
步骤和结果：铺满的单层LR7细胞在35-mm培养皿中生长，用各个重组体病毒(8PFU/细胞)感染细胞，在不同感染时间(p.i.)通过在LR7细胞上的滴定来检测培养基中病毒的感染活性。
计算TCID50(50％组织培养物感染剂量)值和绘图(图4)。重组体病毒在诱导延伸胞体或致细胞病变效应或它们的噬斑大小等方面没有不同。但是，在它们一步生长动力学方面，MHV-□Δ45a和MHV-min与MHV-WT和MHV-□Δ2aHE不同(图4)。这2种不同病毒在所有的时间点都显示了大约低10倍的滴度。
结论：所有缺失病毒在体外能很好增殖，虽然缺失基因4和5a有一些轻微的影响。
I.1.e.重组体病毒在小鼠中的毒性
目的：确定是否遗传缺失影响病毒毒性。
步骤和结果：重组体病毒在它们天然宿主小鼠中的特点。第一步，我们决定重组体病毒的毒性。进行LD50(50％致死剂量)的测定，在C57B1/6小鼠颅骨内以4个10倍连续稀释法(5×105-5×102)接种阴性MHV重组体病毒。病毒用含0.75％胎牛血清白蛋白的PBS稀释。25μl体积用于注射左大脑半球。每个病毒的每个滴度使用5只动物。采用Reed-Muench方法，通过接种21天后死亡数来计算LD50值。
显然，相比重组MHV-WT，缺失突变体病毒的毒性被减弱。MHV-WT病毒的LD50是1.8×104，而缺失突变体没有LD50。虽然，采用较高剂量接种的动物显示一些疾病迹象，即使当接种任何缺失突变体病毒剂量达到50,000PFU/小鼠时也没有动物被感染致死。这意味着这些病毒的LD50值超出50,000并且可能比100,000高很多。
图25说明小鼠被病毒感染死亡率的动力学，WT和缺失病毒的最高接种剂量是2.5×105噬斑形成单位(PFU)。
当所有的动物被野生型病毒接种，接种后7天死亡，缺失病毒被高度减毒，显示没有死亡和较少严重临床症状。尽管没有观察到死亡，所有被□45a和□2aHE病毒感染的小鼠在感染后第一个星期出现弓背，面容凌乱和蹒跚的步伐的临床症状；在被MHV-min感染的小鼠中，观察到较少的小鼠出现较轻的症状。
结论：缺失基因2a+HE或基因4a+4b+5a或所有这些基因联合缺失，在小鼠中显示出一个显著的减毒表型。换句话，冠状病毒的非必需基因在体外生长时不是重要的，但是它决定了病毒的毒性。通过它们的缺失获得的减毒作用，因而提供了极好的病毒疫苗和治疗载体。
I.2.基因顺序重排的重组体病毒的产生
总体目标：确定在冠状病毒的基因组中决定聚合酶功能(ORF1a/1b)和结构蛋白S，E，M，和N的基因不变的顺序对这些病毒的存活是必需的或是否重排这个顺序是可耐受的。
I.2.a.基因顺序重排的重组体病毒的构建
具体目标：移动M和/或E基因，改变结构蛋白基因在MHV-A59基因组中的相对位置产生MHV-A59突变体。
方法：用fMHV和带有有意重排的合成的供体RNA的定向RNA重组。(图5，顶部)。
步骤：用于产生定向重组供体RNA的转录载体通过质粒pMH54和pXH□2aHE构建(如上所述)。为了产生转录载体pXHSM45N(图5，左下部分)，通过剪接重叠延伸(SOE)-PCR生成一个PCR产物，其包含M基因3’末端和N基因5’末端和在M基因和N基因上游的IGS之间引入了一个EcoRV限制性位点。为了产生这个PCR片段，使用了对应于含有单一的KpnI位点的M基因区域的外部的引物1C(5′-GTGTATAGATATGAAAGGTACCGTG-3′)和对应于含有单一的NheI位点的N基因区域的外部引物1097(5′CGAACCAGATCGGCTAGCAG-3′)。引物1095(5′-AGATTAGATATCTTAGGTTCTCAACAATGCGG-3′)和引物1096(5′-GAACCTAAGATATCTAATCTAAACTTTAAGGATG-3′)作为内部引物使用。它们对应于M和N基因之间的序列并引入了EcoRV限制性位点。所得PCR产物被克隆进入pGEM-T easy(Promega)，生成载体pXH0302。下一步构建pXHSM45N，pMH54用限制性酶Sse83871和EcoRV处理，所得片段被克隆进入被T4 DNA聚合酶处理后成为平端的pXH0302的EcoRV位点生成载体pXH0902。切除pMH54的Sse8387I-EcoRV片段后，保留的载体也被T4 DNA聚合酶处理成为平端，再连接生成质粒pXH1401。最后，质粒pXH0902被限制性酶NheI和BssHII处理，所得片段被克隆进入被同样酶处理过的pXH1401，生成pXHSM45N。
为了构建pXHMSmN，首先，使用Sse83871酶和BssHII酶将ORF4，5和M移出pMH54，随后，用T4 DNA聚合酶处理后在连接剩余的载体，生成pXH□45M5′。接下来，用NheI酶和BssHII酶处理pXH0302所得的片段被克隆进入用同样酶处理的pMH54，生成pXHMeN。随后，用限制性酶EcoRV切pXHMeN所得的片段被克隆进入pXH1802(如上所述)，其被HindIII消化并被DNA聚合酶的Klenow片段处理，生成pXH0305B。用限制性酶Mlu1和EcoRV处理pMH54所得的片段被克隆进入已被同样的酶处理过的pB59(2)，，可生成载体pXH2801。接下来，限制性酶KpnI和PstI处理pXH2801所得片段用T4 DNA聚合酶处理后被克隆进入被限制性酶HindIII和DNA聚合酶1的Klenow片段处理的pXH1802，生成pXH0806。随后，用SpeI和AE11II消化pXH0305B所得片段被克隆进入被同样的酶处理过的pXH0806，生成pXH1506。最后，限制性酶RsrII和AvrII处理pXH1506所得片段被克隆进入已被同样的酶处理过的pXH□45M5′，生成pXHSmN。
为了构建转录载体pXHIbMS，载体pXHMeN用EcoRV处理。所得片段被移出，将载体再连接生成pXH□M。接下来，用RsrII和AvrII消化pXH0305B所得片段被克隆进入被同样的酶处理过的pXH□M，生成pXH1bMS。
所有的构建通过限制酶切和/或测序证实。它们在图5(左边)以图描述。所有新产生的连接用箭头指出，包括在pMH54(7)中的S基因下游的Sse83871位点的引入，同时它们的序列显示在表1中。重组体病毒通过在转录载体失控转录物和上面描述的fMHV基因组之间的RNA-RNA重组产生。经过2次在LR7细胞内的噬斑纯化，通过基因组RNA的逆转录酶PCR分析病毒，发现包含预期组构的基因组。
结论：冠状病毒的严格的基因顺序不是生存能力的一个必需的先决条件。
I.2.b.通过基因顺序重排的MHV突变体的RNA合成
目的：证实感染突变病毒的细胞中RNA合成的模式
步骤：感染的17C11细胞在放射菌素D必须存在的条件下，被[33P]正磷酸代谢性标记，如(4，10)所述。总细胞质RNA样品使用Ultraspec试剂盒(Biotecx)纯化，用甲醛和甲酰胺变性，在含有甲醛的1％琼脂糖电泳中分离，荧光自显影显示结果(图26A)。
结果：冠状病毒通过产生一个嵌套sgRNA的3’联合末端表达它们的基因组。因此预期具有重排基因组组构的重组体病毒合成与亲代病毒存在明显不同的病毒RNA的模式。对重建的野生型病毒(MHV-WT)和MHV-□2aHE，RNA模式和基因组(g)和sgRNA种类的数量与先前的观察是非常相似的(图3)。注意，MHV-□2aHE和它的衍生物MHV-MSmN和MHV-1bMS不能合成编码2a蛋白的sgRNA种类。对于重排基因组的MHV突变体，所有不同的sgRNA有相对应于它们预知大小的迁移率(图26A和表4)，没有观察到明显的额外的种类。MHV-SM45N生长很差，因此只是微弱标记。除了一个应该被翻译为M蛋白的，所有sgRNA均可被检测到。由于未知的原因，这个sgRNA的低丰度可能是导致病毒生长减弱的原因。总体来说，通过重组病毒感染的细胞合成病毒RNA模式精确的反应了对冠状病毒基因组组构的改变。
结论：结果证实重组体病毒的基因型，证明它们在RNA水平上预期的表型。
I.2.c.组织培养物生长表型
目的：比较突变体病毒体外生长表型
步骤和结果：生长在35mm培养皿中铺满的LR7单层细胞用每种重组体病毒(8PFU/细胞)感染，感染后不同时间，培养基中的病毒感染活性通过对LR7细胞滴定测定。
计算TCID50值和绘图(图6)。所有病毒，除了突变体MHV-SM45N以外都通过这种方法分析。后者的感染滴定量非常低(比WT重组体MHV低大约1000倍)以至于不能完成一步生长曲线。虽然，MHV-1bMs与WT重组体比较，促使合胞体稍慢，所有病毒在一步生长曲线中处复制到大约同样的程度。
结论：除了突变体病毒MHV-SM45N之外，基因重排在它们体外生长特性上没有显著的影响。
I.2.d.在小鼠中，重组体病毒的复制
目的：确定是否基因顺序重排的病毒可以在小鼠体内复制。
步骤和结果：在实验中使用8周龄，MHV-阴性，雌性BALB/c小鼠。病毒用PBS稀释，使用100μl(106TCID50)总量注射入小鼠腹膜腔。每种病毒接种4只动物。感染第4天，处死小鼠，取出肝脏。
肝脏放进1.5ml DMEM，称重并冻存在-80℃，直到滴定病毒。匀浆器官后，通过单层LR7细胞上的噬斑测定决定病毒滴度。研究MHV-WT，MHV-□2aHE和MHV-MSmN在它们的天然宿主，小鼠中的复制。先前确定MHV-WT在小鼠中50％的致死剂量是2.7×104PFU，MHV-□2aHE的毒性不足以测定50％致死剂量(I.1.e部分)。因此，我们现在决定分析重组体病毒的体内复制。小鼠腹膜内接种1×106TCID50，感染后第4天，小鼠实施安乐死，测定肝脏内的病毒复制。结果显示在图26B。MHV-□2aHE和MHV-MSmN在肝脏内有相似程度的复制，虽然它们比MHV-WT低很多。缺失ORF2a和HE产生一个重组体病毒(MHV-□2aHE)，它在天然的宿主中被减毒，如I.1.e部分，然而在这个测定中，冠状病毒基因顺序的额外的重排(MHV-MSmN)不能产生一个更减毒的表型。
结论：缺少典型的冠状病毒基因组组构的基因顺序重排的病毒和缺少ORF2a和HE的病毒可以在它们天然宿主小鼠中复制。
I.3.表达外源基因的重组体病毒的产生
目的：确定是否病毒基因组可以在不同位置插入外源基因，或者是，一个额外的基因或取代缺失的非必需基因或一个基因顺序重排组合；确定是否这些基因表达和是否它们在病毒体外传代过程中能够稳定保留下来。
I.3.a.携带报道基因的重组体病毒的构建
目的：生成具有外源基因的MHV-A59病毒。
步骤：构建一些在基因组的不同位置上包含一个外源报道基因的病毒(见图7A)。使用2个编码海洋腔肠动物荧光素酶(RL)和萤火虫荧光素酶(FL)的报道基因。对这两个基因，构建一个MHV基因间序列(IGS)在其之前质粒。通过这个构建体，表达盒(基因加上IGC)可以被转移进入不同的转录载体。
第一步，MHV IGS被克隆在RL基因的前面。完后，引物1286(5′-GGATACTAATCTAAACTTTAG-3′)和1287(5′-CTAGCTAAAGTTTAGATTAGATATCCTGCA-3′)退火，克隆进入已被NheI和PstI处理的pRL-null(Promega)，生成pXH1909。采取如下步骤构建在位于2a和S(pXH22aRLS)基因之间包含RL基因的转录载体。使用HindIII和MluI处理p96(1)，产生的片段克隆进入已被HindIII和BssHII处理的pXH1802(如上所述)，生成pXH2103。接下来，使用EcoRV和XbaI将RL表达盒从pXH1909移出，使用DNA聚合酶1的Klenow片段处理，克隆进入已被HindIII酶切并被Klenow片段处理的pXH2103中，生成pXH2509A。最后，使用RsrII和AvrII消化pXH2509A生成的片段克隆进已被同样的酶处理过的pMH54，构建pXH22aRLS。
对构建pXH2ERLM，用产生pXH2509A的同样的表达盒被克隆进入已被EcoRV消化的pMH54。
同样的表达盒克隆进入已被EcoRV处理的pXHMeN(如上所述)，生成pXH2ERLN。随后，用EcoRV酶切pXHMeN所得的片段克隆进入已被相同的酶处理的pXH2ERLN，生成pXH2MRLN。pXHMSmNRL通过克隆海洋腔肠动物表达盒进入EcoRV处理的pXHMSmN(如上所述)构建。
对构建PXHEFLM，首先克隆FL基因在用于RL表达盒的同样的IGS后面。之后，使用AvrII和XbaI酶切pSP-Luc+(Promega)，将荧光素酶基因移出克隆进入已被NheI和XbaI处理的pXH1909，生成pXH2711。随后，使用EcoRV和XbaI酶切pXH2711切出FL表达盒，用DNA聚合酶I的klenow片段处理，克隆进入被EcoRV酶切的pMH54，生成pXHEFLM。
质粒pXHminFL的构建是通过克隆FL表达盒进入被EcoRV消化的pXHmin(如上所述)。这个质粒缺少ORF2a/HE/4a/4b/5a，包含E和M基因之间的FL基因。
通过限制性酶切和测序分析确认所有的构建体，通过如上所述的转录载体失控转录和fMHV基因组之间的RNA-RNA重组，可生成重组体病毒。所得病毒用RT-PCR分析进行遗传学确认。
包含RL基因的重组体病毒结果示于图7B和27。为了确定这个基因的插入，对基因组RNA使用与RL基因5’末端相互补的引物1412(5′-CTGCGGACCAGTTATCATC-3′)进行RT反应。随后，进行个PCR反应，对MHV-ERLM和MHV-MRLN使用引物1091(5′-GTTACAAACCTGAATCTCATCTTAATTCTGGTCG-3′)和引物1413(5′-CATCCGTTTCCTTTGTTCTGG-3′)，或对MHV-2aRLS使用引物1173(5′-GACTTAGTCCTCTCCTTGATTG-3′)和引物1413。引物1091和引物1173分别与4b基因和1b基因的3’末端相对应，而引物1413与RL基因的5’末端相对应。采用适当的转录载体作为阳性对照。在所有的实验中，所得PCR片段具有和阳性对照相同的大小，而对照水为阴性。观察到(和预期的)MHV-2aRLS片段大小约1000bp，MHV-ERLM片段大小约670bp，MHV-MRLN(7B)片段大小约1300bp。对MHV-MSmNRL，使用引物1091和引物1413及引物1173和引物1413进行PCR。采用适当的转录载体作为阳性对照。在所有的实验中，所得PCR片段具有和阳性对照相同的大小。使用引物1091和引物1413进行PCR反应，观察到(和预期的)片段大小约670bp，使用引物1173和引物1413(7B)进行PCR反应，观察到(和预期的)片段大小约1200bp(注：在图7B和27中，对每种类型病毒，分析和包括了2个独立获得的克隆)。结果证实RL基因插入MHV基因组的正确位置。
包含FL基因的重组体病毒结果见图28。为了确认这个基因的插入，对基因组RNA使用与FL基因5’末端相互补的引物1475(5′-GCCTAATGCAGTTGCTCTCC-3′)进行RT反应。随后，使用与S基因3’末端相对应的引物935(5′-GTTTTAGCACAGGGTGTGGCTCATG-3′)和与FL基因5’末端相对应的引物1474(5′-CCATCTTCCAGCGGATAG-3′)进行PCR。采用适当的转录载体作为阳性对照。在所有的实验中，获得的PCR片段有和阳性对照相同的大小，而对照水为阴性。观察到(和预期的)MHV-EFLM片段大小约1200bp，观察到(和预期的)MHVminFL片段大小约500bp(注：在图28中，每种类型病毒，分析和包括了2个独立获得的克隆)。
结论：遗传组件插入冠状病毒基因组在所有检测的位置都是耐受的，所有有意的病毒可存活。
I.3.b.以重组体病毒合成RNA
目的：确定被突变病毒感染的细胞内合成的RNA模式。
步骤：感染的17C11细胞在放射菌素D必须存在的条件下被[33P]正磷酸代谢性标记，如(4，10)所述。总细胞质RNA样品使用Ultraspec试剂盒(Biotecx)纯化，用甲醛和甲酰胺变性，通过含有甲醛的1％琼脂糖电泳分离，荧光自显影显示结果(图29-31；注：在这个图中的次基因组RNA种类以它们的组成命名，而不是从RNA2到RNA7，因为数字法命名对于突变体是不明确的。)
结果：对带有荧光素酶基因的所有MHV突变体，所有不同的sgRNA有与它们预期的大小相一致的迁移率(图29-31)。对含有海洋腔肠动物荧光素酶基因的病毒，没有观察到明显的额外的种类。在包含萤火虫荧光素酶基因的病毒中，观察到两个额外RNA种类，它们的大小与来源于与MHV IGS相似的萤火虫荧光素酶基因序列的sgRNA的转录相一致。总而言之，重组体病毒感染的细胞合成的病毒RNA模式精确的反映了冠状病毒基因组中荧光素酶表达盒的插入。
结论：结果确认重组冠状病毒的基因型，证明它们在RNA水平上预期的表型。
I.3.c.表达海洋腔肠动物或萤火虫荧光素酶的病毒的复制
目的：比较野生型病毒和其他病毒的生长特性
步骤和结果：经过2次噬斑纯化，制备病毒贮存液，滴定后，用高感染复数(8感染复数)感染LR7细胞，之后在培养基中监测病毒感染活性。结果通过生长曲线显示于图8A和8B，结果见图32。分析MHV-EFLM的2个病毒克隆，它们从I.3.a描述的重组实验中独立获得。图32中显示了感染后8-9小时的TCID50值。显然，图8A和8B显示的重组体病毒的生长特性不能从本质上区别。所有病毒都生长到滴度可与重组野生型病毒的滴度相比较。MHV-MSmNRL不知为何滴度较低(图32)。
结论：插入的表达盒几乎不能影响重组体病毒的体外生长特性。
I.3.d.在细胞培养物中海洋腔肠动物和萤火虫荧光素酶的表达
目的：确定是否插入的表达盒具有功能性。
步骤和结果：铺满的单层LR7细胞被8感染复数感染，随时检测细胞中生成的荧光素酶的活性。在细胞内RL的表达使用双-荧光素酶报告分析系统(Promega)依照厂家说明书检测。类似的，FL的表达使用荧光素酶报告分析系统(Promega)依照厂家说明书检测。使用发光计(LumacBiocounter公司M2500型或Turner Designs公司TD-20/20型)以相对荧光强度单位(RLU)检测RL和FL活性。
结果绘图显示在图9A，9B和33。除了重组野生型病毒之外的所有的重组体病毒都表达高水平的荧光素酶，表明海洋腔肠动物和萤火虫荧光素酶基因盒在每个检测基因组位置中都具有功能性。对于大多数病毒，在感染后9小时可达到最高表达水平。萤火虫荧光素酶在这个时间点的表达水平为1.6ug/106细胞。MHV-minFL表达的萤火虫荧光素酶活性的水平与其他包含FL基因的重组体病毒产生的比较，MHV-MSmNRL感染的细胞中海洋腔肠动物荧光素酶基因的表达比MHV-ERLM感染的细胞表达的水平大约低10倍。这个不同与MHV-MSmNRL和MHV-ERLM在复制上的不同相一致。
结论：外源基因可被冠状病毒表达，通过额外插入这样的基因，通过使用缺失非必需基因创造的遗传空间，或和一个重排的基因组结构联合。
I.3.e.外源基因在病毒传代过程中的维持
目的：评价插入的荧光素酶基因在病毒传代中的稳定性。
步骤和结果：重组体病毒MHV-ERLM和MHV-EFLM在低感染复数(＜0.05)的LR7细胞上被传代8次。每次传代后，在感染后第9小时检测培养基中的病毒感染活性(TCID50)。
随后，在感染后第8小时，用平行表达实验(感染复数＝5)检测萤火虫和海洋腔肠动物荧光素酶活性(见图10)。对MHV-ERLM和MHV-EFLM，分析2个独立获得的克隆A和B。海洋腔肠动物荧光素酶始终可稳定表达至少8代，而萤火虫荧光素酶只能稳定表达5代。MHV EFLM在第5代后，2个独立克隆的表达水平明显减少。8代后，10个MHV-ERLM和MHV-EFLM的病毒克隆通过噬斑检测被分离出来检测荧光素酶表达。MHV-ERLM的10个克隆是阳性的，9个MHV-EFLM克隆不再显示清晰的可检测到的荧光素酶表达。
结论：在体外，一个外源基因在冠状病毒基因组中可被稳定保持至少8代。
I.3.f.萤火虫荧光素酶在小鼠中的表达
目的：确定是否插入的荧光素酶基因可在天然宿主小鼠中表达。
步骤和结果：在实验中使用8周龄，MHV-阴性，雌性BALB/c小鼠。小鼠鼻腔内接种106TCID50 MHV-EFLM。每个病毒使用4只动物。感染后第4天，处死小鼠，取出肝脏和大脑。器官被快速冻存在液氮里，在荧光素酶分析系统(Promega)提供的细胞培养物裂解试剂中匀浆。依照厂商的说明书，使用发光计(Lumac Biocounter公司M2500型)检测FL活性。
显然，如图34所示，荧光素酶活性在肝脏和大脑中可以被检测出来。另外一个方法评价外源基因是否在体内也表达，即在动物体内，一只小鼠腹膜腔内接种106TCID50 MHV-EFLM。4天以后，小鼠被麻醉，皮下注射荧光素。5分钟后，使用与CCD相机连接的感光屏实时记录被麻醉小鼠身体散发的光线来评价荧光素酶的表达。从小鼠肝脏部位散发的光线可以被清晰的观察到。
结论：一个外源基因可被冠状病毒在它们的天然宿主中表达。
I.3.g.从一个基因组表达2个外源基因的MHV的产生
目的：确定是否一个基因组可以表达2个外源基因。
步骤和结果：将FL表达盒克隆进入已被EcoRV消化的pXH2aRLS生成pXH2aRLSEFLM。采用限制酶切和序列分析确定构建体，通过如上所述的在转录载体失控转录子和fMHV基因组之间的RNA-RNA重组生成重组体病毒。生成的病毒，MHV-RLFL，可采用RT-PCR分析进行遗传确认。海洋腔肠动物荧光素酶和萤火虫荧光素酶活性都可以在单个噬斑检测出来。制备高滴度贮存液后，铺满的单层培养的LR7细胞被8感染复数病毒感染，随时监测细胞内荧光素酶活性的生成。通过使用海洋腔肠动物分析系统(Promega)，依据厂商说明书，测量细胞内RL的表达。类似的，通过使用荧光素酶分析系统(Promega)，依据厂商说明书，测量感染后第8小时细胞内FL的表达。使用发光计(Lumac Biocounter M2500)以相对荧光强度单位(RLU)测量RL和FL活性。结果显示MHV-RLFL与MHV-2aRLS和MHVEFLM的复制程度一样(图46A)。MHV-RLFL表达海洋腔肠动物荧光素酶和萤火虫荧光素酶，MHV-2aRLS只表达海洋腔肠动物荧光素酶，MHV-EFLM只表达萤火虫荧光素酶(图46B)。
结论：2个外源基因可被单个冠状病毒基因组表达。
I.3.h.表达一个嵌合的刺突-GFP基因的MHV的生成
目的：确定是否表达和整合嵌合刺突-GFP蛋白的重组MHV可以产生。
步骤和结果：GFP基因被克隆在pMH54的S基因框内。采用限制酶切和序列分析确定构建体，通过如上所述的在转录载体失控转录子和fMHV基因组之间的RNA-RNA重组生成重组体病毒。生成的病毒，MHV-SGFP，可采用RT-PCR分析进行遗传确认。用显微镜分析噬斑，绿色荧光显示GFP表达。免疫沉淀反应分析显示杂合蛋白生成，它可用特异性抗MHV-S和GFP抗体沉淀。
结论：表达一个嵌合S-GFP基因代替一个野生型S基因的MHV可被生成。这个突变体病毒在细胞培养物中可存活并增殖表明这些杂合蛋白已整合入病毒颗粒。
I.4.刺突蛋白来源的肽抑制感染和细胞融合。
常规目标：通过用肽干扰膜融合来抑制冠状病毒感染和感染的传播。
具体目标：生产一个肽，它的组成有一个来源于MHV-A59 S蛋白膜近测的七氨基酸重复区域(HR2)的序列并证实它对MHV-A59进入LR7细胞和这些细胞在感染培养物时对细胞与细胞融合的抑制作用。
步骤：
a.质粒构建：用包含MHV-A59刺突基因的模板质粒pTUMS(13)，生成一个PCR片段，该片段与S蛋白1216-1254(HR2)的氨基酸残基相一致(图20)。使用的正向引物是5′-GCGGATCCATCGAAGGTCGTGATTTATCTCTCGATTTC-3′，这个引物把一个上游BamHI位点和一个紧紧位于BamHI位点下游的编码Xa因子裂解位点的序列引入扩增片段。反向引物(5′CGAATTCATTCCTTGAGGTTGATGTAG 3′)包含一个下游EcoRI位点和一个位于EcoRI位点前的终止密码子。PCR片段被克隆进入pGEX-2T细菌表达载体的BamHI-EcoRI位点。
b.细菌蛋白的表达和纯化：新鲜转化的BL21细胞(NOVAGEN)在2YT培养基中生长到对数期(OD600为1.0)，随后，加入终浓度0.4mMIPTG(GibcoBRL)诱导表达。诱导2小时后，细胞被沉淀和重悬在1/25培养体积的10mM Tris pH(8.0)，10mM EDTA，1mM PMSF中，在冰上超声裂解(2分钟5次，1分钟间隔)。细胞裂解产物4℃，20,000xg离心60分钟。然后，每50ml上清液加入2ml谷胱甘肽-琼脂糖4B(50％v/v，用PBS溶解)，上清液4℃孵育旋转过夜(O/N)。玻珠用50ml PBS洗3次，最后用1ml PBS重悬。使用20U凝血酶室温(RT)孵育4小时，肽从玻珠的GST moiety上裂解下来，上清液中的肽用0.1％三氟乙酸的线性梯度乙腈通过HPLC过苯柱纯化。肽包含的片段被真空干燥并被溶解在水中。通过测量A280nm的吸光率或采用BCA蛋白分析(Micro BCATM分析试剂盒，PIERCE)决定肽浓度。
c.病毒进入细胞或细胞与细胞融合的抑制测定：利用表达萤火虫荧光素酶的重组体t MHV-EFLM测定HR2肽抑制病毒感染的能力。37℃，96孔板，存在从0.4-50μM不同浓度的肽的DMEM培养基中铺满的单层的LR7细胞被5感染复数感染1小时。1小时后，用DMEM洗细胞，并用没有肽的DMEM培养基代替。感染后第5小时，依据厂商的方法(荧光素酶分析系统，Promega)，细胞被50ml裂解缓冲液室温裂解15分钟。混合10μl细胞裂解物和40μl底物，立即用Wallac Beta发光计立即测量荧光素酶活性。将抑制数据代入平衡结合方程式：％荧光素酶活性＝100/(1+(C/EC50)，计算50％有效抑制浓度(EC50值)。
利用噬斑分析测定肽HR2抑制刺突介导的细胞与细胞融合的能力。在37℃，DMEM培养基中培养，6孔板中的单层LR7细胞被50PFU的MHV-A59接种。1小时后，用DMEM洗细胞，加入分别含有50，10，2，0.4和0.08μM浓度的HR2肽的琼脂覆层。在48小时，用0.9％甲醛/0.75％结晶紫固定并着色，计算噬斑。
结果：使用一个表达荧光素酶报道基因的病毒检测HR2肽抑制病毒进入的能力，这允许极端敏感的感染检测。当不同浓度的HR2肽存在的条件下，用病毒接种细胞。接种1小时后，洗细胞并用不含肽的培养基进一步培养。4小时后，在通常合胞体形成发生前，裂解细胞并检测荧光素酶活性(图11)。这个张图中，标准化的荧光素酶活性，代表成功感染，对在接种过程中存在的肽的浓度作图。HR2肽阻止病毒进入非常有效，事实上，当肽浓度达50μM时，感染被完全抑制。抑制50％病毒感染的有效浓度(ECso)是0.15μM。采用噬斑分析检测HR2肽抑制刺突蛋白介导的细胞与细胞融合的能力。在肽不存在的条件下，接种细胞(平行培养)后，细胞被一层包含不同浓度HR2肽的覆层覆盖。当肽浓度达到0.4μM时，噬斑形成完全消失(图12)。当肽浓度在0.08μM时，只能观察到很微小的噬斑。
在所有这些分析中，通过平行检验其它用，同样的方法制备的肽并使用同样的浓度(图20)的效果，包括例如，对应于MHV-A59 S蛋白(图11中的对照肽)的1003-1048氨基酸的肽，证实了抑制作用的特异性。只有HR2肽是有效的。
结论；HR2肽是一个抑制病毒进入细胞和MHV-A59刺突介导的细胞与细胞融合的有力抑制物。
II.猫感染腹膜炎病毒(FIPV)，79-1146株
II.1.在鼠细胞中生长的猫冠状病毒mFIPV的生成
常规目标：建立一个与上述介绍的鼠冠状病毒MHV-A59遗传操纵相似的猫冠状病毒FIPV79-1146的定向RNA重组系统。
具体目标：产生mFIPV，一个刺突蛋白外部结构域被MHV-A59 S基因取代的FIPV的衍生物，因此嵌合病毒的嗜性转变到鼠细胞而不是猫细胞。
II.1.a.一个合成的RNA转录载体的构建
目的：准备一个质粒构建体，合成的供体RNA可以被转录到定向RNA重组，它包含有融合到病毒基因组3’部分来源的序列的FIPV基因5’末端来源的序列，i.c.ORF1B 3’末端下游(包括)的所有序列。同时：准备这个质粒的衍生物，其中编码刺突外部结构域的序列被编码MHV-A59刺突蛋白相应区域的序列所代替。
步骤和结果：
使用标准DNA克隆技术构建载体pBRDI1，它包含一个FIPV79-1146基因组的连接到3’-最大9262碱基的5’-最大702碱基的一个cDNA拷贝(图13A)。连接是这样做的，ORF1A(pol1A)基因片段融合进入ORF1B基因片段(pol1B)的3’末端到5’末端的框架(图14B)。此外，在这一点，一个单一的SacI限制性位点被引入(图14B)。猫冠状病毒序列置于随后是一个三联体G的噬菌体T7聚合酶启动子序列的控制下(图14A)，在体外使用T7聚合酶进行有效RNA转录。在3’末端，序列以15个A的polyA尾巴终止，随后是一个单一的Notl限制性位点(图14C)以促进失控转录。T7启动子序列前面是一个单一的XhoI限制性位点(图14A)，所以猫冠状病毒cDNA可以被克隆作为一个10.015bp片段的Xhol-Notl限制性片段进入pBRXN载体(11)生成pBRDI1(图13A)。
随后，使用质粒pBRDI1制备pBRDI2，其中FIPV S基因被一个组成为编码MHV刺突蛋白的外部结构域的一部分和编码FIPV刺突蛋白的跨膜和外部结构域的一部分的嵌合体刺突基因(mS)取代。为了将这个杂合基因导入pBRDI1，首先，猫pol1B基因3’末端融合入鼠刺突基因的5’末端(序列的连接见图14D)。这个融合产物被克隆进入pTMFS(12)作为一个Sacl-StuI片段，生成pTMFS1(图13B)。杂合基因作为一个Sacs-ALL片从pTMFS1分离出来，用来代替pBRDI1的FIPV刺突基因，生成pBRDI2(图13B)。PBRDI1和pBRDI2的序列分别显示在附录1和2中。
II.1.b.RNA重组生成mFIPV。
目的：生成mFIPV，它是一个以鼠细胞为靶细胞的FIPV衍生物。
步骤和结果：使用一个T7 RNA聚合酶试剂盒(Ambion)，依据厂商说明书，用Notl-线性化的pBRDI2合成加帽的，失控供体RNA转录产物。转录产物通过电穿孔法(基因脉冲电穿孔仪，Biorad，2个连续脉冲；0.3kV/960microF)被导入已先被FIPV79-1146感染(1感染复数)的猫FCWF细胞(80cm2培养瓶)。电穿孔细胞在25cm2培养瓶中与鼠LR7细胞共同培养(50％铺满)，以产生合成和基因组RNA的重组(图15)。37℃孵育24小时后，在鼠LR7细胞和猫FCWF细胞中都可以观察到大片合胞体。通过去除培养上清液和在LR7细胞上的3个连续终点稀释的病毒传代可选出侯选的mFIPV重组体。生成的病毒不能感染并导致FCWF细胞病变。
结论：获得了一个对鼠细胞嗜性趋向的病毒。
II.1.c.mFIPV蛋白分析
目的：在病毒蛋白合成水平上确认mFIPV的特性。
步骤和结果：鼠LR7细胞被mFIPV感染，从感染后5小时开始，蛋白用35S标记的氨基酸标记2小时。至于对照，我们分别用MHV和FIPV感染LR7细胞和FCWF细胞，感染5-7小时后，类似的标记他们。标记后，如(12)所述，制备细胞裂解物并在去垢剂存在下完成免疫沉淀。使用如下的抗体(参考文献，见12)：G73(aFIPV)，从FIPV感染的猫身上获得的腹水液体(由H.Vennema提供)；K134(aMHV)，一个抗纯化的MHV-A59的兔血清；WA3.10(aSm)，一个抗存在于MHV-A59 S外部结构域上的表位的Mab；23F4.5(aSf)，一个抗FIPV S外部结构域上的表位的Mab。将免疫沉淀蛋白加入电泳样品缓冲液，95℃加热2分钟，除了一个蛋白样品(图16第4泳道)放在室温防止MHV M蛋白聚集。用12.5％SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白。电泳带型见图16。正如预料，抗-FIPV抗体可沉淀来自FIPV感染的细胞裂解物的S，M和N蛋白(10泳道)，但是没有来自于MHV感染的细胞裂解产物的MHV蛋白发生沉淀(泳道1)。正如预料，23F4.5Mab可沉淀猫的FIPV的S蛋白(泳道11)而不能沉淀鼠的MHV的S蛋白(泳道2)。并且，抗MHV血清可沉淀MHV S，M和N蛋白(泳道3，4)但不能沉淀FIPV蛋白(泳道12)，WA3.10Mab可沉淀MHV S蛋白(泳道5)但不能沉淀FIPV S蛋白(泳道13)。当观察沉淀自mFIPV感染的细胞裂解液的蛋白，可清晰看到抗FIPV血清G73可沉淀M和N蛋白，不能沉淀S蛋白(泳道6)。S蛋白也不能被23F4.5Mab沉淀(泳道7)。但是，mFIPV S蛋白被抗MHV血清(泳道8)和MabWA3.10沉淀(泳道9)。
结论：被mFIPV感染的细胞表达预知的病毒蛋白，特别是具有MHV来源的外部结构域的杂合S蛋白。
II.1.d.mFIPV生长特性
目的：比较FIPV和MHV-A59获得的mFIPV的滴定量。
步骤和结果：感染和滴定实验显示重组病毒mFIPV不在能够感染猫FCWF细胞，但是可以在鼠LR7细胞中有效的生长，显示和MHV-A59相似的生长特性。例如，可以通过比较这些细胞的一步生长曲线证明(图17)。在这个实验中，细胞被mFIPV和MHV-A59感染(每个用感染复数5)，样品在不同的时间点从培养液中取出，在LR7细胞上采用终点稀释法滴定。并且，mFIPV在这些细胞感染中诱导了大量的合胞体和细胞病变。在LR7细胞内生长的重组体mFIPV的贮存量达到和FIPV重组体在FCWF细胞内相同数量级的滴定量(5.107PFU/ml)。但是，这个数量级低于MHV-A59在LR7细胞内产生的。
结论：刺突蛋白外部结构域的置换导致一个在新宿主细胞中复制良好但却没有明显丢失大部分生物适应性的重组mFIPV。
II.2.通过基因缺失生成活的减毒的FIPV疫苗
总体目的：从FIPV基因组缺失对于病毒体外复制非必需的基因序列获得缺失病毒，其在猫科动物体内是减毒的，因此是侯选病毒(载体)疫苗。
II.2.a.合成RNA转录载体的构建
目的：构建用于合成供体RNA转录产物的质粒，该转录产物缺少用于和mFIPV RNA定向重组的3ABC和/或7AB基因。(图18，顶部)
步骤和结果：采用SOE-PCR方法，3ABC和7AB基因缺失被引入质粒pBRDI1。使用的引物见表2和图18，左边。
缺失3ABC簇，引物1和4及2和3联合使用，分别生成375bp(A)和1012bp(B)的片段(图18，左边)。通过引物3和4，片段A和B使用两片段的重叠部分发生融合，使用引物1和2扩增，生成一个1366bp的片段(C)。片段C被AfIII和SnaBI消化后，被克隆进入已被Af1II和SnaBI-消化的pBRDI1，生成pBRDI1Δ3ABC(图18)。
缺失7AB基因，引物5和8及引物6和7联合使用，分别生成1215的bp片段(D)和324bp的片段(E)(图18)。通过引物7和8，片段D和E使用两片段的重叠部分发生融合，使用引物5和6扩增，生成一个1524bp的片段(F)。片段F被MM和NotI消化后，被克隆进入已被MluI和Notl消化的pBRDII，生成pBRDI1Δ7AB(图18)。片段C和F序列的正确性通过DNA测序确认。
为了构建pBRDIIΔ3ABC+Δ7AB，pBRDI1Δ7AB的1524bp的llfluI/NotI片段被导入MlullNotl-消化的pBRDI1Δ3ABC(图18)。
结论：获得了pBRDI1来源的缺少3ABC和/或7AB基因簇的供体RNA构建体。
11.2.b.生成缺少基因的重组体FIPV
目的：生成FIPV重组体，缺少3ABC基因，TAB基因，和这两种基因群的序列。
步骤和结果：使用厂商说明的T7 RNA聚合酶试剂盒(Ambion)，分别从Notl-线性化的pBRDI1，pBRDI1Δ3ABC，pBRDI1Δ7AB和pBRDI1Δ3ABC+Δ7AB合成加帽的失控供体转录产物。通过电穿孔(基因脉冲电穿孔仪，Biorad，2个连续脉冲；0.85kV/50microF)将供体转录产物导入已被mFIPV(感染复数0.4)感染的鼠LR7细胞(80cm2培养瓶)。电穿孔的细胞在25cm2培养瓶中与猫FCWF细胞(50％铺满培养)共同培养。37℃孵育24小时后，在鼠LR7细胞和猫FCWF细胞中都可以检测到大量合胞体。释放进入混合细胞培养上清中的侯选缺失病毒通过在FCWF细胞上的2次噬斑纯化过程被纯化。
结论：通过mFIPV重组实验，获得了在猫FCWF细胞中获得生长能力的病毒。
II.2.c.遗传学分析缺少的基因的重组FIPV
目的：确定推定缺失病毒的遗传构成。
步骤和结果：评价是否有意的缺失的确出现在不同的FIPV缺失突变体，对病毒基因组RNA进行RT-PCR，反应集中在3ABC和7AB区域。表2和图18(右边)显示使用的引物和DNA预期的大小。图19显示RTPCR分析的结果。图19A通过扩增片段的大小揭示重组野生病毒(r-wtFIPV)和FIPVΔ7AB都携带3ABC区域，而在病毒FIPVΔ3ABC和FIPVΔ3ABC+Δ7AB中缺少这个区域。图19B证实r-wtFIPV和FIPVΔ3ABC仍然携带7AB区域，而病毒FIPVΔ7AB和FIPVΔ3ABC+Δ7AB缺少这个区域。分别表示3ABC和7AB缺失的397bp和646bp的片段被克隆和测序来证实预期的DNA序列。
结论：缺失病毒具有恰好有意的基因组缺失。
11.2.d.缺少基因的FIPV的生长特性
目的：检查缺失病毒的细胞嗜性和评价它们的体外生长。
结果：所有4个重组病毒接种鼠LR7细胞，但是没有引起任何细胞病变。但是，它们确实可以如预料的在猫FCWF细胞中有效地生长。病毒r-wtFIPV，FIPVΔ3ABC和FIPVA7AB达到的滴度与亲代FIPV株79-1146在这些细胞上获得的滴度相似。所有滴度都达到5.107PFU/ml级别(图40)。但是，双突变FIPVA3ABC+A7AB生长效率较低；这个病毒获得的滴度通常要低1-2对数单位(图40)。
结论：含有基因簇3ABC和7AB的序列对于FIPV的生存是非必需的。显然，核苷酸序列和由基因编码的蛋白对于病毒的复制都是非必需的。
11.2.e.重组病毒在猫体内的毒性
目的：确定是否遗传缺失影响毒性。
步骤和结果：重组缺失病毒在它们天然宿主猫体内具有特异性。为了这个目的，24只SPF猫(5月龄)分成5组，分别口鼻内接种(100pfu)FIPV79-1146株(n＝4)，r-wtFIPV(n＝5)，FIPVΔ3ABC(n＝5)，FIPVΔ7AB(n＝5)和FIPVΔ3ABC+Δ7AB(n＝5)，随后(至少)3个月。疾病临床症状评分显示在表格5中。使用缺失病毒接种的猫没有出现疾病临床症状。而且，在整个实验中，所有的猫都保持完全的健康(表6和图35)。相反，被野生型对照FIPV79-1146和r-wtFIPV感染的猫出现了快速的临床疾病症状，包括：消沉，厌食，黄疸，体重减轻和白血病(表6)。3/4和5/5分别接种FIPV79-1146和r-wtFIPV的猫在接种后14天到42天由于进一步的FIP症状被安乐死(图35)。
结论：1)FIPV79-1146和它的野生型重组病毒相等物r-wtFIPV具有相同的毒性；2)基因3abc或7ab序列或一些或所有这些基因联合缺失的病毒，在猫身上显示一个显著减毒的表型。
II.2.f.重组病毒诱导的免疫反应
目的：确定猫血清中的FIPV-中和活性。
步骤和结果：猫接种缺失病毒后的FIPV特异性的抗体反应。为了这个目的，在感染后0，21和90天取得血样品，制备热灭活血清并与FIPV79-1146(10.000PFU)孵育，然后使用FCWF细胞在96孔板测定FIPV中和活性。滴度表示为不再抑制病毒细胞病变作用的最低稀释度的倒数。正如预期，0天，没有猫血清显示显著的FIPV中和活性。21天，所有猫的血清转阳并显示高效价的中和抗体。在猫接种FIPV791146，r-wtFIPV，FIPVΔ3ABC和FIPVΔ7AB后观察到的滴度是可比较的，然而在FIPVΔ3ABC+Δ7AB感染的猫中观察到的滴度大约低50倍(图36)。总之，滴度保持高效价至少90天(到实验结束)。
结论：尽管不存在疾病的临床症状，猫接种FIPV缺失变体后可观察到中和抗体的高效价。这个强烈暗示缺失病毒可在猫体内存活和复制，导致一个以抗体形式发生的强烈免疫反应。
II.2.g.FIPV缺失病毒用作减毒的活疫苗
目的：研究是否预先接种减毒的缺失变种可保护猫不受FIPV79-1146攻击。
步骤和结果：猫被预先接种减毒的缺失变种，在90天时被FIPV79-1146(100pfu)口鼻攻击(感染试验(challenge))。4个同年龄未处理的猫作为对照组，它们被同样地攻击。对照组出现快速的临床疾病，特征为消沉，厌食，黄疸，体重减轻和白血病(7天)。预先接种FIPVΔ3ABC+Δ7AB的猫，有3/5可观察到同样的快速发作症状，然而预先接种FIPVΔ3ABC或FIPVΔ7AB的所有猫在整个实验中，保持完全健康，没有典型FIP症状(表7)，虽然预先接种FIPVΔ3ABC的猫有2/5出现暂时体重减轻。
由于进一步的FIP症状，在32天，对照组的一只猫被处以安乐死，然而对照组的其它猫从它们最初的FIP症状中恢复过来。25％致命性得分低于以前的实验。推测，众所周知，这是由于猫的老龄可减少对FIPV易感。3只接种FIPVΔ3ABC+Δ7AB疫苗发生初始症状的猫保持病态，在11天和56天之间被处以安乐死(图37)。显然，通过体外生长降低判断两个基因簇3ABC和7AB的联合缺失减少了FIPVA3ABC+A7AB的适合度也影响了病毒在猫体内的复制速度，这通过较低水平中和抗体的产生证明。因此，病毒被过分减毒，只能部分地保护并对抗FIPV攻击。完全保护要求一个更高或重复地剂量。
结论：FIPVΔ3ABC或FIPVΔ7AB提前疫苗接种保护猫对抗FIPV攻击导致的疾病。
II.3.外源基因的插入和表达
目的：确定是否外源基因可在病毒基因组不同位置插入，是一个额外基因或取代缺失非必需基因；并确定是否这些基因表达和是否在病毒体外传代过程中它们可稳定保持。
II.3.a.携带报道基因的重组病毒的构建
目的：生成具有外源基因插入的FIPV79-1146病毒。
步骤：构建一个在基因组3abc基因的位置上包含一个外源报道基因的病毒。报道基因，海洋腔肠动物荧光素酶(RL)被放置在前面的基因3a的IGS转录控制之下。缺失3abc簇和介导RL基因进入质粒pBRDI1，联合使用引物1244(5′-GCCATTCTCATTGATAAC-3′)和1514(5CTGAGTCTAGAGTAGCTAGCTAATGACTAATAAGTTTAG-3′)及，引物1245(5′GCTTCTGTTGAGTAATCACC-3′)和引物1513(5′GCTAGCTACTCTAGACTCAGGCGGTTCTAAAC-3′)，通过PCR可分别生成336bp(A)和1068bp(B)的片段。在引物1513和引物1514中，下划线和粗体序列分别代表NheI和Xbal限制位点。通过引物1513和1514，片段A和B在两个片段的重叠部分发生融合，使用引物1244和1245采用SOE-PCR方法扩增，生成一个1384bp片段(C)。克隆片段C进入pGEM-T Easy载体(Promega)，生成pGEM-C。来源于pRL-null(Promega)的RL基因作为NhellXbal片段导入已被NheI和Xbal消化的pGEM-C，生成pGEM-C+luc。片段C+luc作为aAf1II/SnaBI片段导入已被Af1II和SnaBI消化的pBRDI1，生成pBRDIIΔ3ABC+Iuc。
通过限制和序列分析确认所有的构建后，重组病毒通过上述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组产生。所得病毒通过RT-PCR分析进行遗传确认。
结论：外源报道基因海洋腔肠动物荧光素酶可被放置在I群冠状病毒FIPV基因组中。有意重组病毒可存活。
1I.3.b.病毒的一步生长
目的：比较病毒和野生型病毒的生长特性。
步骤和结果：经过2次噬斑纯化，通过II.3.a，制备2个独立获得重组的病毒贮存液，滴定并用于高感染复数(8感染复数)感染FCWF细胞，然后，在培养基里检测病毒的传染性。结果以生长曲线的形式示于38。与野生型重组病毒生长比较，2个独立获得的重组体低1至2个对数滴度。
结论：插入表达盒的重组病毒通常在体外生长，但是它们的产量受到影响。
II.3.c.海洋腔肠动物荧光素酶的表达
目的：确定是否插入的表达盒是有功能的。
步骤和结果：铺满的单层培养的FCWF细胞被8感染复数感染，随时检测细胞里生成的荧光素酶活性。使用双重-荧光素酶报告分析系统(Promega)，依据厂商说明书，测量细胞内RL的表达。使用发光计(LumacBiocounter M2500或Turner Designs TD-20/20型)，以相关光单位(RLU)测量RL。
结果图示于图39。与重组野生型病毒相反，包含病毒的2个重组荧光素酶基因表达高水平的荧光素酶活性，显示海洋腔肠动物荧光素酶基因是功能性的。表达早在感染后2小时开始。在感染后9小时达到最高表达水平。
结论：利用缺失非必需基因创造的基因空间，外源基因可被冠状病毒表达。
II.4多价以FIPV为基础的疫苗的生成
目的：以活的减毒的FIPV株为载体发展多价疫苗。
方法：挑选来源于其他猫和犬病原体的基因(或基因片段)，它们编码已知可诱导对抗这些病原体的保护性免疫的抗原。这些基因的表达盒被导入FIPV基因组与非必需基因的减毒缺失联合。表达盒包含被表达基因(部分)前面的FIPV TRS。
11.4.a.以FIPV载体为基础，构建多价猫白血病病毒(FeLV)疫苗
目的：以一个活的减毒FIPV株为载体，发展FeLV疫苗。
步骤：保护相关的FeLV gag和env基因(部分)被放置在表达盒中随后分别导入pBRDIIΔ3ABC和pBRDI1Δ7AB。通过限制和序列分析确认所有的构建后，通过如上所述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成重组病毒。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。
FeLV gag和env基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关FeLV gag和env基因(部分)可被导入一个活的减毒FIPV株并在其中表达。因此，这些重组体具有抗抗猫白血病病毒和FIPV感染的多价疫苗的功能。
II.4.b.以FIPV载体为基础，构建多价猫免疫缺陷病毒(FIV)疫苗
目的：以一个活的减毒FIPV株为载体，发展FIV疫苗。
步骤：保护相关的FIV gag和en基因(部分)被放置在表达盒里，随后分别导入pBRDI1Δ3ABC和pBRDI1Δ7AB。通过限制和序列分析证实所有构建后，重组病毒通过如上所述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。
FIV gag和env基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：通过一个活的减毒FIPV株，保护相关FIV gag和env基因(部分)被导入和表达。因此，这些重组病毒具有抗猫免疫缺陷病毒和FIPV感染的多价疫苗的功能。
II.4.c.以FIPV载体为基础，构建多价猫杯状病毒(FCV)疫苗
目的：以一个活的减毒FIPV株为载体，发展FCV疫苗。
步骤：保护相关FCIV衣壳基因(部分)被放置在表达盒里，随后分别导入BRDI1Δ3ABC和pBRDI1Δ7AB。通过限制和序列分析证实所有构建后，重组病毒通过如上所述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。
FCV衣壳基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：通过一个活的减毒FIPV株，保护相关FCV衣壳基因(部分)被导入和表达。因此，这些重组病毒具有抗猫杯状病毒和FIPV感染的多价疫苗的功能。
II.4.d.以FIPV载体为基础，构建多价猫肠炎病毒(FPV)疫苗
目的：以一个活的减毒FIPV株为载体，发展FPV疫苗。
步骤：保护相关的编码VP1和VP2衣壳蛋白的R3基因(部分)被放置在表达盒里，随后分别导入pBRDIIΔ3ABC和pBRDI1Δ7AB。通过限制和序列分析证实所有构建后，重组病毒通过如上所述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。R3基因(部分)表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：通过一个活的减毒FIPV株，保护相关的R3基因(部分)导入和表达。因此，这些重组病毒具有抗猫肠炎病毒和FIPV感染的多价疫苗的功能。
11.4.e.以FIPV载体为基础，构建多价猫疱疹病毒(FHV)疫苗
目的：以一个活的减毒FIPV株为载体，发展FHV疫苗。
步骤：保护相关gB，gC，gD，gE，gH，gI，gK，gL，gM，gM，ICPO，ICP1和ICP4猫疱疹病毒基因(部分)被放置在表达盒里，随后分别导入pBRDI1Δ3ABC和pBRDI1Δ7AB。通过限制和序列分析证实所有构建后，重组病毒通过如上所述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成。
生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。插入的FHP基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：通过一个活的减毒FIPV株，保护相关gB，gC，gD，gE，gH，gI，gK，gL，gM，ICPO，ICP1和ICP4猫疱疹病毒基因(部分)被导入和表达。因此，这些重组病毒具有抗猫疱疹病毒和FIPV感染的多价疫苗的功能。
II.4.f.以FIPV血清II群载体为基础，构建多价FIPV血清I和II群疫苗
目的：以一个活的减毒FIPV血清II群株为载体，发展既抗猫冠状病毒血清I又抗II群的疫苗。
步骤：保护相关的编码信号序列的区域被缺失血清I群猫冠状病毒的刺突基因(部分)，其被放置在表达组件里，随后分别导入pBRDI1Δ3ABC和pBRDIIΔ7AB。例如：在一个实验中，使用编码信号序列区域被缺失的刺突基因构建体；在另一个实验中，使用一个截短的刺突基因，其编码跨膜结构域+内部结构域的区域被缺失；通过限制和序列分析证实所有构建后，重组病毒通过如上所述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。插入的血清I群刺突基因构建体的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的猫冠状病毒血清I群的刺突基因(部分)在一个活的减毒FIPV血清II群株内被导入和表达，因此具有既抗猫血清I又抗II群冠状病毒的多价疫苗的功能。
II.5.基因顺序重排的重组病毒的生成
目的：通过移动FIPV基因组内S基因上游的N基因基因顺序重排联合缺失非必需基因来发展FIPV疫苗。
步骤和结果：加帽，失控供体转录产物通过Notl-线性化的pBRDI1Δ3ABC，pBRDI1Δ7AB和pBRDI1Δ3ABC+A7AB载体合成，载体内N基因与它的TRS插入S基因上游的一个位置。供体转录产物采用电穿孔法(基因脉冲电传孔仪，Biorad，2个连续脉冲；0.85kV/50microF)引入已被mFIPV(感染复数0.4)感染的鼠LR7细胞(80cm2培养瓶)。电穿孔的细胞与猫FCWF细胞(50％铺满)在25cm2培养瓶中共同培养。37℃孵育24小时，在细胞培养基中可检测到大量合胞体。重组基因组的缺失突变病毒释放进混合细胞培养基，通过2次在FCWF细胞上的噬斑纯化纯化上清液。
结论：基因顺序重排的缺失突变体FIPV可以被生成。这些病毒可被用作活的减毒FIPV疫苗。由于它们重排的基因顺序，这些病毒可作为更安全的疫苗，因为它们减少了和在领域中循环的病毒重组生成可存活子代的能力。
II.6抗犬病原体疫苗FIPV的生成
总体目的：以一个活的减毒FIPV血清II株为载体，发展抗犬病原体的疫苗。
方法：因为II群猫冠状病毒表达犬冠状病毒样刺突蛋白(2a)，这个猫冠状病毒载体可作为犬疫苗使用。
因此，我们制造的活的减毒FIPV疫苗也可用作犬抗犬冠状病毒(CCV)。而且，生成多价疫苗的方法是，导入其他犬病原体保护相关基因的表达盒进入FIPV基因组和非必需基因减毒缺失及基因组重排联合作用。表达盒包含位于被表达基因(部分)前面的FIPV TRS。
II.6.a.抗犬瘟病的FIPV疫苗的生成
目的：以一个活的减毒FIPV株为载体，发展犬瘟病疫苗。
步骤：保护相关的H和F(部分)基因被放置在一个表达盒里，随后被分别导入pBRDI1Δ3ABC和pBRDIIΔ7AB。通过限制和序列分析证实所有构建后，重组病毒通过如上所述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。H和F基因(部分)表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的犬瘟热病毒H和F基因(部分)，通过一个活的减毒FIPV株，基因可被导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗犬瘟热病毒和CCV感染的疫苗。
II.6.b.抗犬细小病的FIPV疫苗的生成
目的：以一个活的减毒FIPV株为载体，发展犬细小病毒疫苗。
步骤：保护相关的编码VP1和VP2衣壳蛋白的R3基因(部分)被放置在表达盒里，随后被分别导入pBRDHΔSABC和pBRDI1Δ7AB。通过限制和序列分析证实所有构建后，重组病毒通过如上所述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。R3基因(部分)表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的犬细小病R3基因(部分)，通过一个活的减毒FIPV株，可被导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗犬细小病毒病和CCV感染的疫苗。
II.6.c.抗犬传染性肝炎的FIPV疫苗的生成
目的：以一个活的减毒FIPV株为载体，发展犬腺病毒1的疫苗。
步骤：保护相关的犬腺病毒1的结构蛋白基因(部分)被放置在一个表达盒里，随后，分别被导入pBRDI1Δ3ABC和pBRDI1Δ7AB。通过限制和序列分析证实所有构建后，重组病毒通过如上所述的转录载体失控转录产物和FIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。犬腺病毒1相关结构蛋白基因(部分)的表达通过免疫反应分析证实。
结论：保护相关的犬腺病毒1的相关结构蛋白基因(部分)，通过一个活的减毒FIPV株，可被导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗传染性肝炎病毒和CCV感染的疫苗。
II.6.d.抗小狗出血病的FIPV疫苗的生成
目的：以一个活的减毒FIPV株为载体，发展小狗出血病1疫苗。
步骤：保护相关的gB，gC，gD，gE，gH，gI，gK，gL，gM，gM，ICPO，ICP1和ICP4犬疱疹病毒基因(部分)被放置在一个表达盒里，随后，分别被导入pBRDI13ΔBC和pBRDI1Δ7AB。通过限制和序列分析证实所有构建后，重组病毒通过如上所述的转录载体失控转录产物和mFIPV基因组之间的RNA-RNA重组生成。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。插入基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的gB，gC，gD，gE，gH，gI，gK，gL，gM，ICPO，ICP1和ICP4犬疱疹病毒基因(部分)可在一个活的减毒FIPV株内导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗犬疱疹病毒1和CCV的多价疫苗。
III.传染性肠胃炎病毒(TGEV)
III.1.生成一个抗TGEV的活的减毒疫苗
目的：一个抗TGEV的活的减毒疫苗的发展
方法：为了这个目的，生成缺少非必需基因3ab和/或7的重组TGEV缺失突变病毒。
步骤：按Almazan等(2000)描述，生成重组病毒。从pBAC-TGEVFL，一个感染的TGEV cDNA克隆被放在一个pBeloBACll内CMV启动子的后面，通过标准克隆技术，缺失3ab和7基因，保持周围开放读框和转录调节序列完整。用缺少3ab和7基因(pBAC-TGEVFL)的pBAC-TGEFL的衍生物转染猪睾丸上皮细胞(ST)。重组TGEV病毒被噬斑纯化，用RT-PCR鉴定3ab和/或7基因的缺失。大量的重组TGEV缺失病毒由感染的ST细胞生成。
结论：缺失3ab和7基因的重组TGEV生成。这些病毒可以作为一个抗TGEV的活的减毒疫苗。
III.2生成多价TGEV为基础的疫苗。
目的：以一个活的减毒的TGEV作为载体，发展多价疫苗。
方法：猪病原体的保护相关基因表达盒被导入TGEV基因组与非必需基因的减毒缺失和基因组重排联合作用。表达盒包含位于被表达基因(部分)前面的TGEV TRS。
III.2.a.以一个TGEV载体为基础，构建一个多价猪细小病毒(PPV)疫苗
目的：以一个活的减毒的TGEV株为载体，发展疫苗。
步骤：保护相关的编码VP1和VP2衣壳蛋白的R3基(部分)因被放置在一个表达盒里，随后被导入缺少基因3ab和7的pBAC-TGEVFL衍生物中。通过限制和序列分析证实所有构建后，使用包含保护相关的R3基因(部分)的pBAC-TGEVFL缺失衍生物转染ST细胞生成重组病毒。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。插入的R3基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的R3基因(部分)，通过一个活的减毒的TGEV株，可被导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗猪细小病毒病和TGEV感染的多价疫苗。
III.2.b.以TGEV载体为基础，构建一个多价猪流感病毒疫苗。
目的：以一个活的减毒的TGEV株为载体，发展一个猪流感病毒疫苗。
步骤：保护相关的血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因(部分)被放置在一个表达盒里，随后，被导入缺少基因3ab和7的pBAC-TGEVFL衍生物。通过限制和序列分析证实所有构建后，使用包含保护相关的血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因(部分)的pBAC-TGEVFL缺失衍生物转染ST细胞生成重组病毒。
生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。插入的血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：通过一个活的减毒TGEV株，保护相关的血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因(部分)，可被导入和表达。
因此，这些重组病毒可作为抗猪流感病毒和TGEV感染的多价疫苗。
III.2.c.以一个TGEV载体为基础，构建一个多价的非洲猪热病病毒疫苗
目的：以一个活的减毒TGEV株为载体，发展非洲猪热病病毒疫苗。
步骤：保护相关的结构蛋白编码基因(部分)被放置在一个表达盒里，随后，被导入缺少基因3ab和7的pBAC-TGEVFL衍生物。通过限制和序列分析证实所有构建后，使用包含保护相关的结构蛋白编码基因(部分)的pBAC-TGEVFL缺失衍生物转染ST细胞生成重组病毒。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。结构蛋白编码基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：通过一个活的减毒TGEV株，保护相关的结构蛋白编码基因(部分)可被导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗非洲猪热病病毒和TGEV感染的多价疫苗。
III.2.d.以一个TGEV载体为基础，构建一个多价猪圆病毒2型疫苗
目的：以一个活的减毒TGEV株为载体，发展一个猪圆病毒2型疫苗。
步骤：保护相关的猪圆病毒2型C1，C2，VI和V2基因(部分)被放置在一个表达盒里，随后，被导入缺少3ab和7基因的pBAC-TGEVFL衍生物。通过限制和序列分析证实所有构建后，使用包含保护相关的猪圆病毒2型C1，C2，VI和V2基因(部分)的pBAC-TGEVFL缺失衍生物转染ST细胞生成重组病毒。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。猪圆病毒2型的C1，C2，VI和V2基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：通过一个活的减毒TGEV株，保护相关的猪2型圆病毒C1，C2，VI和V2基因(部分)可被导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗猪圆病毒2型和TGEV感染的多价疫苗。
III.2.e.以一个TGEV载体为基础，构建一个多价猪生殖呼吸综合症病毒疫苗
目的：以一个活的减毒TGEV株为载体，发展一个猪生殖呼吸综合症病毒疫苗。
步骤：猪生殖呼吸综合症病毒的保护相关的ORF2至ORF7(部分)被放置在一个表达盒里，随后，被导入缺少3ab和7基因的pBAC-TGEVFL衍生物。通过限制和序列分析证实所有构建后，使用包含猪生殖呼吸综合症病毒的保护相关的ORF2至ORF7(部分)的pBAC-TGEVFL缺失衍生物感染ST细胞生成重组病毒。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。猪生殖呼吸综合症病毒的ORF2至ORF7的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：通过一个活减毒TGEV株，猪生殖呼吸综合症病毒的保护相关的ORF2至ORF7(部分)可被导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗猪生殖呼吸综合症病毒和TGEV感染的多价疫苗。
III.2.e.以一个TGEV载体为基础，构建一个多价口蹄疫病毒疫苗
目的：以一个活的减毒TGEV株为载体，发展一个口蹄疫病毒疫苗。
步骤：编码口蹄疫病毒VP1至VP4的保护相关的序列(部分)被放置在一个表达盒里，随后，被导入缺少3ab和7基因的pBAC-TGEVFL衍生物。通过限制和序列分析证实所有构建后，使用包含编码口蹄疫病毒VP1至VP4的保护相关的序列(部分)基因的pBAC-TGEVFL缺失衍生物感染ST细胞生成重组病毒。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。编码口蹄疫病毒的VP1至VP4的序列的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：通过一个活减毒TGEV株，编码口蹄疫病毒的VP1至VP4的保护相关的序列(部分)可被导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗口蹄疫病毒和TGEV感染的多价疫苗。
III.3.生成基因顺序重排的重组病毒
目的：通过移动TGEV基因组内S基因上游的N基因基因顺序重排和非必需基因缺失联合，发展TGEV疫苗。
步骤和结果：按Almazan等(2000)描述生成重组病毒。从pBAC-TGEVFL，一个感染的TGEV cDNA克隆被放在一个pBeloBACll内CMV启动子的后面，通过标准克隆技术缺失3ab和7基因，保持周围开放读框和转录调节序列完整。另外，N基因可克隆到S基因上游的基因组的一个位点上。用缺少3ab和7基因并带有重排基因组的pBAC-TGEVFL衍生物转染猪睾丸上皮细胞(ST)。重组TGEV病毒被噬斑纯化，用RT-PCR鉴定缺少3ab和/或7基因的特性。大量的重组TGEV缺失病毒由感染的ST细胞生成。
结论：生成了缺少3ab和7基因的并带有基因顺序重排的重组TGEV。这些病毒可作为一个抗TGEV的活的减毒疫苗，同时也可抗编码相关抗原的基因被适当整合的其它猪病原体。
IV.鸟传染性支气管炎病毒(IBV)
IV.1.生成一个抗IBV的活的减毒疫苗
目的：发展一个抗IBV的活的减毒疫苗。
方法：生成缺少非必需基因3a/b和/或5a/b的重组IBV缺失突变病毒。为了获得保护并对抗多IBV血清型的疫苗，来源于不同病毒的刺突基因构建体被整合。
步骤：按Casais等(2001)描述，生成重组病毒。
通过用来源于质粒pFRAG1，pFRAG2和pFRAG3的衍生的质粒的cDNA片段的顺序连接反应，感染的IBV cDNA克隆被装配到疫苗病毒基因组内，随后，直接克隆进入疫苗病毒vNotI/tk(如1a中所描述)基因组。采用PCR诱变，从pFRAG3除去3a/b和5a/b基因并保持周围开放读框和转录调节序列完整，生成pFRAG3Δ。使用RT-PCR，pFRAG3Δ内的S基因可被不同IBV血清型来源的S基因取代。
通过鸡痘病毒HP 1.441和vNotI/tk-IBV在体外连接混合物中重组生成重组疫苗病毒。重组病毒被噬斑纯化，使用PCR和Southern blot分析特异性。最后，按如下方法生成缺失3a/b和/或5a/b基因的感染的IBV：表达T7 RNA聚合酶的重组鸡痘病毒感染鸡肾细胞(CK)。随后，用含有缺失3a/b和5a/b基因的IBV cDNA克隆的重组疫苗病毒中分离的DNA转染细胞。感染后3天，收集培养基用于感染CK细胞以生成大量重组IBV。重组病毒用RT-PCR分析进行遗传确认。
结论：生成缺少3a/b和/或5a/b基因的重组IBV。
这些病毒可作为一个抗IBV的活的减毒疫苗。通过取代S基因，可以获得可作为抗不同IBV血清型的活的减毒疫苗的重组IBVs。
IV.2.生成多价IBV为基础的疫苗
目的：以一个活的减毒IBV株为载体，发展多价疫苗。
方法：鸡病原体保护相关基因的表达盒被导入非必需基因减毒缺失的IBV基因组。表达盒包含位于被表达基因(部分)前面的IBV TRS(CTTAACAA)。
IV.2.aI.以一个IBV载体为基础构建一个抗多种IBV血清型的多价疫苗。
目的：以一个活的减毒IBV株为基础，发展一个缺少非必需基因和抗多种血清型的IBV疫苗。
步骤：来源于不同IBV血清型的保护相关的IBV S基因(部分)被放置在表达盒里，随后，被导入pFRAG3Δ。最大的构建体包含一个除编码信号肽的序列以外的完全额外的S基因拷贝；其他构建体带有一个缺少跨膜领域和内部结构域的密码的羧基末端截短的S基因。通过限制和序列分析证实所有构建后，如上所述生成重组病毒。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。使用放射性标记重组病毒感染的细胞裂解液，用类型特异的抗血清进行免疫沉淀分析来检验异源S基因构建体的表达。
结论：不同IBV血清型来源的保护相关的IBV S基因(部分)可通过一个活的减毒IBV株被导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗多种IBV血清型感染的多价疫苗。
IV.2.aII.以IBV载体为基础，构建一个抗新城疫的多价疫苗。
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒IBV株为基础，发展新城疫病毒(禽副粘病毒类型I；APMV-1)疫苗。
步骤：保护相关的APMV-I群HN和F基因(部分)被放置在表达盒里，随后，被导入pFRAG3Δ。通过限制和序列分析证实所有构建后，如上所述生成重组病毒。生成的病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的APMV-1的HN和F基因(部分)可通过一个活的减毒IBV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗APMV-1和IBV感染的多价疫苗。
IV.2.b.以一个IBV载体为基础，构建一个抗禽流感的多价疫苗。
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒IBV株为基础，发展禽流感病毒疫苗。
步骤：保护相关的禽流感H和N基因(部分)被放置在一个表达盒里，随后，被导入pFRAG3Δ。通过限制和序列分析证实所有构建后，如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的禽流感H和N基因(部分)可通过一个活的减毒IBV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗禽流感和IBV感染的多价疫苗。
IV.2.c.以一个IBV载体为基础，构建一个抗鸡贫血病毒病(CAV)的多价疫苗。
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒IBV株为基础，发展CAV疫苗。
步骤：保护相关的鸡贫血病毒V1，V2，和V3基因(部分)被放置在一个表达盒里，随后，被导入pFRAG3Δ。通过限制和序列分析证实所有构建后，如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的鸡贫血病毒V1，V2，和V3基因(部分)可通过一个活的减毒IBV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗CAV和IBV感染的多价疫苗。
IV.2.d.以一个IBV载体为基础，构建一个抗禽呼肠弧病毒疾病的多价疫苗。
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒IBV株为基础，发展禽呼肠弧病毒疫苗。
步骤：保护相关的禽呼肠弧病毒Φ1，Φ2，和83基因(部分)被放置在一个表达盒里，随后，被导入pFRAG3A。通过限制和序列分析证实所有构建后，如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的禽呼肠弧病毒Φ1，Φ2，和83基因(部分)可通过一个活的减毒IBV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗禽呼肠弧病毒和IBV感染的多价疫苗。
IV.2.e.以一个IBV载体为基础，构建一个抗传染性华氏囊病的多价疫苗。
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒IBV株为基础，发展传染性华氏囊病病毒(IBDV)疫苗。
步骤：保护相关的IBDV VP2基因(部分)被放置在一个表达盒里，随后，被导入pFRAG3Δ。通过限制和序列分析证实所有构建后，如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的IBDV VP2基因(部分)可通过一个活的减毒IBV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗IBDV和IBV感染的多价疫苗。
IV.2.f.以一个IBV载体为基础，构建一个抗馬立克氏病的多价疫苗。
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒IBV株为基础，发展Gallid疱疹病毒2(馬立克氏病病毒)疫苗。
步骤：保护相关的Gallid疱疹病毒2gB基因(部分)被放置在表达盒里，随后，被导入pFRAG3。通过限制和序列分析证实所有构建后，如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的Gallid疱疹病毒2gB基因(部分)可通过一个活的减毒IBV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗Gallid疱疹病毒2和IBV感染的多价疫苗。
IV.2.g.以一个IBV载体为基础，构建一个抗传染性喉气管炎的多价疫苗。
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒IBV株为基础，发展Gallid疱疹病毒1(传染性喉气管炎病毒)疫苗。
步骤：保护相关的Gallid疱疹病毒1的gB，gC，gD，gE，gH，gI，gK，gL，和gM基因(部分)被放置在表达盒里，随后，被导入pFRAG3Δ。通过限制和序列分析证实所有构建后，如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的Gallid疱疹病毒1基因(部分)可通过一个活的减毒IBV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗Gallid疱疹病毒1和IBV感染的多价疫苗。
IV.3.生成基因顺序重排的重组病毒
目的：发展一个通过移动IBV基因组内S基因上游的N基因基因顺序重排及缺失非必需基因联合的IBV疫苗。
步骤：按Casais等(2001)描述，生成重组病毒。采用来源于质粒pFRAGI，pFRAG2，和pFRAG3的cDNA片段的体外顺序连接反应将感染的IBV cDNA克隆装配到疫苗病毒基因组内。随后，直接克隆进入疫苗病毒vNotI/tk(如1a中所描述)基因组。采用PCR诱变，从pFRAG3除去3a/b和5a/b基因，保持周围开放读框和转录调节序列完整。另外，N基因和它的TRS被移动到S基因上游的位置，产生重排的pFRAG3Δ。通过鸡痘病毒HP 1.441和vNotI/tk-IBV在体外连接混合物中重组生成重组疫苗病毒。重组病毒被噬斑纯化，使用PCR和Southern blot分析特性。最后，按如下方法生成缺失3a/b和/或5a/b基因和基因顺序重排的感染的IBV：表达T7 RNA聚合酶的重组鸡痘病毒感染鸡肾细胞(CK)，随后，从含有缺失3a/b和5a/b基因和基因顺序重排的IBV cDNA克隆的重组疫苗病毒中分离DNA转染细胞。感染后3天，收集培养基去感染CK细胞以生成大量重组IBV。重组病毒用RT-PCR分析进行遗传确认。
结论：生成缺少3a/b和/或5a/b基因及基因顺序重排的重组IBV。这些病毒作为一个抗IBV的活的减毒疫苗。联合其它IBV血清型的S基因构建体和/或其他附加的禽病原体的基因构建体，可生成多价疫苗。
V.人冠状病毒(HCoV)株229E(HCoV-229E)
V.1.以减毒的HCoV-229E为基础，生成一个活疫苗。
目的：发展一个抗HCoV-229E的活的减毒疫苗。
方法：缺失非必需基因4a/b的重组HCoV缺失突变体病毒的生成。
步骤：按Thiel等(2001)描述，生成重组病毒。感染的HCoV cDNA克隆在疫苗病毒基因组装配。疫苗病毒vHCoV-vec-1包含一个编码HcoV基因组5’末端的22.5kbp cDNA片段。用Bspl20I消化疫苗基因组把，这个片段从中切除下来，用MluI消化，并与用MluI/EagI消化获得的pMEΔ的cDNA片段连接。pMEΔ包含编码HcoV基因组3’末端，但是缺少4a/b的cDNA片段，没有影响其他基因和转录调节序列。采用传统的PCR诱变方法，用pME生成pMEΔ。这个连接产物与vNotI/tk疫苗病毒DNA连接。按如上方法生成重组疫苗病毒。重组病毒被噬斑纯化，使用PCR和Southern blot分析特性。最后，按如下方法生成缺失4a/b基因的感染的HCoV：表达T7 RNA聚合酶的重组鸡痘病毒感染鸡肾细胞(CK)。随后，用包含缺失4a/b基因的HCoV cDNA克隆的重组疫苗病毒中分离的DNA转染细胞。感染后3天，收集培养基去感染人纤维母细胞(MRC-5)生成大量重组HCoV。重组病毒用PCR分析进行遗传确认。
结论：生成缺失基因4a/b的重组HCoV。这些病毒可作为一个抗HCoV-229E的活的减毒疫苗。
V.2.生成一个抗HCoV株OC43的活的减毒疫苗
目的：发展一个抗HCoV-OC43的活的减毒疫苗
方法：生成缺少非必需基因4a/b的重组HcoV缺失突变病毒，它包含一个可编码HCoV-OC43外部结构域的杂合S蛋白基因。
步骤：按Thiel等(2001)描述，生成重组病毒。感染的HCoV cDNA克隆在疫苗病毒基因组中装配。疫苗病毒vHCoV-vec-1包含一个编码HcoV基因组5’末端的22.5kbp的cDNA片段。用Bspl20I消化，把这个片段从疫苗基因组中切除下来，用MluI消化，并与用MluI/EagI消化得到的pMEΔ-SOC43的cDNA片段连接。pMEΔ-SOC43包含一个cDNA片段，其编码HCoV基因组3’末端，缺少4a/b基因，还包含一个杂合S蛋白基因，没有影响其他基因和转录调节序列。这个杂合S蛋白基因包含编码S蛋白外部结构域的HCoV-OC43的S基因区域，基因的其余部分来源于HCoV-229E基因。采用传统的(RT-)PCR诱变方法，用pMEA生成pMEΔ-SOC43。这个连接产物与vNotI/tk疫苗病毒DNA连接。按如上方法生成重组疫苗病毒。重组病毒被噬斑纯化，使用PCR和Southern blot分析特性。最后，按如下方法生成缺失4a/b基因的感染的HCoV：表达T7 RNA聚合酶的重组鸡痘病毒感染鸡肾细胞(CK)。随后，用包含缺失4a/b基因的HCoV cDNA克隆的重组疫苗病毒中分离的DNA转染细胞。感染后3天，收集培养基去感染人纤维母细胞(MRC-5)生成大量重组HCoV。重组病毒用RT-PCR分析进行遗传确认。
结论：生成缺失基因4a/b的重组HcoV。这些病毒包含HCoV-OC43的S蛋白的外部结构域，因此可作为一个抗HCoV-OC43的活的减毒疫苗。
V.3.生成一个多价的基于HCoV的疫苗
目的：以一个活的减毒HCoV株为载体，发展一个多价疫苗。
方法：人病原体保护相关的基因的表达盒被导入HCoV基因组，与非必需基因减毒缺失相结合。表达盒在所表达基因(部分)的前面包含HCoV TRS(TCTCAACT)。
V.3.a.以HCoV为基础，构建一个抗呼吸道合胞体病毒的多价疫苗(RSV)
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒HCoV株为基础，构建一个RSV疫苗
步骤：保护相关的RSV的HN和F基因(部分)被放置在表达盒里，随后，被导入pMEA。通过限制和序列分析证实所有构建体后，按如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的RSV的HN和F基因(部分)可通过一个活的减毒HCoV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为抗RSV和HCoV感染的多价疫苗。
V.3.b.以一个HCoV载体为基础，构建一个抗轮状病毒的多价疫苗
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒HCoV为基础，发展轮状病毒疫苗。
步骤：保护相关的轮状病毒VP4，VP6和VP7基因(部分)被放置在表达盒里，随后被导入pMEΔ。通过限制和序列分析证实所有构建后，按如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的轮状病毒VP4，VP6和VP7基因(部分)可通过一个活的减毒HCoV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为保护并对抗轮状病毒和HCoV感染的多价疫苗。
V.3.c.以一个HCoV载体为基础，构建一种保护并对抗诺沃克样病毒(Norwalk-like virus)的多价疫苗
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒HcoV株为基础，发展一个诺沃克样病毒疫苗。
步骤：保护相关的诺沃克样病毒衣壳基因(部分)被放置在表达盒里，随后，被导入pMEΔ。通过限制和序列分析证实所有构建后，按如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的诺沃克样病毒衣壳基因(部分)可通过一个活的减毒HCoV株导入和表达。因此，这个重组病毒可作为保护并对抗诺沃克样病毒和HCoV感染的多价疫苗。
V.3.d.以一个HCoV载体为基础，构建一种保护并对抗流感病毒的多价疫苗
目的：以一个缺少非必需基因的活的减毒HCoV株为基础，发展一个流感病毒疫苗。
步骤：保护相关的流感病毒H和N基因(部分)被放置在表达盒里，随后，被导入pMEΔ。通过限制和序列分析证实所有构建后，按如上所述生成重组病毒。重组病毒以RT-PCR分析进行遗传确认。外源基因的表达通过免疫沉淀分析证实。
结论：保护相关的流感病毒H和N基因(部分)可通过一个活的减毒HCoV株导入和表达。因此，这些重组病毒可作为保护并对抗流感病毒和HCoV感染的多价疫苗。
V.4.生成基因顺序重排的重组病毒
目的：通过移动HCoV基因组内S基因上游的N基因的基因顺序重排与非必需基因缺失联合，发展一个HCoV疫苗。
步骤：主要按Thiel等(2001)描述，生成重组病毒。感染的HCoV cDNA克隆在疫苗病毒基因组装配。疫苗病毒vHCoV-vec-1包含一个编码HcoV基因组5’末端的22.5kbp cDNA片段。用Bspl20I消化，，这个片段从疫苗基因组被切除下来，用MluI消化，与MluI/EagI消化获得的重排的pMEΔ的cDNA片段连接。重排的pMEΔ包含一个编码HcoV基因组3’末端的cDNA片段，但是缺少4a/b，没有影响其他基因和转录调节序列，其中N基因和它的TRS位于S基因上游。采用传统的PCR诱变方法，用pME生成重排的pMEΔ。这个连接产物与vNotI/tk疫苗病毒DNA连接。按如上方法生成重组疫苗病毒。重组病毒被噬斑纯化，使用PCR和Southern blot分析特性。最后，按如下方法生成缺失4a/b基因的感染的HCoV：用表达T7 RNA聚合酶的重组鸡痘病毒感染鸡肾细胞(CK)。随后，用重组疫苗病毒中分离的DNA转染细胞，重组疫苗病毒包含缺失4a/b基因和基因顺序重排的HCoV cDNA克隆。感染后3天，收集培养基去感染人纤维母细胞(MRC-5)生成大量重组HCoV。重组病毒用RT-PCR分析进行遗传确认。
结论：生成缺失基因4a/b和基因顺序重排的重组HCoV。这些病毒可作为一个抗HCoV-229E的活的减毒疫苗。当结合HCoV-OC43来源的S基因构建体和/或其他额外人病原体来源的基因构建体时，可生成多价疫苗。
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