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本发明提供一种检测肝硬化的方法，该方法通过使用特定结合到自人原癌基因HCCR－2表达的蛋白的抗体进行的抗原－抗体结合反应来测量活体内标本中的HCCR－2蛋白的表达水平；以及一种用于诊断肝硬化的试剂盒。由于改进了准确性和复现性，所述诊断方法和试剂盒可有利地用于对肝硬化的早期诊断。

权利要求书
1.  一种在试样中检测HCCR-2蛋白(GenBank登记号：AF315598)的方法，其包括以下步骤：
1)将HCCR-2特异抗体放入涂布有试样和对照组的反应器中以诱发抗原-抗体反应；
2)使用次级抗体-标记共轭物和标记物的显色基质溶液来检测所述抗原-抗体复合体；以及
3)将试样的检测结果与对照组的检测结果进行比较，以测量HCCR-2蛋白在标本试样中的表达程度。

2.  根据权利要求1所述的在试样中检测HCCR-2蛋白(GenBank登记号：AF315598)的方法，其中所述抗原-抗体结合反应是通过下列任一技术来进行检测：酶-链接免疫吸收剂化验(ELISA)、放射免疫化验(RIA)、夹心法化验(sandwich assay)以及在聚丙烯酰胺凝胶上进行的免疫组织化学(immunohistochemistry)方法或免疫印迹分析(immunoblottinganalysis)，蛋白质印迹法(Western blotting)。

3.  根据权利要求1所述的在试样中检测HCCR-2蛋白(GenBank登记号：AF315598)方法，其中所述HCCR-2特异抗体是在动物或卵中将人类HCCR-2抗原蛋白致免疫所获得的抗血清纯化而得。

4.  根据权利要求1所述的在试样中检测HCCR-2蛋白(GenBank登记号：AF315598)的方法，其中所述标本试样为组织、血清或血浆。

5.  根据权利要求1所述的在试样中检测HCCR-2蛋白(GenBank登记号：AF315598)的方法，其中所述反应器是选自由下列各物品构成的组合：硝化纤维膜、由聚乙烯或聚苯乙烯树脂制成的孔板以及载玻片。

6.  根据权利要求1所述的在试样中检测HCCR-2蛋白(GenBank登记号：AF315598)的方法，其中将所述HCCR-2蛋白特异抗体以约1到10μg/100μl的量加入各个反应器。

7.  一种诊断肝硬化的试剂盒，其包括一针对人原癌基因HCCR-2蛋白：AF315598)的特异抗体，通过以抗原-抗体结合反应测量标本中的所述HCCR-2蛋白表达水平来执行所述诊断。

8.  根据权利要求7所述诊断肝硬化的试剂盒，其包括：
a)HCCR-2蛋白特异抗体；以及
b)含有HCCR-2标准抗原的阳性对照组和含有未注射所述抗原的动物抗血清的阴性对照组。

9.  根据权利要求7或8所述诊断肝硬化的试剂盒，其还包括：
a)次级抗体共轭物，具有通过与基质反应而产生颜色的共轭标记物；
b)显色基质溶液，其与所述标记物反应以产生颜色；
c)用于各个步骤的洗涤液；以及
d)酶促反应停止液。

10.  根据权利要求9所述诊断肝硬化的试剂盒，其中所述次级抗体共轭物的标记物是选自下列物质构成的组合：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、胶态金、荧光素以及染料。

11.  根据权利要求9所述诊断肝硬化的试剂盒，其中所述显色基质选自下列物质构成的组合：3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)以及邻-苯二胺(OPD)。

12.  根据权利要求7所述诊断肝硬化的试剂盒，其中所述抗原-抗体结合反应通过下列任一技术来进行检测：酶-链接免疫吸收剂化验(ELISA)、放射免疫化验(RIA)、夹心法化验(sandwich assay)以及在聚丙烯酰胺凝胶上进行的蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫印迹分析(immunoblotting analysis)或免疫组织化学(immunohistochemistry)方法。

13.  根据权利要求7所述诊断肝硬化的试剂盒，其中所述HCCR-2特异抗体是在动物或卵中将人类HCCR-2抗原蛋白致免疫所获得的抗血清纯化而得。

14.  根据权利要求7所述诊断肝硬化的试剂盒，其中所述标本试样为组织、血清或血浆。

说明书包含特定针对人原癌基因蛋白的抗体的肝硬化诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种通过使用特定结合到自人原癌基因HCCR-2表达的蛋白的抗体进行的抗原-抗体结合反应来检测存在于血清试样中的人类HCCR-2蛋白的方法，以及一种用于诊断肝硬化的试剂盒。
背景技术
肝硬化在广义上称为肝纤维症，可在患者肝脏产生结节。作为末期慢性肝病，肝硬化导致持久性和复发性扩散肝损伤，在肝细胞中引起纤维症和形成结节(Ikeda等人，Hepatology 18：47-53，1993；Minami H和OkanoueT，Int Med.80：646-649，1997；Kiyosawa K，Hepatology Research 24：S40-S45，2002)。肝脏炎症的主要因素包括病毒、药物成分、酒精、代谢病、慢性胆汁郁积、肝静脉血流阻塞。肝硬化占肝癌病案的60-90％，并且肝硬化患者中的5-20％将引起肝癌，此表明肝硬化增加了患肝癌的风险。因此，迫切需要早期诊断肝硬化并且消除可导致肝硬化的主要因素(Velazquez等人，Hepatology 37(3)：520-527，2003)。除了病毒因素之外，与肝硬化相关的危险因素还包括滥用酒精、化学物质、血色素沉着等。因此，对这些疾病及其危险因素的早期检测、消除、接种和检疫极为重要。
呈现临床正常特征而无并发症的肝硬化称为代偿性肝硬化。伴有各种并发症的肝硬化称为失代偿性肝硬化。
腹腔镜检查和肝脏器官检查已作为诊断肝硬化的最主要检验手段而得到推广。为了直接观察肝脏内部结构，通过一小切口在腹内执行腹腔镜技术，即，通过一小进入切口将内诊镜插入腹腔。当通过腹腔镜检查发现硬块状表面时，诊断为肝脏器官发生硬化。而且，当通过肝脏器官检查发现肝纤维症时，诊断出肝硬化的存在或其严重性。但是，这种检查可使患者产生心理负担。而且，对肝硬化的精确诊断通常基于各种方法或技术的组合，包括医嘱、血液检查、超声波检查、计算机断层扫描(CT)。
在肝硬化病案中，血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平(相当于常规GOT或GPT水平)不是很高，而且基本上正常或低于正常水平的两倍，使其难以用作肝脏炎症的有效诊断指示。特别是即使在涉及代偿性肝硬化的病案中，也存在大量功能正常的肝细胞。因此，白蛋白或胆红素的水平降低到基本正常范围之下。在另一方面，在涉及失代偿性肝硬化的病案中，白蛋白的水平可能降低，或者胆红素的水平可能升高。功能正常的肝细胞的存在对于肝硬化或晚期慢性肝病患者而言相当重要，但白蛋白或胆红素仅为存在正常肝细胞的粗略指示。如果没有足够多的正常肝细胞，由于正常肝细胞会产生凝血因子，因此可能会延迟血液凝结。执行凝血酶原时间(PT)检查直接对完全血液凝结进行评估，其亦充当评估剩余肝功能的指示。肝硬化导致脾变大，脾中截留大量血小板。因此，由于不明起因引起的血小板水平减小被怀疑患有肝硬化。
针对慢性肝炎中肝炎病毒的血清指标检查亦充当肝硬化的重要指示。在韩国，约60％的肝硬化是由乙型肝炎病毒(HBV)引起，而约20％的肝硬化是由丙型肝炎病毒(HCV)引起。因此可以说，阳性HBV或HCV指标表明存在慢性肝病的高度危险因素。此外，当患者呈现其它表明肝硬化的损伤时，自然会将该患者的损伤诊断为肝硬化。
血清甲胎蛋白(AFP)水平是用于肝癌早期检测的化验，在一些患有慢性肝炎或硬化但无HCC损伤的患者中会观察到血清甲胎蛋白(APF)水平的非特异性增大。(Adinolfi A等人，J Med Genet.12(2_″138-151，1975；LockAS and Lai CL Hapatology 9(1))。在肝硬化的诊断中，根据AFP浓度在正常成人血清中几乎为0而在许多肝硬化患者中急剧增大这一发现，甲胎蛋白(AFP)水平已被有利地用作对肝硬化早期检测的筛选因素之一。但是，事实上，在慢性肝炎或肝硬化中AFP浓度都有可能增大。因此，尽管AFP测试在一定程度上被看作是从慢性肝病患者中筛选HCC患者的基本步骤，但是根据AFP水平进行肝硬化诊断要求考虑诸多因素，这意味着有必要探究新的有效诊断方法。因此，作为此类研究的组成部分，为了实现对肝硬化的早期诊断和有效预测，非常有必要研发出提高敏感性和特异性的新型血清检查。
因此，为了研发用于肝硬化有效早期诊断的方法，本发明人进行了不懈的探索和研究，并且确认：通过使用特定结合到自人原癌基因HCCR-2表达的蛋白的抗体进行的抗原-抗体结合反应可有效检测肝硬化，如韩国专利公开案第2002-41550号中所述，所述人原癌基因HCCR-2以登记号(Accession No.)AF315598保藏于GenBank(基因库)。正是此发现引导本发明人完成本发明。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种使用血清中的人原癌基因HCCR-2在早期有效检测肝硬化的方法以及一种用该方法诊断肝硬化的试利盒。
为了实现上述本发明的目的，提供一种用于诊断肝硬化的方法，该方法通过使用特定结合到自人原癌基因HCCR-2表达的蛋白的抗体进行的抗原-抗体结合反应来测量活体内试样中的HCCR-2蛋白表达水平；以及一种用于诊断肝硬化的试剂盒。
图1说明根据本发明对HCCR-2重组蛋白进行的免疫印迹地结果，其中该HCCR-2重组蛋白是从转型为pMAL-p2X/HCCR-2载体的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21菌株分离且纯化；以及
图2说明根据本发明使用HCCR-2多克隆抗体对肝硬化血清和正常血清中的HCCR-2蛋白表达进行检测的诊断结果。
下面将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
人原癌基因HCCR-2(GenBank Accession No.AF315598；韩国专利公开案第2002-41550号)位于12号染色体的长臂(12q)中并且具有开放阅读框架，当其在哺乳动物体内过度表达时可充当致癌基因，并且自其可衍生具有大小约36kDa蛋白(称为HCCR-2蛋白)。
HCCR-2蛋白特异抗体较佳为动物体内的HCCR-2抗原蛋白致免疫所获得的抗血清经纯化而获得的。HCCR-2蛋白特异抗体更佳为兔体内HCCR-2抗原蛋白致免疫所获得的血清经纯化而获得的多克隆抗体。
为了合成特定的识别HCCR-2蛋白的抗体，首先获得HCCR-2蛋白。HCCR-2蛋白可使用已知的氨基酸序列来合成，或者通过基因工程方法以重组蛋白类型来产生。例如，可通过以下方法来制备HCCR-2重组蛋白，该方法包括：使用美国国家卫生研究所(NIH)计划基因数据库(GenBankdatabase)中列出的HCCR-2基因的碱基顺序制备呈重组蛋白形态的表达HCCR-2蛋白的表达载体；通过使该表达载体转型为E.coli(大肠埃希氏菌)获得转化体，从而产生HCCR-2重组蛋白；以及培养该转化体以分离/纯化人原癌基因HCCR-2重组蛋白。
在本发明的优选实施例中，从转型为含有HCCR-2基因氨基酸序列112-304的pMAL-p2X/HCCR-2载体的E.coli BL21产生具有融合到N-末端的麦芽糖的重组蛋白，随后以适当的酶处理，将移除了麦芽糖的HCCR-2112-304蛋白分离/纯化后用作抗原蛋白。为了确认以此方式产生的蛋白为HCCR-2112-304重组蛋白，通过蛋白质印迹(Western blot)分析观察到对分子量为约66kDa(45kDa的pMAL加16kDa的HCCR-2112-304)的HCCR-2重组蛋白的特异检测。
将从E.coli转化体分离且纯化的HCCR-2重组蛋白用作一抗原，其用于筛选和分析通过兔子的免疫和细胞融合来产生多克隆抗体的融合细胞系。
产生多克隆抗体所必须的经免疫的兔子是通过以下方式产生：将HCCR-2重组蛋白与当量的佛氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)良好混合直到混合物乳化，并且将该混合物注射入兔子腹膜内，接着以加强注射增加兔子的免疫原性。较佳为进一步仅将HCCR-2重组蛋白分3次经由腹膜内路径注入兔子体内，而不使用佐剂。
收集通过注射HCCR-2重组蛋白抗原而被免疫的兔血清，并且测量抗体滴度。
通过测定此蛋白在取自式样的活体内试样中的表达，可实现使用以此方式产生的HCCR-2特异抗体蛋白所进行的抗原-抗体结合反应来诊断癌症。可使用本领域中已知的技术来检测表达水平，包括酶链接免疫吸收剂化验(ELISA)、放射免疫化验(RIA)、夹心法化验以及在聚丙烯酰胺凝胶上进行的蛋白质印迹法(Western blotting)或免疫印迹分析。
作为活体内试样(样本)，较佳为使用组织、血清或血小板，最佳为使用血清。
在优选实施例中，通过下列步骤执行使用HCCR-2蛋白特异抗体的ELISA技术：
1)将HCCR-2特异抗体放入涂布有试样和对照组的反应器中以诱发抗原-抗体反应；
2)使用次级抗体-标记共轭物和标记物的显色基质溶液来检测抗原-抗体反应产物；以及
3)将试样的检测结果与对照组的检测结果进行比较。
使用例如ELISA、生物微切片或自动微阵列系统等已知技术可分析大量试样。通过将HCCR-2特异抗体蛋白固定在生物微切片上并使其与从个体收集的活体内试样进行反应，可检测HCCR-2特异抗体蛋白的抗原。
而且，本发明还提供一种用于诊断肝硬化的试剂盒，其包括特定与HCCR-2反应的抗体，从而实现对肝硬化的早期诊断。
本发明提供的诊断试剂盒包含：
1)针对HCCR-2的特异抗体；
2)含有HCCR-2标准抗原的阳性对照组和含有未注射所述抗原的动物抗血清的阴性对照组；
3)具有通过与基质反应而产生颜色的共轭标记物的次级抗体共轭物；
4)显色基质溶液，其与标记物反应以产生颜色；
5)用于各个步骤的洗涤液；以及
6)酶促反应停止液。
该诊断试剂盒可通过抗原-抗体结合反应来定量或定性分析抗体蛋白的抗原，从而诊断肝硬化。可通过本领域中通常已知的技术来检测抗原-抗体结合反应，包括ELISA、RIA、夹心法化验、聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质印迹法以及免疫印迹分析。例如，可提供该诊断试剂盒以用于使用涂布有重组单克隆抗体蛋白的96-孔微量滴定板的ELISA。
其上可涂布该抗体蛋白的有效反应器的实例包括硝化纤维膜、由聚乙烯树脂制成的96-孔板、由聚苯乙烯树脂制成的96-孔板以及载玻片。
如前述，本发明提供的抗体较佳是从通过使动物体内的HCCR-2抗原蛋白致免疫而获得的抗血清纯化而得。HCCR-2蛋白特异抗体较佳是以约1到10μg/100μl的比率涂布每个反应器。
本发明提供的诊断试剂盒中所含有的对照组包括阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组为含有HCCR-2蛋白标准抗原的混合物，而阴性对照组为未感染HCCR-2蛋白抗原的动物血清。在本发明的实例中，使用具有具有下列各种蛋白浓度的HCCR-2蛋白标准抗原溶液：0ng/ml(A)、20ng/ml(B)、40ng/ml(C)、80ng/ml(D)、160ng/ml(E)、320ng/ml(F)以及640ng/ml(G)。
作为次级抗体标记物，较佳的是使用包括引发显色等的已知标记物且可用于本发明的标记物包括：辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；胶态金；荧光素如聚L-赖氨酸-荧光素异硫氰酸酯(FITC)或若丹明-B-异硫氰酸酯(RITC)；以及染料。在本发明中，例如，使用山羊抗兔IgG-HRP共轭物(IgG-HRP共轭物)。
所使用的色原体较佳根据涉及显色剂的标记物而变化，且其可用实例包括3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)以及邻-苯二胺(OPD)。更佳以溶解于缓冲液(0.1M NaAc，pH5.5)中的形态提供色原体。例如TMB等色原体通过HRP分解，以用作次级抗体共轭物的标记物以便产生显色沉淀物。通过肉眼观察显色沉淀物的沉淀等级，由此测定HCCR-2蛋白抗原的存在。
洗涤液较佳包括磷酸盐缓冲液、NaCl、吐温(Tween)20，更佳包括含有0.02M磷酸盐缓冲液、0.13M NaCl以及0.05％吐温20的缓冲液。在抗原-抗体结合反应之后，将适量的洗涤液供应入已经历次级抗体与抗原-抗体共轭物之间的反应的反应器中。重复洗涤液洗涤3到6次。较佳为将含磷酸盐缓冲剂的0.1％BSA用作阻断液，且较佳为将2N的硫酸用作酶促反应停止液。
下文将描述通过使用该诊断试剂盒在标本中检测HCCR-2抗原早期诊断肝硬化的方法。阳性对照组和阴性对照组中的HCCR-2多克隆抗体和标本试样分别反应，并以洗涤液洗涤。随后，将以标记物标记的次级抗体共轭物添加到所得产物中并再次以洗涤液洗涤，其中该标记物通过与基质反应而产生颜色。随后，将含基质的溶液添加到所得产物中以诱发显色。随后，测量450nm下的吸光率。此处，标准抗原溶液A的平均吸光率应大于或等于0.000且小于或等于0.200。标准抗原溶液F的平均吸光率应大于或等于1.200且小于或等于3.000。将标准抗原溶液A与F的吸光率值之间的平均值设定为截止值，确定试样为阳性或阴性试样。当试样的吸光率大于标准抗原溶液F的吸光率时，稀释该试样并且随后再次测量其吸光率。将吸光率高于截止值的试样识别为阳性，而将吸光率低于截止值的试样识别为阴性。
本发明提供的含有人原癌基因HCCR-2特异抗体的肝硬化诊断试剂盒是使用患者血清的新型免疫诊断工具，已证实其具有更高的准确性和复现性。现有地，也将用于诊断肝癌的AFP检查工具用作肝硬化的血清诊断试剂盒，但其准确性极差。但是，本发明提供的用于肝硬化早期诊断的血清HCCR-2检查所展示的诊断准确性约为95.1％，其在统计学上显著高于常规AFP检查。因此，本发明提供的诊断方法和试剂盒可极为有利地用于肝硬化的早期诊断和小HCC的诊断，因为其具有较高的准确性和复现性。
现将通过下列实例对本发明进行详细说明，而非以任何方式将本发明的范畴局限于实例中所描述的特定实施例。
<实例1>HCCR-2多克隆抗体的产生
<1-1>HCCR-2重组蛋白的产生
为了产生作为肝硬化诊断标记物的人原癌基因HCCR-2特异抗体，通过将对应于GenBank登记号AF315598氨基酸序列号112-304的人原癌基因HCCR-2部分插入pET-32(+)载体的多克隆部位，制备pET-32b(+)/HCCR-2载体(New England biolabs，MA)。将该载体转型为E.coli BL21(DE3)(Novagen，Wl)并以1mM异丙基(3-D-硫代乳-吡喃糖苷(IPTG)(SigmaChemical Co.制造)处理从而诱发表达，产生融合有45KDa麦芽糖蛋白的66 KDa HCCR-2112-304融合蛋白，并以淀粉酶树脂试剂盒(New Englandbiolabs，MA)对其进行纯化(国际专利申请公开案WO 02/44370 A1)。使经纯化的重组蛋白经历免疫印迹，从而确认包括大量的约66kDa融合蛋白(图1)。将如此分离且纯化的HCCR-2重组蛋白用作抗原-抗体结合反应中的抗原以分析产生用于兔免疫的多克隆抗体的融合细胞系。
<1-2>兔免疫
为了获得制造特定针对实例<1-1>中所制备的HCCR-2重组蛋白的抗体所必须的经免疫的兔子，使用新西兰白兔(NZW)(平均重量为约2.5kg)。将200μg/l的HCCR-2重组蛋白与200μg/l的佛氏完全佐剂(Sigma ChemicalCo.制造)混合并乳化。将2ml所得乳液以每只兔子O.25ml的比率在8处背脊部位皮下投药。首次注射之后，以两周为时间间隔，使用佛氏不完全佐剂乳化经免疫的抗原以相同于首次注射的方式在2周内多次执行加强注射。
<1-3>分离兔血清并且筛选特异多克隆抗体
在最后一次接种的5天后，以2周为时间间隔从在实例<1-2>中经免疫的兔子的动脉收集血液，并自其分离出血清，储存在-20℃直到用于各种试验。检测血清的抗体特异性，结果表明，其仅与人原癌基因HCCR-2重组蛋白特异反应。为了在从E.coli分离且纯化的血清中筛选出与HCCR-2蛋白抗原特异反应的血清，对实例<1-1>中所制备的转化体进行ELISA。
具体地说，为了抑制非特异性免疫响应，通过将1％的脱脂乳-PBS涂覆在96-孔板(Falcon Co.，USA)上并使其在室温下静置1小时，从而涂布该96-孔板，并以1μg/孔的量将重组蛋白涂布到各个孔上。以含2％BSA的PBS溶液将兔血清流体稀释成1×103、1×104、1×105、1×106以及1×107等各种浓度，并将所得稀释溶液以100μl/孔的量添加到各个孔。此后，诱发抗原-抗体结合反应以使其在37℃下进行2小时，接着以PBS溶液洗涤三次。随后，将以含2％(W/V)BSA的PBS缓冲液稀释成1/10,000的各份100μl山羊抗兔IgG(美国Sigma Co.制造)作为次级抗体添加到每个孔，并且在37℃下反应1小时。
此后，将通过使10ml的0.1M经磷酸盐缓冲的柠檬酸盐(pH5.0)、1mg的3.3′，5.5′-四甲基联苯胺(TMB)(美国Sigma Co.制造)以及20μl的35％过氧化氢混合而获得的100μl基质溶液添加到各个孔中以诱发酶促反应。将酶促反应维持在室温下15分钟，且随后将相同量的2N硫酸溶液加入其中以终止酶促反应。在450nm下观察显色程度。从具有HCCR-2蛋白特异抗体的多克隆抗体中进一步筛选出抗体滴定度大于阴性对照组抗体滴定度10倍的血清，其中滴定度是通过ELISA测量而得，并且分析所筛选出的细胞的特征。
<实例2>使用HCCR-2多克隆抗体进行ELISA
使用HCCR-2多克隆抗体通过ELISA以下列方式进行肝硬化诊断。首先，以试样涂布各个孔；其次，以从兔子体内分离且纯化的HCCR-2特异多克隆抗体涂布ELISA板孔。接着，分步检测HCCR-2抗原-抗体结合在试样中的存在。
<2-1>以试样涂布各个孔
将肝硬化和肝炎血清以及正常肝脏血清用作标本。为了获得用于测量截止值的标准曲线，通过将HCCR-2重组蛋白分别稀释成0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml以及640ng/ml等各种浓度而制备标准抗原溶液A、B、C、D、E、F及G。
将各份100μl的标本分别分配到各个96-孔ELISA平底板并且在37℃下反应4小时，接着以洗涤缓冲液(包括0.05％吐温20的PBS，Ph7.4)洗涤4次。此处，将上文所制备的标准抗原溶液用作阳性对照组，而将正常兔血清用作阴性对照组。
<2-2>添加HCCR-2多克隆抗体
将根据实例<1-3>所制备的HCCR-2蛋白特异多克隆抗体放入各个涂布有标本的孔中，以盖子覆盖，并在4℃下静置16到18小时。将多克隆抗体在0.5M碳酸盐缓冲剂(pH9.6)中稀释成5μg/ml，并且将100μl稀释溶液添加到各个孔中。作为对照组，将未感染HCCR-2蛋白的正常兔血清在碳酸盐缓冲液中稀释500倍，并且分配到各个孔中(100μl/孔)。
随后，以洗涤缓冲液将板的各个孔洗涤4次。为了阻断非特异性蛋白结合部位，将阻断液(含有2％BSA的PBS缓冲液(pH7.4))分配到各个孔(300μl/孔)，并且在37℃下静置2小时。
<2-3>检测抗原-抗体复合体
将100μl的稀释10,000倍的辣根过氧化物酶共轭山羊抗兔IgG次级抗体添加到各个孔中，并且使该板在37℃静置1小时，接着以洗涤缓冲液洗涤4次。随后，将作为基质的1mg3.3′，5.5′-四甲基联苯胺(TMB)(SigmaCo.，USA)溶解于10ml柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)中并向其中添加2μl的35％过氧化氢，由此制备基质溶液。将100μl所制备的基质溶液分配到各个孔中，并在室温下避光反应15分钟。此后，添加50μl的2N H2SO4溶液以终止反应，并且测量450nm下的吸光率。对于各个标本，将HCCR-2抗原的吸光率推算成从试样吸光率中减去仅涂布有作为阳性对照组的HCCR-2融合蛋白和作为阴性对照组的PBS的孔的吸光率所获得的余数。以相同的方式，在计算出标准溶液的吸光率值之后，将标准抗原溶液A与F吸光率值之间的平均值设定为截止值。将吸光率高于截止值的试样识别为阳性，而将吸光率低于截止值的试样识别为阴性。
此处，标准抗原溶液A的平均吸光率应大于或等于0.000且小于或等于0.200。标准抗原溶液F的平均吸光率应大于或等于1.200且小于或等于3.000。
从使用HCCR-2标准抗原溶液所制备的标准曲线，将截止值确定为10μg/ml。基于该截止值，比较各个试样的吸光率值以判定其为阳性还是阴性。图3展示了从肝硬化组和正常组收集的血液中的HCCR-2蛋白浓度的比较结果。
<实例3>通过使用HCCR-2多克隆抗体进行的ELISA证实肝硬化诊断效率
<3-1>对于肝硬化患者组的AFP和HCCR-2试剂盒的诊断准确性
为了证实使用HCCR-2多克隆抗体的ELISA诊断试剂盒和方法的肝硬化诊断效率，将使用实例2中所述的HCCR-2特异抗体通过ELISA进行的测量与使用常规甲胎蛋白(AFP)检查进行的测量进行比较，其中常规甲胎蛋白(AFP)检查常规地用于HCC或肝硬化的诊断。使用市场上可买到的法国CISBio International的ELSA2-AFP试剂盒测量AFP水平。
为了根据诊断结果判定试样是阳性还是阴性，将AFP的截止值设定为20ng/ml，而将HCCR-2的截止值设定为10μg/ml，其是从标准曲线获得。通过麦内玛检定(McNemar test)所测量的数据对各个肝硬化和正常母性组中的AFP阳性与HCCR-2阳性之间的反应性差异进行比较。从肝硬化和正常组推算HCCR-2敏感性、特异性、伪阳性/阴性比以及95％置信区间。
将各个组之间的HCCR-2阳性反应性中的差异分别与费雪精确检定(Fisher′s exact test)所测量的数据进行比较。将各个组的AFP阳性反应性与HCCR-2阳性反应性之间的差异与麦内玛检定所测量的数据进行比较。将SAS方差6.12(SAS/STAT软件：Changes and Enhancements throughRelease 6.12.Gary，NC：SAS Institute，1997)用于所有统计分析，显著性水平(significance level)为0.05。
表1展示了对于62个肝硬化患者中61的HCCR-2和AFP试剂盒的诊断准确性比较结果，除去处于由62个肝硬化患者所组成的HCC组中的唯一一个患者。结果表明，基于HCCR-2的诊断准确性为95.1％，其显著高于基于AFP的诊断准确性，18.0％(chi_M^2＝43.614，df＝1，P＝0.0001，麦内玛检定)。
表1  AFP  阳性  阴性  合计  HCCR-2  阳性  9  42  58(95.1％)  阴性  2  2  3  合计  11(18.0％)  50  61(100％)
<3-2>证实HCCR-2试剂盒作为肝硬化诊断试剂盒的效用
如表2和3所示，使用实例2中所述的HCCR-2特异抗体通过ELISA方法对62个肝硬化患者和138个正常人进行诊断。本发明提供的HCCR-2试剂盒的敏感性为95.2％，且其特异性为91.3％，伪阳性和伪阴性分别为16.9％和2.3％。而且，整体诊断准确性为92.5，由此确认证实本发明提供的HCCR-2试剂盒作为诊断工具极为有效。
表2  HCCR-2  阳性  阴性  合计  组  肝硬化  59  3  62  正常  12  126  138  合计  71  129  200
表3  测量  值(％)  95％置信区间  敏感性  95.2  89.8～100  特异性  91.3  86.6～96.0  伪阳性  16.9  8.1～25.6  伪阴性  2.3  0～4.9  准确性  92.5  88.9～96.2
如前述，本发明提供的含有人原癌基因HCCR-2特异抗体的肝硬化诊断试剂盒是使用患者血清的新型免疫诊断工具，由于其具高于常规AFP检查工具的准确性和复现性，因此可有利地用于肝硬化的早期诊断。