Γ－聚谷氨酸的制备工艺.pdf

本发明涉及微生物技术领域，具体的说是一种γ－聚谷氨酸的制备工艺，其工艺步骤为(1)获取高产菌种工艺：菌种获取及分离、菌落的挑选与纯化、高产菌的筛选、菌种鉴定；(2)发酵工艺；(3)分离工艺；(4)纯化工艺。本发明与现有技术相比，采用了固体发酵降低了生产成本，且使用该工艺发酵时间短、提高了γ－PGA的产量、能耗少、操作简便。

权利要求书
1、  一种γ-聚谷氨酸的制备工艺，其特征在于其工艺步骤为：
(1)获取高产菌种工艺：
a.菌种获取及分离：将LB琼脂培养基熔化，制成LB琼脂平板备用；用豆豉或纳豆制取三种不同浓度的菌悬液，再吸取不同浓度的菌悬液分别滴加到三个备用的LB琼脂平板上，在恒温培养箱中37℃恒温培养48h，获得菌种；
b.菌落的挑选与纯化：在上述LB平板上随机挑取单菌落，并在LB平板上划线纯化，获得纯种；
c.高产菌的筛选：将上述纯化的菌种各一环，接入到活化培养基内37℃培养过夜作为活化菌种；再将活化菌种分别接至三种不同的筛选培养基A、筛选培养基B、筛选培养基C内，以37℃，220rpm培养48小时，再用蒸馏水分别稀释后离心去菌体，取上清液加入冰无水乙醇中，并搅拌得沉淀，干燥后得γ-PGA粗品A，称重，比较γ-PGA粗品A的产量，筛选出一株高产菌株；
d.菌种鉴定：对高产菌株采用一般细菌常用鉴定方法进行菌种鉴定，根据个体形态特征、群体形态特征及生理生化特征鉴定出此高产菌株为枯草芽孢杆菌；
(2)发酵工艺：将干大豆洗净后，用蒸馏水浸泡6～10h后装入发酵瓶中，115℃-121℃，蒸汽灭菌30min；然后挑取上述制得的枯草芽孢杆菌菌种一环，接入液体活化培养基内，以37℃，220rpm摇床培养过夜作活化菌种，然后再接此活化菌种放入至少一种以上的不同组份的发酵培养基内，30～40℃，平放培养24～48h；
(3)分离工艺：向发酵瓶中加入两倍体积pH值为3.0～4.0的蒸馏水拌洗，纱布过滤，收集滤液A，所得豆渣再加等体积pH值为3.0～4.0蒸馏水拌洗，纱布过滤，收集滤液B；合并滤液A和滤液B，调pH值至3.0～3.5，9000r/min，20min，吸取上清液，在上清液中加两倍体积95％乙醇搅拌，得沉淀，沉淀用乙醇脱水，脱色后得γ-PGA粗品；
(4)纯化工艺：用蒸馏水溶解所得γ-PGA粗品，使浓度为0.9-1.2％，以12000r/min，20min去除不溶物，再以蒸馏水为透析液反复透析，收集透析袋内液体，加等体积95％乙醇搅拌，得沉淀，真空干燥沉淀后即得γ-PGA纯品。

2、  如权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的制备工艺，其特征在于：所述的LB琼脂培养基的成分为蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l、酵母膏5g/l、琼脂20g/l，pH值为7.0～7.2。

3、  如权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的制备工艺，其特征在于；所述的活化培养基的成分为蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏5g/l。

4、  如权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的制备工艺，其特征在于：所述的筛选培养基A的成分为谷氨酸钠70g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖8g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。

5、  如权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的制备工艺，其特征在于：所述的筛选培养基B的成分为谷氨酸钠20g/L、柠檬酸12g/L、甘油80g/L、NH4Cl 7g/L、K2HPO4·3H2O 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeCl3·6H2O 0.04g/L、CaCl2·2H2O 0.15g/L、MnSO4·5H2O 0.1g/L，筛选培养基B的pH值调为6.5。

6、  如权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的制备工艺，其特征在于：所述的筛选培养基C的成分为果糖75g/L、NH4Cl 18g/L、K2HPO4·3H2O 1.5g/L、MgSO4·7H2O 7.5g/L、MnSO4·5H2O 0.05g/L、CaCO3 30g/L。

7、  如权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的制备工艺，其特征在于：所述的不同组份的发酵培养基，为单纯大豆或大豆与3％谷氨酸钠的结合构成或大豆与3％谷氨酸钠及辅料结合构成。

8、  如权利要求7所述的一种γ-聚谷氨酸的制备工艺，其特征在于：所述的辅料成分为酵母膏1％、NaCl 1％、KH2PO4 0.5％、MgSO40.05％，麦芽糖或葡萄糖5％。

说明书γ-聚谷氨酸的制备工艺
[技术领域]
本发明涉及微生物技术领域，具体的说是一种γ-聚谷氨酸的制备工艺。
[背景技术]
γ-聚谷氨酸(γ-Poly glutamic acid，γ-PGA)是由微生物合成的一种细胞外高分子量聚合物，可生物降解、可食用，对人体和环境无毒，γ-PGA分子链上具有较高活性的羧基(-COOH)，可与一些药物结合生成较稳定的复合物，在体内可被溶酶体降解为内源性谷氨酸，并释放出药物，是一种理想的药物载体，此外，它还具有水溶性、可生物降解、可食用、吸水性强、对人体和环境无毒害作用等特性，因而被广泛应用于食品、化妆品、水处理、农业医药等方面。如增稠剂、保湿剂、苦味掩盖剂、低温保护剂、缓释材料、药物载体、生物粘合剂、可生物降解纤维、吸水剂、絮凝剂以及动物食品添加剂。
目前主要通过液体发酵技术来获得γ-PGA，但液体发酵生产成本过高，因此难以实现大规模应用。为此，有人利用大豆发酵进行固体发酵，以期降低生产成本，但其产量有待进一步提高。
[发明内容]
本发明的目的就是克服现有技术的不足，在固体发酵培养基内适当添加补充剂，以提高γ-PGA产量，而发明的一种γ-聚谷氨酸的制备工艺。
为实现上述目的，设计一种γ-聚谷氨酸的制备工艺，其工艺步骤为：(1)获取高产菌种工艺：菌种获取及分离：将LB琼脂培养基熔化，制成LB琼脂平板备用；用豆豉或纳豆制取三种不同浓度的菌悬液，再吸取不同浓度的菌悬液分别滴加到三个备用的LB琼脂平板上，在恒温培养箱中37℃恒温培养48h，获得菌种；菌落的挑选与纯化：在上述LB平板上随机挑取单菌落，并在LB平板上划线纯化，获得纯种；高产菌的筛选：将上述纯化的菌种各一环，接入到活化培养基内37℃培养过夜作为活化菌种；再将活化菌种分别接至三种不同的筛选培养基A、筛选培养基B、筛选培养基C内，以37℃，220rpm培养48小时，再用蒸馏水分别稀释后离心去菌体，取上清液加入冰无水乙醇中，并搅拌得沉淀，干燥后得γ-PGA粗品A，称重，比较γ-PGA粗品A的产量，筛选出一株高产菌株；菌种鉴定：对高产菌株采用一般细菌常用鉴定方法进行菌种鉴定，根据个体形态特征、群体形态特征及生理生化特征鉴定出此高产菌株为枯草芽孢杆菌；(2)发酵工艺：将干大豆洗净后，用蒸馏水浸泡6～10h后装入发酵瓶中，115℃-121℃，蒸汽灭菌30min；然后挑取上述制得的枯草芽孢杆菌菌种一环，接入液体活化培养基内，以37℃，220rpm摇床培养过夜作活化菌种，然后再接此活化菌种放入至少一种以上的不同组份的发酵培养基内，30～40℃，平放培养24～48h；(3)分离工艺：向发酵瓶中加入两倍体积pH值为3.0～4.0的蒸馏水拌洗，纱布过滤，收集滤液A，所得豆渣再加等体积pH值为3.0～4.0蒸馏水拌洗，纱布过滤，收集滤液B；合并滤液A和滤液B，调pH值至3.0～3.5，9000r/min，20min，吸取上清液，在上清液中加两倍体积95％乙醇搅拌，得沉淀，沉淀用乙醇脱水，脱色后得γ-PGA粗品；(4)纯化工艺：用蒸馏水溶解所得γ-PGA粗品，使浓度为0.9-1.2％，以12000r/min，20min去除不溶物，再以蒸馏水为透析液反复透析，收集透析袋内液体，加等体积95％乙醇搅拌，得沉淀，真空干燥沉淀后即得γ-PGA纯品。所述的LB琼脂培养基的成分为蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l、酵母膏5g/l、琼脂20g/l，pH值为7.0～7.2。所述的活化培养基的成分为蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏5g/l。所述的筛选培养基A的成分为谷氨酸钠70g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖8g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。所述的筛选培养基B的成分为谷氨酸钠20g/L、柠檬酸12g/L、甘油80g/L、NH4Cl 7g/L、K2HPO4·3H2O 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeCl3·6H2O 0.04g/L、CaCl2·2H2O 0.15g/L、MnSO4·5H2O0.1g/L，筛选培养基B的pH值调为6.5。所述的筛选培养基C的成分为果糖75g/L、NH4Cl 18g/L、K2HPO4·3H2O 1.5g/L、MgSO4·7H2O7.5g/L、MnSO4·5H2O 0.05g/L、CaCO3 30g/L。所述的不同组份的发酵培养基，为单纯大豆或大豆与3％谷氨酸钠的结合构成或大豆与3％谷氨酸钠及辅料结合构成。所述的辅料成分为酵母膏1％、NaCl1％、KH2PO4 0.5％、MgSO4 0.05％，麦芽糖或葡萄糖5％。
本发明与现有技术相比，采用了固体发酵降低了生产成本，且使用该工艺发酵时间短、提高了γ-PGA的产量、能耗少、操作简便。
[附图说明]
图1是本发明制备的γ-PGA样品的1H-NMR谱图。
图2是本发明制备的γ-PGA样品的13C-NMR谱图。
图3是本发明制备的γ-PGA样品与γ-PGA标准品的红外谱图。
[具体实施例]
下面结合附图对本发明作进一步的说明，本发明对本专业技术领域的人来说还是比较清楚的。
实施例
一、获取菌种工艺：
将成分为：蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏5g/l，琼脂20g/l，pH值为7.0～7.2的LB琼脂培养基加热熔化后，以每皿20ml左右倒平板制得LB琼脂平板备用，然后从市售的豆制品，如豆豉、纳豆等随机购买作为菌种来源，称取上述购买的豆豉、纳豆样品10g，放入含有40ml无菌生理盐水的三角烧瓶中，摇床振荡30min，取出三角烧瓶加热至沸腾并维持30min，以杀死不产芽孢的细菌，静置10min，吸取上清液0.5ml加入含有4.5ml无菌生理盐水的试管中，制成1∶100，即10-2浓度的菌悬液，再以此法制成10-3、10-4浓度的菌悬液，然后分别吸取10-2、10-3和10-4的菌悬液各0.1ml滴加到上述制备的LB琼脂平板上，用三角推棒涂布均匀，将培养皿倒置恒温培养箱中37℃恒温培养48h；将上述培养48h后的LB琼脂平板上随机挑取100个单菌落，并在此平板上划线纯化，获得纯种待筛选γ-PGA产生菌菌种。
取上述纯化得到的待筛选γ-PGA产生菌菌种各一环，接入到成分为：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母膏5g/L的活化培养基内，37℃培养过夜，作活化菌种；
然后取上述活化菌种分别接至如下三种筛选培养基内，以37℃，220rpm，培养48小时。
单位为g/L的筛选培养基A的组成：谷氨酸钠70，酵母膏5，葡萄糖8，NaCl 10，KH2PO4 5，MgSO4·7H2O 0.5。
单位为g/L的筛选培养基B的组成：谷氨酸钠20，柠檬酸12，甘油80，NH4Cl 7，K2HPO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeCl3·6H2O 0.04，CaCl2·2H2O 0.15，MnSO4·5H2O0.1(调PH6.5)。
单位为g/L的筛选培养基B的组成：果糖75、NH4Cl 18、K2HPO4·3H2O1.5、MgSO4·7H2O 7.5、MnSO4·5H2O 0.05、CaCO3 30。
然后在上述发酵液中加蒸馏水稀释4倍，12000r/min、15min离心去菌体，上清液加入3倍体积冰无水乙醇中搅拌得沉淀，干燥得γ-PGA粗品A，称重，测定γ-PGA粗品A的产量，结果表明其中共有20株菌种能产γ-PGA，且有一菌株产量最高，可达20g/l，将该菌株命名为EBM-1。
按《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版(Holt，J.G.，N.R.Krieg.P.H.A.Snerath et al.1994.Williams&Wilkins.Baltimoce.Maryland，USA.)及《一般细菌常用鉴定方法》(中国科学院微生物研究所细菌分类组编著，北京-科学出版社1978.11)相关项目所述方法对筛选出的EBM-1菌株进行进行菌种鉴定所得结果如下：
①个体形态特征
在LB琼脂板上培养的营养细胞大小为0.6～0.9um×1.5～2.0um，菌体形状为杆状，37℃培养1～2天形成芽孢，芽孢中等大小，孢子囊不膨大，革兰氏染色呈阳性。
②群体形态特征
在LB琼脂平板上37℃培养1～2天，菌落为圆形或形状不规则，边缘不光滑，锯齿状，无光泽，不透明，白色。
③生理生化特征
EBM-1菌株生理生化特征如下：  试验项目  结果  试验项目  结果  运动性  过氧化氢酶  需氧性  VP反应  VP培养液生长后pH值  生长温度  卵磷脂酶  0.001％溶菌酶中生长  抗叠氮化钠(0.02％)  NaCl中生长(7.0％)  木糖产酸/气  葡萄糖产酸/气  麦芽糖产酸/气  甘露醇产酸/气   +  +  +  +  6.5  5℃-50℃    +  +  +  +  +/-  +/-  +/-  +/-   鼠李糖产酸/气  蔗糖糖产酸/气  乳糖产酸/气  D-半乳糖产酸/气  阿拉伯糖产酸/气  淀粉水解  柠檬酸盐利用  还原NO3-至NO2-  酪素水解  酪氨酸水解  苯丙氨酸水解  马尿酸盐水解  形成吲哚  形成二羟丙酮  石蕊、牛奶  -/-  +/-  -/-  +/-  -/-  +  -  +  +  -  -  -  -  +  胨化、还原、产酸
根据以上形态和生理生化特征并与枯草芽孢杆菌模式种的特征进行比对，即可将EBM-1菌株鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
二、发酵工艺：
将干大豆洗净，用适量蒸馏水浸泡6～10h，装入茄子瓶，每瓶装40g干大豆，115℃-121℃蒸气灭菌30分钟，用接种针从斜面挑取筛选出的产γ-PGA产量最高的枯草芽孢杆菌菌种一环，接入20ml成分为：蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏5g/l的液体活化培养基内，37℃，220rpm摇床培养过夜作活化菌种，然后接此活化菌种1～2ml至不同成分的发酵培养基内，以30～40℃平放培养24～48h，进行发酵。
三、分离工艺：
发酵结束后，向上述发酵瓶中加入两倍体积pH3.0～4.0蒸馏水拌洗，四层纱布过滤，收集滤液；豆渣再加等体积pH3.0～4.0蒸馏水拌洗，四层纱布过滤，收集滤液；合并所得滤液，调pH至3.0～3.5，9000r/min，20min，吸上清；上清液加两倍体积95％乙醇搅拌，得沉淀；沉淀用少量乙醇脱水、脱色，即得γ-PGA粗品。
如上述发酵工艺中的发酵培养基成分为：单纯大豆，产量为每100g干大豆产2.08g的γ-PGA粗品。
如发酵培养基成分为：大豆、3％谷氨酸钠，则产量为100g干大豆得3.0g的γ-PGA粗品。
如发酵培养基成分为：大豆、3％谷氨酸钠及成分为麦芽糖或葡萄糖5％，酵母膏1％，NaCl 1％，KH2PO4 0.5％，MgSO4 0.05％的辅料，则产量为每100g干大豆得6.3g的γ-PGA粗品。
如发酵培养基成分为：大豆、1.5％谷氨酸钠及1/2辅料，辅料成分：麦芽糖或葡萄糖5％，酵母膏1％，NaCl 1％，KH2PO4 0.5％，MgSO4 0.05％，则产量为每100g干大豆得4.8g的γ-PGA粗品。
四、纯化工艺：
用蒸馏水溶解上述得到的γ-PGA粗品，浓度约1％，12000r/min，20min去不溶物，以蒸馏水为透析液反复透析，收集透析袋内液体，加等体积95％乙醇搅拌，得沉淀，真空干燥沉淀，即得γ-PGA纯品。
参见图1、图2为采用AVANCE 500MHZ核磁共振仪测定本发明制备的γ-PGA纯品，参见图3为采用Nexus 670傅立叶红外光谱仪测定Sigma公司γ-PGA标准品及本发明制备的上述γ-PGA纯品。
其中图3的上方为Sigma公司γ-PGA标准品谱图，下方为本发明制备的纯化后γ-PGA样品图谱，比较谱图可发现二者所有特征峰均相吻合，表明发酵产物结构与标准品一致；图1、图2各谱峰归属见图上标注，结合氢谱、碳谱可断定发酵产物结构式为：与γ-PGA结构一致。