优选实施方案的详述
以下所述中，广泛使用许多医学和蛋白领域所用的术语。为对说明
书和权力要求书提供清晰一致的理解，包括这些术语所赋范围，提供以
下的定义。
“患者”指需要兽医或医学治疗的，尤其是需要用本发明的组合物
治疗的动物或人个体。
“治疗”或“医治”指为了可能包括预防，改善，防止或治疗病症
或对该药剂敏感的潜在病症的目的，给药包括本文所述的一或多种肽的
有效量的组合物至需要的患者。
“给药”指运用任何适当方法，对患者给药期望的物质。有益的给
药方法包括，但不仅限于，肠胃外的(例如，静脉内)，肌肉内，皮下，
离子渗透，口服，直肠和肠内给药。
“有效量”指足以达到所述期望结果的量。本发明的肽的有效量是
足以减少或阻止或预防包含α2I区的整合蛋白与一或多个靶的功能性相
互作用程度的量，其中靶在不存在本发明的肽时与整合蛋白相互作用。
“药用盐”指由药物可接受的酸或碱形成的盐，如，但不仅限于，
酸如硫酸，盐酸，硝酸，磷酸等，或碱如碱或碱土金属氢氧化物，氢氧
化铵，烷基氢氧化铵，等。
术语“药用赋形剂”指包括溶剂，载体，稀释液等，它们被用作本
发明制剂的添加物以提供用于给药这些化合物的载体或佐剂。
当使用人整合蛋白时，常提出以下讨论和例证，本发明的肽和方法
可用于任何对jarahagin是毒液的活性成分的蛇咬敏感的种类，因该活
性是本发明的肽与此种类的靶整合蛋白结合能力的证据。因此，在这方
面发明不限于以下使用人实施方案的讨论和例证。
整合蛋白对胶原的识别类似于整合蛋白-纤连蛋白的结合。不仅胶
原-结合αI区和RGD-结合推测的βI区具有结构类似性，而且环状RGD
肽也能与α2β1整合蛋白结合。被认为对整合蛋白与胶原结合非常重要
的三个胶原氨基酸残基包括两个天冬氨酸和一个精氨酸。
发明者推测jararhagin中阻止rα2I区与胶原结合的基元一定包
括天冬氨酸或精氨酸残基，且此作用的关键基元在亲水环中，因为在基
质分子或蛇毒液脱整合蛋白中的已知的整合蛋白识别位点处于亲水环
中。发明者对满足这些标准的jararhagin结构中的以往未知序列进行
了检索，并制备合成肽以用于使用整合蛋白rα2I区的固相结合分析中
的检测。
发现一种衍生自金属蛋白酶区CTRKKHDNAQC(SEQ ID No.5)的肽
与rα2I区强结合，该其中肽为，包含jararhagin的金属蛋白酶区氨
基酸241-249(任一末端的末端半胱氨酸被加至天然序列)。以下事实表
明高结合亲和性，即当铕标记的rα2I(重组α2I)粘附至该肽时，在
随后2小时中未测得解吸作用，即使分析中加入过量10倍的未标记rα
2I区。
所测肽中，这种肽也是唯一抑制rα2I区与I型和IV型胶原和层粘
连蛋白的肽。进一步，此肽与巴西具窍蝮蛇毒液竞争结合rα2I区。因
此，发明者得出结论：对应于以上氨基酸241-249的氨基酸序列的存在
是为什么jararhagin与α2β1整合蛋白相互作用的原因。
对肽序列的突变分析揭示了一个新整合蛋白结合基元，RKK或RKKH
(SEQ ID No.8)。组氨酸，RKKH序列中的第四氨基酸，也可能对整个
功能至关重要。出乎意料地，肽序列中的天冬氨酸的突变不产生作用。
已知的α2β1整合蛋白的基质分子配体不包含RKK(H)序列。
以上发现的新rα2I区结合基元，或包含它的肽可防止基质蛋白识
别。除此解释外，该作用被认为是通过与I区配体结合位点直接相互作
用或在I区构像造成变异从而掩盖配体识别位点而发生。此肽-依赖性
rα2I区构象的改变在实验中很明显，说明伴随对胶原结合的阻断，该
肽诱导rα2I区对艾可病毒-1的附着。这也说明占据配体识别位点可调
节其它位点的亲和性。
因此，本发明的每个新的整合蛋白结合蛋白包括一个三个氨基酸的
共线性序列，精氨酸-赖氨酸-赖氨酸(RKK)，当肽为环状时，赋予肽整
合蛋白结合活性。RKK序列基元的一个，两个，三个或多个拷贝可存在
于肽序列中，这些拷贝足为肽提供减少整合蛋白与胶原相互作用的能
力。
第一个实施方案中，本发明的肽是包含氨基酸序列X1RKKX2X3X4X5X6
(SEQ ID NO.1)的环肽，其中每个X为一个氨基酸，氨基酸X1-X6为
任意氨基酸(尤其A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，
S，T，W，Y或V)但优选X2为组氨酸(H)。
在进一步的实施方案中，本发明的肽是包含氨基酸序列X1RKKX2X3X4X5
(SEQ ID NO.2)的环肽，其中氨基酸X1-X5如上为任意氨基酸，但优
选X2为组氨酸(H)。
在进一步的实施方案中，本发明的肽是包含氨基酸序列X1PKKX2X3X4
(SEQ ID NO.3)的环肽，其中氨基酸X1-X4如上为任意氨基酸，但优
选X2为组氨酸(H)。
在高度优选的实施方案中，本发明的肽是具氨基酸序列CTRKKHDNC
(SEQ ID NO.4)的环肽或具氨基酸序列CTRKKHDNAQC(SEQ ID NO.5)
的环肽，并优选两个末端半胱氨酸残基参与使肽成环状结构的二硫键形
成中。
本发明的环肽可缺失上述的一至多个氨基酸X，尤其一或多个C，T，
H，D，N，A或Q。进一步的，本发明的环肽可包含插入至上述序列和/
或位于上述序列旁侧的其它氨基酸，只要RKK基元保持共线性，使得这
些肽保持与α2整合蛋白结合的能力。
末端半胱氨酸残基仅需以导致肽环化的方式定位。优选的，半胱氨
酸被置于肽的末端，以致二硫键的形成导致适当大小的环，从而赋予肽
的环状形式以生物学活性。但是，一或两个半胱氨酸残基可能在肽内部，
而非末端，任何延伸超过半胱氨酸的“尾”可能不产生问题，只要它不
导致丧失剩余肽的环状形式。从此看来，只要肽的环状形式不被阻碍，
其为允许它为保持生物活性的构象时，则不同的部分，例如蛋白如白蛋
白，可用作连接子，间隔区，或与环状肽的末端相接，从而使本发明的
环状肽连接于上固体载体，或其它所需部分，例如，可检测标记。
当半胱氨酸位于肽的末端，肽优选在半胱氨酸之间包括9个氨基酸。
8个氨基酸不增强活性，并因此也可用于这方面。在末端半胱氨酸之间
有7个氨基酸的环肽比有7或8个氨基酸的那些有效约20倍，因此尤
其是优选的。总的看来，在末端半胱氨酸之间包含10个或更多氨基酸
的肽具有作用更像(无功能的)线性分子而非环状分子的危险。在末端
半胱氨酸之间包含5或更少氨基酸的环肽如果不是不可能的，也极难制
备。因此，在末端半胱氨酸之间包含7个氨基酸的环肽为最优选的实施
方案。
本发明的肽序列包括上述肽的变异体，这些变异体具有不重要差异
的氨基酸取代，例，一个碱性氨基酸取代另一个(除在RKK基元中)，
一个疏水残基取代另一个，一个中性残基取代另一个，一个酸性残基取
代另一个，一个芳香残基取代另一个。
在优选的实施方案中，肽的环状形式由二硫键产生。但是，任何导
致肽的环状形式的共价键都被认为有用，因桥的功能仅使肽处于适当的
构象。
如本领域所知，使用适当的氨基或羧基保护基团，氨基酸残基可为
保护的或非保护形式。可用的药物可接受的阳离子包括碱或碱土金属阳
离子(例，Na，K，Li，1/2Ca，1/2Ba，等)或氨基阳离子(例四烷基铵，
三烷基铵，其中每个烷基集团可为C1-C12，但优选C1-C6支链或直链烷
基基团)。也可制备药物可接受的低级烷基酯，药物可接受的氨化物和
药物可接受的酸加成盐。
可使用本领域熟知的方法，例如在此收入参考文献的U.S.5,627,
263，中所述的合成并环化本发明的肽。
根据本发明的环状整合蛋白结合肽可用作整合蛋白功能，尤其人整
合蛋白功能的阻断剂(抑制剂)。整合蛋白与其天然配体的结合在本发
明的肽存在时被抑制或阻断。尤其，环状整合蛋白结合肽可用于阻断整
合蛋白α2I区与和该区相互作用的大分子的相互作用，例如，与胶原如
胶原I和胶原IV和层粘连蛋白的相互作用。
人重组α2I区的序列提供在Takada，Y.和M.E.Hemler，细胞生
物学杂志.109：397-407(1989)(在此收入参考文献)。α2I区可用普
通重组宿主，例如，大肠杆菌来制备。其特性可用基于铕标记的rα2I
区的敏感固相分析和时间分辨荧光测定来表征。该分析使得能在无酶存
在或无与之相连的其它大分子时直接测定rα2I区的结合。
本发明肽的α2整合蛋白结合能力可通过任何检测该结合，尤其是
检测该结合阻断整合蛋白与胶原I和胶原IV或层粘连蛋白-1的相互作
用的能力的分析法来确定。如下例证，运用铕标记的重组α2I区结合分
析(实施例2)和检测α2I区的病毒-1识别位点的活化的分析可用于此
方面(实施例2)。
本发明的肽尤其可用于抑制或阻止体内或体外细胞在胶原的迁移。
本发明的肽阻断细胞迁移的能力可用如实施例7所提供的细胞迁移分析
来确定。因此，当该迁移以整合蛋白-依赖性方式介导时，本发明提供
在体外和体内在需要治疗以抑制细胞迁移的患者中抑制细胞在胶原上迁
移的方法。本发明因而提供治疗疾病，包括齿根骨膜炎的治疗方法，其
中细胞迁移为部分致病机制。
本发明进一步提供抑制恶性细胞迁移，并因此用于治疗有此特征的
疾病的方法，其中疾病例如为癌症，包括骨肉瘤和黑素瘤，尤其是其中
α2β1整合蛋白依赖的细胞迁移可能导致恶性机制的疾病。
本发明进一步提供一种，抑制血小板对胶原的粘附和胶原诱导的血
小板聚集的方法。本发明的肽抑制细胞粘附的能力可如实施例8提供的
方法来确定。因此，本发明提供一种，治疗需预防或改善治疗疾病或病
症的方法，其中疾病或病症如为心脏血管病，其特征在于需防止血小板
对胶原的粘附和胶原诱导的血小板聚集，例如中风者或有中风危险的患
者。
包含本发明的肽的药物制备可尤其包含为用于稳定和有效配制肽的
药物可接受载体。合适的赋形剂和它们包括其它人蛋白的制剂，例如人
血清白蛋白，描述在Remington’s药物科学(18版，A.R.Gennaro编，
Mack出版，Easton，PA1990)。为了制备适用于对需要该组合物的病人
给药有效量的本发明的肽的药物可接受的组合物，此组合物包含有效量
的本发明的一或多种肽以及如所需的适量的载体赋形剂。
本发明的肽优选被纯化为基本上不含污染物。在细胞中或在体外系
统如果基本上从合成时相关的非期望物质中纯化，而达到足以使其可用
于所希望的目的的程度，则该物质被称为“基本上不含污染物”。
可用于本发明的方法的组合物可包含一种或多种本发明的肽。当组
合物中有不止一种肽时，它可能是与另一肽相同氨基酸链的一部分，或
在组合物中以单独的肽存在。用于静脉内，肌肉内或皮下给药的组合物
优选给药剂量在约1pg/kg体重至1mg/kg体重范围内，尽管可给药更高
或更低的剂量。所需剂量依赖于患者疾病的严重性，例如患者体重，性
别，年龄，和医疗史等标准。剂量也依赖于它是否以兽医学方式给药至
动物或是给药至病人。
对于肠胃外给药的目的，包含本发明的肽的组合物优选溶解在蒸馏
水中，pH优选调整到6-8。如果肽为冻干的形式，可加乳糖至溶液中以
易于冻干过程在为这种形式时将溶液灭菌，装入小瓶中，冻干。
肠胃外给药的本发明组合物的有效制剂还包括无菌水和非-水溶
剂，悬浮液和乳状液。有用的非水溶剂的实例包括丙二醇，聚乙二醇，
植物油，鱼油和可注射有机酯。含水载体的实例包括水，水-乙醇溶液，
乳状液或悬浮液，包括盐和缓冲的医学肠胃外载体，包括氯化钠溶液，
林格葡萄糖溶液，葡萄糖加氯化钠溶液，含乳糖的林格溶液，或不挥发
性油。静脉内赋形剂的实例包括流体营养补充物，电解液补充物，如基
于林格葡萄糖的那些等。
可注射制剂，如油质溶液剂，悬浮剂或乳状剂，可根据已知技术，
按需要用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。当活性化合物为水溶
性形式时，如，为水溶性盐的形式，则无菌的可注射制剂可采用无毒的
胃肠外可接受的稀释液或溶剂，例，无菌的非致热原水或1，3-丁二醇。
可使用的其它可接受的载体和溶剂为5％葡萄糖注射液，林格注射液和等
渗的氯化钠注射液(如在USP/NF中所述)。当活性化合物以非水溶性形
式存在，使用无菌的适当的油状悬浮液，该油状悬浮液包含合适的亲脂
性溶剂或载体，如脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪油脂，例如油酸乙
酯或甘油三酯。另外，也可采用水性注射悬浮液，其包含增加粘性的物
质，例如羧甲基纤维素钠，山梨醇，和/或葡聚糖，并任选还可包含稳
定剂。
为了离子电渗传递本发明的肽，肽优选pH为约4.0或更低，或
约7.0或更高。离子等渗的方法广为人知，例如描述在被本文引作参考
的在U.S.5,637,084和U.S.4,950,229中。
用于口服(但全身性的)的药物制剂可通过将活性化合物与固体赋
形剂混合而获得，如需要或必需，在加入合适的辅剂后任选研磨得到粒
状混合物并加工混合物或颗粒以制成糖衣锭核心的片剂。治疗齿根骨膜
炎的药物制剂可以保留在口腔中的组合物形式给药，优选将制剂直接放
入牙周腔，最优选为持续释放形式。也可将制剂刷在牙齿和/或牙龈上
以在所需部位释放肽。这些教导提供在被本文引作参考的U.S.5,002,
769，U.S.5,023,082，U.S.5,160,737，U.S.5,330,746，U.S.5,
425,953，U.S.5,438,076和U.S.5,639,795。制剂也可在膜上提
供。
合适的赋形剂尤其为填充物如糖，例乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨糖
醇，纤维素制剂和/或磷酸钙，例三磷酸钙或磷酸氢钙，以及粘合剂，
如淀粉，糊，使用如玉米淀粉，小麦淀粉，米淀粉，或土豆淀粉，明胶，
黄芪胶，甲基纤维素，羟基丙基甲基纤维素，羧甲基钠纤维素，和/或
聚乙烯吡咯烷酮，和/或，如需要，分散剂，如上所述的淀粉，还有羧
甲基淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或藻酸或其盐，如藻酸钠。辅剂
总的为流动调节剂和润滑剂，例如二氧化硅，滑石粉，硬脂酸或其盐，
如硬脂酸镁，硬脂酸钙，如需要合适的外壳，此壳可抗胃液，以及为了
此目的，尤其是浓缩糖溶液，糖溶液可任选包含阿拉伯树胶，滑石粉，
聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化钛，紫胶漆溶液和合适的有机
溶剂或溶剂混合物。为了制备抗胃液的外壳，使用适宜的纤维素制剂溶
液，如乙酰纤维素邻苯二甲酸盐或羟基丙基甲基纤维素邻苯二甲酸盐。
例如为鉴定或为了表征活性化合物剂量的不同组合，可加染料或颜料至
片剂或糖衣丸外衣中。
口服给药的固体剂型包括胶囊剂，片剂，丸剂，片剂，锭剂干粉
剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释
剂混合，如蔗糖，乳糖或淀粉。这些剂型在正常情况下还可包含药物辅
助物质，如，硬脂酸润滑剂。固体口服制剂也可用肠衣或其它调节活性
组份释放的外壳制备。
用于口服给药的液体剂型包括包含本领域普遍应用的惰性无毒稀释
剂，如水和酒精的药物可接受的乳剂，溶液剂，悬浮液剂，糖浆和驰剂。
这些组合物也可包含辅剂，如湿润剂，乳化剂，悬浮剂，增甜剂，增味
剂和香料剂。
本发明的组合物也可通过泵，或以持久释放的形式给药。本发明的
组合物也可以通过适当插入的导管高浓度传送到特定器官，或通过以被
设计靶定特定器官的嵌合分子(或复合物)的一部分的形式来提供这些
分子。在这点上，上面的肽可在较长肽的末端形成环状的“环”，这些
肽具有拥有期待活性的第二区。这些融合蛋白可被设计来提供一段帮助
杀伤细胞的区，此细胞含有与本发明的环肽结合的膜结合的整合蛋白。
当指定延长时间的重复注射以使患者享有最大限度的舒适时，持续
释放形式的给药对患者更为方便，可通过使用聚合物以复合成吸附本发
明的肽来制备控制释放制剂。通过选择适当的大分子(例如聚酯，多聚
氨基酸，聚乙烯吡咯烷酮，乙烯乙烯基乙酸盐，甲基纤维素，鱼精蛋白
锌羧甲基纤维素和鱼精蛋白硫酸盐)及掺入方法以控制释放来进行受控
的送递。通过控制释放制剂的另一种可能的控制作用期的方法是掺入期
待的肽到聚合物，如聚酯，多聚氨基酸，水凝胶，聚(乳酸)或乙烯乙
烯基乙酸盐共聚物的颗粒中。另一方面，代替将肽掺入这些聚合物颗粒
中，可将肽包裹到微粒中，其中该微粒通过，例如通过凝聚技术或界面
聚合制备，例如分别为羟甲基纤维素或凝胶微囊素和聚(异丁烯酸甲酯)
微胶囊，或包裹在胶质的药物传递系统中，例如在脂质体，白蛋白微球
体，微滴乳状液，毫微颗粒，和毫微胶囊或在大分子乳浊液中。
本发明的肽的生物学半衰期可通过增加所需环境中环状形式的保留
或稳定性而延长。尤其是提高环状形式的稳定性的试剂可望延长肽的生
物学半衰期。在这点上，在肽结构中运用一或多个D-氨基酸(尤其是取
代原位点的相同L-氨基酸)，或使用一种或多种氨基酸类似物，如可在
肽结构中插入青霉胺(3-巯基缬氨酸)，为样D-氨基酸或氨基酸类似物
干扰被给药该组合物的动物或患者中的或所需的体外组合物中的环状结
构代谢分解。
还设想了运用D-氨基酸或氨基酸类似物增加本发明的肽与靶的结
合，尤其与含α2I区的整合蛋白的结合。
用于本发明组合物和方法的肽可以如下剂型使用，如片剂，胶囊剂，
粉末包装剂，或口服给药的液体溶液剂，如果物质的生物学活性不被消
化过程破坏，且化合物的特性容许穿过肠内组织吸收。
本发明的药学组合物可以本身已知的例如常规的混合，颗粒化，制
造糖衣丸，溶解，冻干或类似过程生产。
本发明的肽还可用作提取与之结合的配体的亲和试剂，尤其是从混
合物中提取含α2I区的整合蛋白。
现已充分描述了本发明，参考以说明方式提供的实例将更容易理解
本发明，且除非特别说明本发明不限于实施例。
实施例
实施例1
人重组整合蛋白α2I区的产生
编码的α2I区的DNA通过PCR，使用人整合蛋白α2 cDNA为模板
来制备。(整合蛋白α2 cDNA由M.Hemler博士赠送，DanaFarber，波
士顿)。正向引物是5’-CACAGGGATCCCCTGATTTTCAGCTC-3’(SEQ ID
No.9)，反向引物是5’-GTGGCTGAATTCAACAGTACCTTCAATG-3’(SEQ ID
No.10)。设计引物以在产物中引入两个限制性位点：5’端的BamHI-位点
和3’端的EcoRI-位点。PCR产物和pGEX2T(Pharmacia)用BamHI和EcoRI
消化，连接并转化至大肠杆菌DHα5F’细胞接着测序。具α2I区插入物
的质粒(pJKα2I)，转化至大肠杆菌BL2I以制备重组蛋白rα2I。谷
胱甘肽S-转移酶-rα2I融合蛋白的制备和纯化如下进行：通常将400ml
LB(羧苄青霉素50μg/ml)用40ml BL2I/pJKα2I的过夜培养物接种，
培养物37℃生长1小时。加入诱导物IPTG(终浓度0.1mM)4小时。
人重组整合蛋白α2I如下从大肠杆菌细胞中纯化。离心收获细胞，
沉淀重悬在磷酸缓冲液中(PBS，pH7.4)。悬浮液超声，离心，收获上
清。沉淀在PBS中重悬，超声，并离心两次，收集上清。加入谷胱甘肽
Sepharose(Pharmacia)，得到的溶解产物室温下孵育30分钟，轻柔
搅动。溶解产物离心，移去上清部分，与融合蛋白结合的谷胱甘肽
Sepharose转移至合适的柱上。用10体积PBS(140mM NaCl，2.7mMKCl，
10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，pH7.3)洗涤，谷胱甘肽洗脱缓冲液
(Pharmacia；10mM降低的谷胱甘肽的50mM Tris-HCl溶液，pH8.0)洗
脱融合蛋白室温下，用凝血酶蛋白酶(Pharmacia；10单位)裂解融合蛋
白至少2小时，PBS透析去除谷胱甘肽。裂解混合物第二次通过谷胱甘
肽的50mM Tris-HCl中柱以去除谷胱甘肽S-转移酶。
从流过液中收集rα2I。必须用5mM二硫苏糖醇(DTT)处理重组
蛋白以允许适当的折叠(5mM DTT的PBS溶液)，因为通过天然PAGE分
析时，不经处理可见额外的带。重组蛋白经SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝焦
电泳)为至少90％的纯度，天然PAGE仅见一条带。
制备的重组α2I区长223个氨基酸，在对应于整合蛋白序列124-339
(PDGQ-IEGTV)(SEQ ID No.11和SEQ ID No.12)的氨基末端(GS)
整合蛋白氨基酸中具有2个非整合蛋白氨基酸，在羧基末端具6个非整
合蛋白氨基酸(EFIVTD；SEQ ID No.13)。
实施例2
铕标记的rα2I的结合分析
巴西具窍蝮蛇凹蝰蛇毒液阻止重组整合蛋白α2I区与I型胶原的结
合
开发了基于使用铕标记的rα2I的敏感的固相rα2I配体结合分
析。铕标记rα2I如下进行：纯化rα2I中加入1/20体积1M NaHCO3(pH
8.5)以提高pH用于用异硫氰酸酯标记。铕标记的试剂(Wallac)以过
量100倍的摩尔数加入，4℃孵育过夜。未结合的标记物通过葡聚糖凝
胶G50/琼脂糖凝胶6B(Pharmacia)柱凝胶过滤去除，收集含标记蛋白
的部分。
4℃下，通过将其各孔表面暴露于0.1ml PBS中12小时来覆盖96
孔免疫板(Maxisorp，Nunc)，其中PBS中包含5μg/cm2平板表面的I
型胶原。(牛皮，Cellon)，IV型胶原(Sigma)，层粘连蛋白-1(从
Engelbreth-Holm-Swarm鼠肿瘤基底膜纯化，Collaborative
Research)，纤连蛋白(人血浆纤连蛋白，Boehringer Mannheim)或3.3
μg/ml艾可病毒-1或艾可病毒-7。另外，根据制造商的说明，将肽和
巴西具窍蝮蛇毒液(Sigma)以各种浓度在96孔胺结合平板(Costar)
中。
所有孔的残余蛋白吸收位点用含0.1％热灭活的牛血清白蛋白的PBS
溶液在37℃封闭1小时。艾可病毒-1(Farouk菌)和艾可病毒-7
(Wallace)从ATCC获得。纯化的病毒在含0.5mM MgCl2的PBS稀释，
-70℃冻存直至使用。向被覆盖的孔中加入在PBS中浓度为500ng/ml
铕标记的rα2I，2mM MgCl2，1mg/ml BSA，37℃孵育3小时。将孔用
PBS，2mM MgCl2洗三次，将0.1ml Delfia增强溶液(Wallac)加入
每孔，荧光计(Model 1232 Delfia，Wallac)测定铕信号。
当内源加入肽时，冻干的肽直接溶解至铕标记的rα2I的PBS溶液
中，随后加入2mM MgCl2，1mg/ml BSA并接着加入各孔中。当使用EDTA
替代MgCl2时，铕标记的rα2I稀释在PBS，2mM EDTA中，并以此缓冲
液进行随后的冲洗。发现结合分析十分敏感，使得有可能在实验中减少
rα2I区的用量。进一步的，铕的小体积说明此测量比用较大的标记分
子更可靠。第三，发现此处所述的微量滴定孔分析可用于筛选大量的推
测的整合蛋白rα2I区阻断分子。
rα2I结合I型胶原，IV型胶原和层粘连蛋白-1。但是，它并不显
著地与纤连蛋白或白蛋白结合(图1A)。rα2I以Mg++依赖方式结合I
型胶原，添加2mM EDTA可完全解除结合(图1B)。这与α2β1仅在二
价阳离子存在下与胶原相互作用的事实相符合。rα2I区与艾可病毒-1
的结合比其与基质分子的结合弱得多。
以往研究显示，巴西具窍蝮蛇毒液抑制血小板α2β1整合蛋白与胶
原的相互作用(De Luca，M.等，生物化学生物物理研究通讯.206：570-
576(1995))。但是，此抑制反应是否由于对α2I区功能的阻抑仍然不
详。而且，参与相互作用的抗原决定簇仍然未知。
巴西具窍蝮蛇毒液对rα2I区与I型胶原结合的作用通过上述的固
相配体结合分析研究。让铕标记的rα2I区在2mM Mg++存在时与胶原I
底物接触，确定结合的rα2I的量。毒液的作用在1μg/ml-1000μg/ml
浓度范围内检测。毒液有效并以浓度依赖方式抑制rα2I区-胶原相互
作用(图1C)。为确定所见的抑制现象是否是由于rα2I与蛇毒液直接
作用，将微量滴定孔用毒液蛋白覆盖并检测rα2I与此底物的结合。发
现rα2I以浓度依赖性方式直接与毒液结合(图1D)。根据已发表的文
献，jarahagin明显为巴西具窍蝮蛇毒液中抑制α2β1整合蛋白与胶原
的结合的蛋白(De Luca，M.等生物化学生物物理研究通讯.206：570-576
(1995))，因此最可能是与rα2I区结合的毒液组分。
实施例3
运用生物素标记的229ox的肽和结合分析
短的环状jarahagin衍生肽模拟具巴西具窍蝮蛇毒液对整合蛋白r
α2I区-胶原相互作用的作用
jarahagin中α2I区结合位点的的鉴定通过使用对应于蛋白区的一
系列短环肽进行。检测区域根据以下选择：i)基质蛋白和蛇毒液脱整
合蛋白中整合蛋白结合基元被发现位于环状结构中。ii)已知整合蛋白
结合基元包括天冬氨酸残基。iii)已发表的整合蛋白-胶原相互作用模
型在天冬氨酸残基之外还强调精氨酸残基的作用。
Jarahagin-衍生肽根据jarahagin氨基酸序列的二级结构设计。使
用来自遗传电脑创建组(GCG)软件包(Madison，WI)的肽结构程序预
测二级结构。根据Emini方法(Emini，E.A.等.，病毒学杂
志.55：836-839(1985))的表面可能性和根据Kyte-Doolittle方法
(Kyte.J.等.，分子生物学杂志.157：105-132(1982))的亲水性被予以考
虑。
在自动肽合成仪(应用生物系统431A)中，用9-芴基甲氧羰基
(Fmoc)化学合成该肽。用于丙氨酸取代系列的肽从Research Genetics
(Huntsville，AL)公司购买。合成后肽被氧化形成二硫键。肽以1mg/ml
浓度溶解在0.1M碳酸铵缓冲液中，4℃孵育16-24小时。反向高效液
相色谱检测氧化，并将氧化肽冻干。
所有肽在PBS中以10mg/ml完全溶解。因使用浓度最高为1mg/ml，
避免了由于不溶性肽的非特异性作用。不同肽的等电点(PI)也使用来
自遗传电脑创建组(GCG)软件包(Madison，WI)的等电程序从一级序
列确定。肽225ox(表1)被发现具有与229ox(表1)相似的等电点，
因此在一些实验中被选作对照肽。
229ox的生物素标记如下进行：冻干的229ox肽溶解在PBS中，加
入1/5体积的0.1M NaHCO3，0.5M NaCl(pH8.0)以提高用于生物素标
记的pH。硫代-NHS-生物素(Calbiochem)按1∶2(w/w)229ox：生物
素加入，室温下孵育2小时。加入1/10体积0.5M Tris-HCl(pH8.0)
结束生物素标记反应。
对于使用生物素标记的229ox肽进行的结合分析，根据制造商的说
明在96孔胺结合平板(Costar)中覆盖不同浓度rα2I区或rα2I区衍
生肽。37℃下，所有孔内的残余蛋白吸收位点用含0.1％热灭活的牛血
清白蛋白的PBS溶液封闭1小时。向覆盖的孔中加入100μM生物素标
记的229ox的PBS溶液，2mM MgCl2，1mg/ml BSA，37℃孵育3小时。
将各孔用PBS洗3次，室温下，加入2mM MgCl2和浓度为500μg/ml的
铕标记链霉抗生物素蛋白(Wallac)的PBS溶液，2mM MgCl2，1mg/ml BSA
30分钟。再洗孔3次。每孔中加入0.1ml Delfia增强溶液(Wallac)，
荧光计测铕信号(Model 1232 Delfia，Wallac)。当用EDTA替代MgCl2
时，将铕标记rα2I稀释在PBS，2mM EDTA中，随后以此缓冲液冲洗。
合成对应于选择的序列的肽，得到的肽总结于表I。
为研究是否任何该种肽都能与α2I区直接相互作用，加jarahagin
肽以及环状RGD肽，I型胶原，IV型胶原和纤连蛋白被加至微量滴定孔
中，并加入rα2I-Eu。结果显示一种jararhagin肽，即229ox，有效
地与rα2I区结合而其它试验肽未显示效果(图2A)。
该肽随后被检测在浓度为500μM时其影响rα2I与I型胶原结合
的能力。又只有肽，229ox具有显著作用：它几乎完全抑制rα2I区与
胶原的相互作用(图2B)。
表1
研究中使用的合成肽的序列。显示基于jararhagin(Paine，M.J＞I.
等，生物化学杂志.267：22869-22876(1992))和α2I区(Takada，Y.和
Hemler.M.E.，细胞生物学杂志.109：397-407(1989))的级序列合成的肽
的名称和位置。
Jararhagin 肽 氨基酸序列 残基号
192ox；SEQ ID No.14 CWSNGDKITC* 212-219
195ox；SEQ ID No.15 CEQQRYDPYKC* 151-159
197ox；SEQ ID No.16 CKLPDSEAHAC* 103-111
223ox；SEQ ID No.17 CHYSPDGREIC* 46-54
225ox；SEQ ID No.18 CPADVFHKNC* 441-449
229ox；SEq ID No.5 CTRKKHDNAQC* 241-249
231ox；SEQ ID No.19 CYSNDDEHKGC* 537-545
I区肽 氨基酸序列 残基号
P1；SEQ ID No.20 VCDESNSIYC* 149-157
P2；SEQ ID No.21 VCDESNSIYPWDAVKNC* 149-164
P3；SEQ ID No.22 IYPWDAVKNFLEKFVQG 155-172
P4；SEQ ID No.23 AVKNFLEKFVQGLDIG 160-176
P5；SEQ ID No.24 LDIGPTKTQVGLIQYA 173-188
P6；SEQ ID No.25 QYANNPRVVFNLNTYKTKEE 186-205
P7；SEQ ID No.26 LNTYKTKEEMIVAT 197-210
P8；SEQ ID No.27 ATSQTSQYGGDLTNT 209-223
P9；SEQ ID No.28 RKYAYSAASGGRRSAT 231-246
P10；SEQ ID No.29 TDGESHDGSMLKAVIDQ 253-269
P11；SEQ ID No.30 LDTKNLIKEIKAIASIPTER 291-310
P12；SEQ ID No.31 SDEAALLEKAGTLGEQ 316-331
其它肽 氨基酸序列 参考文献
RGD GACRGDCLGA*；SEQ ID Koivunen，E.et al.，J.Biol.
No.32 Chem.268：20205-20210
(1993)
RGE GACRGECLGA*；SEQ ID Koivunen，E.et al.，J.Biol.
No.33 Chem.268：20205-20210
(1993)
*环肽
为显示229ox肽的结合特性与具巴西具窍蝮蛇毒液的相互性，检测
229ox肽与蛇毒液竞争rα2I结合位点的能力。结果显示229ox与具巴
西具窍蝮蛇毒液都与rα2I结合，并且229ox rα2I说明229ox代表
jararhagin中实际的整合蛋白结合位点。因为抑制不完全(约50％)，
所以也可能巴西具窍蝮蛇毒液还包含α2I区的其它结合位点。
在许多文献中，已表明整合蛋白配体模仿合成肽的环状结构是高亲
和性结合的关键。为检测这一点，如前述在固相结合分析中使用氧化和
线性的p229肽。环状229ox表现其抑制rα2I与I型胶原的粘附的能
力，而此肽的线性形式作用甚微(图4A)。rα2I与固相结合的229ox
的结合被发现为浓度依赖性的，且在浓度为75μg/ml时观察到最显著
的结合(图4B)。除I型胶原外，rα2I区还和IV型胶原，以及纤连蛋
白结合。229ox肽抑制rα2I与这些配体的结合，而等长同构象，具有
类似等电点值的对照肽225ox没有抑制作用(图4C)。这表明α2I区通
过相同机理与所有这些配体结合，且229ox通过直接与配体识别位点相
互作用或改变I区的三维结构使之钝化来抑制结合。
实施例4
jararhagin-衍生肽活化整合蛋白rα2I区的艾可病毒-1识别位点
除介导细胞对胶原和纤连蛋白-1的粘附外：整合蛋白α2β1还具
有病毒受体的功能，介导人病原体，艾可病毒-1的细胞表面附着和感染。
发现基质蛋白和艾可病毒-1与整合蛋白以不同方式相互作用，艾可病毒
-1的结合位点也定位在α2亚基的I区。如上所述，rα2I区显示弱的
与包被的艾可病毒-1的结合，但令人惊奇地，添加229ox肽结合增强约
10倍，而对照肽225ox无作用(图5)。此结果说明，229ox肽与α2I
区的结合诱导蛋白的结构变化，从而提高rα2I与艾可病毒-1的亲和
性。
这说明在I区存在一个可能的活性调节位点，其中RKK的结合可变
构地抑制与胶原的结合。RKK-诱导的rα2I区构象的变化在我们的实验
中明显，其中RKK肽不仅阻断rα2I区与胶原的粘附，还显著增加rα2I
区对艾可病毒-1的附着。除证实以往的论点外，艾可病毒-1，与胶原
识别α2I区的不同位点，数据说明存在一个通过占有其它结合位点(RKK
结合位点)的重要的配体识别位点(艾可病毒-1结合位点)的调节机制。
但是，已知的有关α2I区结构-功能相互关系的信息不足以作结论：RKK
是否直接与胶原识别位点结合或是否它是α2I区-胶原相互作用的变构
抑制剂。在两个种情况下，包含RKK的肽是用于揭示整合蛋白I区配体
识别功能的研究的十分有价值的工具。
实施例5
三个氨基酸的序列，RKK，是与整合蛋白rα2I区结合的关键
以往发表的有关在不同蛋白中整合蛋白识别位点的信息强调两个氨
基酸残基，即天冬氨酸和精氨酸的重要性。为揭示229ox肽中关键的氨
基酸残基，检测一系列新肽，其中p229中的氨基酸逐一被丙氨酸残基
取代。肽与固相结合，检测它们与rα2I结合的能力。有趣的是，发现
三个氨基酸，精氨酸-赖氨酸-赖氨酸(RKK)为关键，并且邻近的组氨
酸也有一些作用。与此一致的，rα2I与I型胶原的结合被含丙氨酸取
代的RKK序列不良抑制，而天冬氨酸或精氨酸残基的取代则不损害该功
能(图6A)。
为辨别α2I区中229ox肽的可能结合位点，合成对应于α2I区亲
水区的一系列肽，并检测他们与生物素标记的229ox的结合能力。α2I
区肽和rα2I与固相结合，加入生物素标记的229ox。229ox明显显示
与rα2I和肽P9结合，而在重复实验中不与其它蛋白结合(图7A)。
生物素标记的229ox和固相结合的rα2I的相互作用依赖于二价阳离子
(图7B)，铕标记的rα2I与固相结合的I型胶原和229ox肽的结合也
是如此(图7C)。
实施例6
RKK肽的临界长度
为确定RKK肽的临界长度，制备如下一系列包括RKK序列和额外氨
基酸的肽。检测CTRKKHDNAQC(229ox；SEQ ID No.5)，CTRKKHDNAC(SEQ
ID No.34)和CTRKKHDNC(248ox；SEQ ID No.4)。最短的肽在浓度为10
μM时显示对rα2I与胶原结合最强的抑制。它比较长的肽229ox有效
10倍以上(图8)。
实施例7
细胞迁移分析
迁移分析模仿细胞在胶原基质上的运动。此实施例证明本发明肽阻
止这些细胞的运动，并因此可用于治疗特征在于这类细胞迁移的疾病的
治疗方法中。
为显示229ox/RKK肽和225ox在细胞-胶原相互作用中的作用，让
化学转化的HOS-MNNG细胞与I型胶原接触，随后转移到胶原上。以前
表明过α1β1整合蛋白在此过程中的重要性(Vihinen，P.等.，细胞
生长分化7：439-447(1996))。
如前述进行细胞迁移分析(Vihinen，P.等.，细胞生长分化7：
439-447(1996))。首先，人HOS-MNNG骨肉瘤细胞(ATCC)悬浮在无血
清的Optimem 1培养基(生命技术公司)中，并将20,000-30,000细
胞/孔转移到直径为2.80mm的金属圆柱中的24孔细胞培养基培养板
(Costar)。将细胞培养孔中覆盖5μg/cm2I型胶原。细胞与胶原37℃
接触16小时。移去圆柱，用Optimem(生命技术公司)洗去未粘附细胞，
让粘附细胞在肽存在下在Optimem中迁移4天。每天更换含肽的新鲜
Optimem。4天后，被细胞覆盖的表面区域用微机影像设备模型M4(影
像研究公司)测量。
本实验的结果在图9显示。229ox或225ox肽以500μM浓度加入
到细胞中，每天加入新鲜肽。HOS-MNNG细胞迁移到I型胶原的能力不受
225ox对照肽的影响，但229ox明显抑制(p＜0.001，Student’s t-检
验)迁移(图9)。
对骨肉瘤细胞在胶原上迁移的抑制说明 i)恶性细胞的运动，从
而癌细胞侵染可被229ox抑制，和ii)当迁移是α1β1整合蛋白-胶原
相互作用的结果或部分结果时，任何细胞类型的迁移也可被抑制。
实施例8
RKK肽对细胞粘附的抑制
人角质形成细胞HaCaT细胞和从口的鳞状细胞的骨肉瘤建立的细胞
系UT-SCC-2与I型胶原在肽229ox或抗α2整合蛋白的功能性抗体，Gi9
(商业用抗-α2整合蛋白抗体，Immunotech/Coulter，Westrbrook，
Maine，美国)存在下的细胞粘附。细胞用放线菌酮10μg/ml在无血清
培养基中处理1小时。而后分离细胞，并在含0.1％甘氨酸的DMEM中预
敷I型胶原的微量滴定板上粘附1小时。洗去未粘附细胞，粘附细胞用
结晶紫染色，通过测量光吸收来估测粘附细胞的数目。
总结于图10的结果表明依照本发明的肽，例如肽229ox(p229ox)
抑制细胞迁移，并因此对治疗或预防涉及细胞迁移的疾病有益，例如齿
根骨膜炎，因为上皮细胞结合α1β1整合蛋白，并用此结合在胶原上迁
移。
实施例9
RKK肽在治疗齿根骨膜炎和齿龈炎中的运用
齿根骨膜炎是一种特征在于发炎并失去牙支撑性结缔组织的疾病。
疾病由致病口腔细菌引起，该细菌活化组织细胞以产生和释放降解组织
成分的水解酶。疾病过程的首要特征是将牙龈与牙齿表面连接的上皮细
胞(连接上皮细胞和囊上皮细胞)增殖和迁移的增加。
对齿根骨膜炎和齿龈炎的传统治疗着眼于通过机械刮牙或抗生素治
疗将致病菌从牙周组织除去。进一步的，常用外科矫正牙周组织结构。
本发明的肽提供的细胞迁移抑制，例如p229ox，可单独使用或作为
其它治疗的辅助剂来防止或治疗牙周疾病，包括齿根骨膜炎和齿龈炎。
尤其是，包括有效量的一或多种本发明的含RKK序列的环肽的组合物可
被局部给药至需治疗牙周疾病，包括齿根骨膜炎和齿龈炎的患者。在这
点上有益的组合物可用任何常规技术进行配制以用于局部施用。本发明
的肽可被配制在载体中，包括聚合物载体如，例如基于乙基纤维素，聚
硅氧烷橡胶，和尤其是可降解聚合物和共聚物，如聚(乳酸)，聚(乙
醇酸)，聚(乳酸)-(乙醇酸)共聚物，聚酰胺和聚酯，明胶，胶原，
白蛋白和纤维蛋白原的那些，交联被期望给予期待的RKK活性或释放特
性。口腔用的传递系统在，例如在此被引作参考的U.S.5,002,769，
U.S.5,023,082，U.S.5,160,737，U.S.5,330,746，U.S.5,425,
953，U.S.5,438,076和U.S.5,39,795，中描述。肽在口腔中以植
入物形式，或以在适当位置凝固在口腔中的液体组合物的一部分，或以
在所期待的位点提供有效水平的包含RKK的肽的牙膏或凝胶的形式被提
供在口腔所需部位。本发明的肽的量因需要而不同以便提供，在口腔和
传递系统的环境中提供需要的抑制作用的有效量，但取决于治疗病症的
严重性，一般在凝固以前或在固体组合物中可以液体组合物的约为
0.001％-95％的量存在。
膜也可用作将本发明肽提供至所需部位的载体。
依照本发明的包含RKK的肽可用于治疗和/或预防特征在于上皮细
胞迁移的疾病，尤其是用于治疗优选局部施用的医学疾病。
现已详细描述了本发明，显然对于本领域普通技术人员来说可进行
不影响其内容或实质的微小修改。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：Heino，Jyrki
Ivaska，Johanna
Kāpylā，Jarmo
(ii)发明题目：整合蛋白结合肽及其应用
(iii)序列号：
(iv)联系地址：
(A)地址：Sterne，Kessler，Goldstein & Fox P.L.L.C.
(B)街：1100 New York Ave.，N.W.
(C)城市：Washington
(D)州：D.C.
(E)国家：USA
(F)编码：20005-3934
(v)计算机可读形式：
(A)媒介类型：Floppy disk
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：
(vi)优先申请数据：
(A)申请号：08/893，526 USA
(B)申请日：(99)-7-11
(C)分类：
(viii)代理人/代理机构信息：
(A)名字：Cimbala，Michele，A.
(B)注册号：33,851
(C)参考/摘要号：1102.0240000
(ix)通讯信息：
(A)电话：202/371-2600
(B)传真：202/371-2540
(C)电报：
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
Xaa Arg Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Xaa Arg Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：3：
Xaa Arg Lys Lys Xaa Xaa Xaa
1 5
(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：4：
Cys Thr Arg Lys Lys His Asp Asn Cys
1 5
(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：5：
Cys Thr Arg Lys Lys His Asp Asn Ala Gln Cys
1 5 10
(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：6：
Cys Thr Arg Lys Lys His Asp
1 5
(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：7：
Cys Thr Arg Lys Lys His Asp Asn Ala
1 5
(2) SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：8：
Arg Lys Lys His
1
(2)SEQ ID NC：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列说明：SEQ ID NO：9：
CACAGGGATC CCCTGATTTT CAGCTC
(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：28个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列说明：SEQ ID NO：10：
GTGGCTGAAT TCAACAGTAC CTTCAATG 28
(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：11：
Pro Asp Phe Gln
1
(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：12：
Ile Glu Gly Thr Val
1 5
(2)SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：13：
Glu Phe Ile Val Thr Asp
1
(2)SEQ ID NO：14的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：14：
Cys Trp SerAsn Gly Asp Lys Ile Thr Cys
1 5 10
(2)SEQ ID NO：15的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
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Cys Glu Gln Gln Arg Tyr Asp Pro Tyr Lys Cys
1 5 10
(2)SEQ ID NO：16的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：16：
Cys Lys Leu Pro Asp Ser Glu Ala His Ala Cys
1 5 10
(2)SEQ ID NO：17的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：17：
Cys His Tyr Ser Pro Asp Gly Arg Glu Ile Cys
1 5 10
(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：18：
Cys Pro Ala Asp Val Phe His Lys Asn Cys
1 5 10
(2)SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：19：
Cys Tyr Ser Asn Asp Asp Glu His Lys Gly Cys
1 5 10
(2)SEQ ID NO：20的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：20：
Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser Ile Tyr Cys
1 5 10
(2)SEQ ID NO：21的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：21：
Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Cys
1 5 10 15
(2)SEQ ID No：22的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID No：22：
Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln Gly
1 5 10 15
(2)SEQ ID NO：23的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：23：
Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln Gly Leu Asp Ile Gly
1 5 10 15
(2)SEQ ID NO：24的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID No：24：
Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Lys Ile Gln Tyr Ala
1 5 10 15
(2)SEQ ID NO：25的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：25：
Gln Tyr Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr
1 5 10 15
Lys Glu Glu
20
(2)SEQ ID NO：26的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：14个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：26：
Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys Glu Glu Met Ile Val Ala Thr
1 5 10
(2)SEQ ID NO：27的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：27：
Ala Thr Ser Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp Lys Thr Asn Thr
1 5 10 15
(2)SEQ ID NO：28的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：28：
Arg Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr
1 5 10 15
(2)SEQ ID NO：29的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：29：
Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile Asp Gln
1 5 10 15
(2)SEQ ID NO：30的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：30：
Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro
1 5 10 15
Thr Glu Arg
(2)SEQ ID NO：31的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：31：
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln
1 5 10 15
(2)SEQ ID NO：32的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：线状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：32：
Gly Ala Cys Arg Gly Asp Cys Leu Gly Ala
1 5 10
(2)SEQ ID NO：33的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：33：
Gly Ala Cys Arg Gly Glu Cys Leu Gly Ala
1 5 10
(2)SEQ ID NO：34的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴学：环状
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列说明：SEQ ID NO：34：
Cys Thr Arg Lys Lys His Asp Gln Ala Cys
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