通过轻度的低温促进基因表达的序列.pdf

本发明的目的在于：在使用真核生物、特别是哺乳动物细胞的重组DNA法中，使生产的蛋白质增加。该目的通过使用轻度低温转录调控元件、或轻度低温转录调控元件连接而成的轻度低温转录调控增强子实现，其中所述轻度低温转录调控元件含有核苷酸序列：X1cccX5X6X7(式中，X1表示c、t或a，X5表示g、c、a或t，X6表示c、t、a或g，X7表示c、a、g或t)或与该序列互补的核苷酸序列。

权利要求书
1.  轻度低温转录调控元件，该轻度低温转录调控元件含有下述核苷酸序列或与该序列互补的核苷酸序列：
X1cccX5X6X7
式中，X1表示c、t或a，X5表示g、c、a或t，X6表示c、t、a或g，X7表示c、a、g或t。

2.  权利要求1的轻度低温转录调控元件，其中，核苷酸序列选自：
ccccgcc、ccccgca、ccccgcg、ccccgct、ccccgtc、ccccgta、ccccgtg、ccccgtt、ccccgac、ccccgaa、ccccgag、ccccgat、ccccggc、ccccgga、ccccggg、ccccggt、ccccccc、cccccca、ccccccg、cccccct、ccccctc、cccccta、ccccctg、ccccctt、cccccac、cccccaa、cccccag、cccccat、cccccgc、cccccga、cccccgg、cccccgt、ccccacc、ccccaca、ccccacg、ccccact、ccccatc、ccccata、ccccatg、ccccatt、ccccaac、ccccaaa、ccccaag、ccccaat、ccccagc、ccccaga、ccccagg、ccccagt、cccctac、cccctcc、tcccgcc、tcccgca、tcccgcg、tcccgct、tcccgtc、tcccgta、tcccgtg、tcccgtt、tcccgac、tcccgaa、tcccgag、tcccgat、tcccggc、tcccgga、tcccggg、tcccccc、tccccca、tcccccg、tccccct、tcccctc、tccccta、tcccctg、tcccctt、tccccac、tccccaa、tccccag、tccccat、tccccgc、tcccacc、tcccaca、tcccacg、tcccact、tcccatc、tcccata、tcccatg、tcccatt、tcccaac、tcccaaa、tcccaag、tcccaat、tcccagc、tcccaga、tccctcc、acccgcc、acccgca、acccgcg、acccgct、acccgtc、acccgta、acccgtg、acccgtt、acccgac、acccgaa、acccgag、acccgat、acccggc、acccgga、acccggg、acccggt、acccccc、accccca、acccccg、accccct、acccctc、accccta、acccctg、acccctt、accccac、accccaa、accccga、acccacc、acccaca、acccacg、acccact、acccatc、acccata、acccatg、acccatt、acccaac、acccaaa、acccaag、acccaat、gcccccc、ggcgggg、agcgggg、gacgggg、ttcgggg、ggggggg、ggcggga、tgcggga、gacggga、tggggga、和ggcgggt。

3.  轻度低温转录调控增强子，该轻度低温转录调控增强子是相同或不同的权利要求1的轻度低温转录调控元件连接而成，其中作为轻度低温转录调控元件，如果只含有连接在t的3’一侧的核苷酸序列：ccccgcc、ccccgtc、ccccgct、或ccccgaa；连接在g的3’一侧的核苷酸序列：ccccgcc；连接在a的3’一侧的核苷酸序列：ccccgcc；在3’末端的a之前的核苷酸序列：ggcgggg或ggggggg，则除外。

4.  轻度低温转录调控增强子，该轻度低温转录调控增强子是相同或不同的权利要求1的轻度低温转录调控元件经由其它核苷酸残基结合而成，其中作为轻度低温转录调控元件，如果只含有连接在t的3’一侧的核苷酸序列：ccccgcc、ccccgtc、ccccgct、或ccccgaa；连接在g的3’一侧的核苷酸序列：ccccgcc；连接在a的3’一侧的核苷酸序列ccccgcc；在3’末端的a之前的核苷酸序列：ggcgggg或ggggggg，则除外。

5.  轻度低温转录调控增强子，该轻度低温转录调控增强子具有核苷酸序列：
ttccccgccg caggacaaac gggtcgggaa cgcggaagtg ggtcagctcc gcctccaaatcagctgtccc cgcctcctag tcgctag(SEQ ID NO.3)。

6.  载体，该载体含有权利要求1或2的轻度低温转录调控元件，或者是权利要求3～5中任一项的轻度低温转录调控增强子。

7.  真核细胞，该真核细胞由权利要求6的载体转化而成。

8.  真核生物，该真核生物由权利要求6的载体转化而成。

9.  轻度低温转录调控因子及其控制物质的测定方法，该方法包含以下内容：将含有权利要求1或2的轻度低温转录调控元件的双链DNA探针与作为测定对象的蛋白质溶液接触，通过检测所结合的双链DNA探针来测定与轻度低温转录调控元件特异性结合的轻度低温转录调控因子的量。

10.  轻度低温转录调控因子的纯化方法，该方法包含以下内容：将含有权利要求1或2的轻度低温转录调控元件的双链DNA探针与蛋白质溶液接触，；获得与轻度低温转录调控元件特异性结合的轻度低温转录调控因子；然后分离该轻度低温转录调控因子。

说明书通过轻度的低温促进基因表达的序列
技术领域
本发明涉及在轻度的低温下促进基因转录的轻度低温转录调控元件(寡核苷酸)、含有该轻度低温转录调控元件的增强子。本发明还涉及利用该轻度低温转录调控元件的轻度低温转录调控因子(蛋白质)的测定方法、纯化方法。
背景技术
单克隆抗体、生长因子、凝血因子等很多药物或检测试剂都是通过生物技术生产的。
通常，在10～15℃的低温下，重组蛋白的正确折叠得到促进，通过其蛋白分解酶进行的分解也受到抑制(Baneyx，F.，In vivo folding ofrecombinant proteins in Escherichia coli(大肠杆菌中的重组蛋白的折叠).In Manual of industrial microbiology and biotechnology，第2版，(Demain，A.L.Davis，J.E.，Altas，R.M.，等人，Eds.)ASM印刷，Washingtonn D.C.，551～565页，1999)，因此，在细菌中生产重组蛋白时，不是采用37℃，而是在20℃以下的低温下进行培养。此时，低温下，通常蛋白质合成降低，因此目标蛋白的收量可能变差。利用冷激蛋白CspA的启动子与5’非翻译区(UTR)作为目标蛋白的表达启动子，则可以解决该问题(Baneyx，F.和Mujacic，M.，Cold-induciblepromoters for heterologous protein expression(用于异源蛋白表达的冷诱导型启动子)，Methods in Molecular Biology，205，1～18，2001)。
但是，在细菌和哺乳动物细胞中，蛋白质翻译后的修饰有很大的区别，特别是对于药物，糖基化的状态对于治疗效果很重要。因此，生产重组蛋白药物常利用哺乳动物细胞(特别是中国仓鼠的细胞株)。为了降低利用该细胞培养的制造成本，必须提高蛋白质的收量。在37℃下进行通常的培养时，细胞急剧增殖后死亡，因此，细胞存活并生产目标蛋白的期间缩短。人们通过添加细胞增殖抑制剂、使增殖抑制基因p27表达、以及在轻度低温(30～32℃)下培养、及其它方法尝试抑制细胞增殖、使细胞长时间存活(参照Schatz SM等人.，Biotechnol.Bioeng，2003年11月20日，84(4)：433～438)。
其中，轻度低温下的培养具有以下特征：1)细胞比培养温度为37℃时的存活时间更长，进行蛋白质合成。2)蛋白分解酶的活性降低，目标蛋白质分解减少。3)蛋白质的糖基化或异构体的生成与在37℃培养时相同程度。另外，加成唾液酸后反而比在37℃下更好。4)与在细菌中的情形同样，可能容易改善目标蛋白的正确折叠(KaufmannH，Mazur X，Marone R，Bailey JE，Fussengger M.，Biotech Bioeng.，2001Mar.20，72(6)：592～602；Yoon SK，Song JY，Lee GM.，Biotech Bioeng.，2003年5月5日，82(3)：289～98)。
关于最重要的重组蛋白的收量，由于细胞的存活期间延长，总收量大多增加。但是，如果考虑每个细胞单位时间的蛋白质生产量(比产率)时，则会出现偏差(根据细胞的种类或目标蛋白的种类而不同，或者根据尚未知的因素)，比37℃下的比产率反而降低的例子也有很多(Kaufmann H，Mazur X，Marone R，Bailey JE，Fussenegger M.，BiotechBioeng.，2001年3月20日，72(6)：592～602；Yoon SK，Song JY，LeeGM.，Biotech Bioeng.，2003年5月5日，82(3)：289～98)。基因表达调控机理不同，因此细菌的冷激蛋白CspA的启动子和5’非翻译区(UTR)无法应用于哺乳动物。
另一方面，最单纯的真核生物-裂殖糖酵母的基因组大小是1300万个碱基对，较小，但是具备真核细胞的基本功能，并且30％以上的基因是具有内含子，与人的已知同源基因的氨基酸序列保存性高，人的基因在酵母内可正常表达，容易进行功能分析等，因此可作为人的模型在生物科学研究中应用(Molecular Biology of the Cell，第4版，Alberts B，Johnson A，Lewis J，Raff M，Roberts，K，Walter P著，GarlandScience公司，纽约，2002)。
因此，来自含有酵母的菌类、以及比其更接近于人的真核生物例如植物、线形动物、昆虫、鱼类、两栖类、鸟类等的细胞可以根据需要补充适当的基因，由此可以与哺乳动物同样地进行蛋白质翻译后的修饰，用于在低温下生产蛋白质。并且，如果利用基因工程技术，可以获得含有进行了上述基因的突变的真核生物细胞的真核生物个体，可以进行蛋白质的生产。
非专利文献1：Kaufmann H，Mazur X，Marone R，Bailey JE，FusseneggerM.，Biotech Bioeng.，2001年3月20日；72(6)：592～602页；
非专利文献2：Yoon SK，Song JY，Lee GM.，Biotech Bioeng.，2003年5月5日，82(3)：289～98页；
非专利文献3：Fujita J.，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，1999年11月，1(2)：243～55页；
非专利文献4：Molecular Biology of the Cell(细胞分子生物学)，第4版，Alberts B，Johnson A，Lewis J，Raff M，Roberts K，Walter P著，GalrandScience公司，纽约，2002年
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供在轻度低温下提高每个细胞单位时间内的蛋白质产量、提高总收量的方法。
本发明的目的还在于提供轻度低温转录调控因子(蛋白质)的鉴定方法和纯化方法。
解决课题的手段
如正在申请中的国际专利申请(PCT/JP2005/003385)中所公开的，本发明人发现了一种基因表达调控序列(以下称为“轻度低温转录调控元件”)，该序列可发挥在轻度低温温度下促进转录的增强子的作用。其序列的例子是下述核苷酸序列或与该序列互补的核苷酸序列。
tccccgcc
本发明人对轻度低温转录调控元件进行深入的研究，结果发现了下述核苷酸序列在轻度低温中可特异性促进基因的转录。
X1cccX5X6X7
(式中，X1表示c、t或a，X5表示g、c、a或t，X6表示c、t、a或g，X7表示c、a、g或t)
即，本发明涉及轻度低温转录调控元件，该元件含有下述核苷酸序列或与该序列互补的核苷酸序列。
X1cccX5X6X7
(式中，X1表示c、t或a，X5表示g、c、a或t，X6表示c、t、a或g，X7表示c、a、g或t)
本说明书中，“轻度低温转录调控元件”是指在轻度低温下特异性促进基因的转录的核苷酸序列的单元。
本说明书中，“轻度低温”是指15～36℃、优选30～34℃、特别优选32℃的温度。本发明的轻度低温转录调控元件对基因的转录发挥轻度低温特异性的增强子作用。
本发明的轻度低温转录调控元件单独使用也可以发挥其功能，优选将2～350个、优选2～100个相同或不同的该序列结合使用。结合使用时，可以将相同或不同的该核苷酸序列相互直接连接，也可以在该序列间经由任意种类和数量的核苷酸残基结合。使轻度低温转录调控元件结合，这在本说明书中称为“轻度低温转录调控增强子”或简称为“增强子”。本发明的轻度低温转录调控增强子作为轻度低温转录调控元件，如果只含有连接在t的3’一侧的核苷酸序列：ccccgcc、ccccgtc、ccccgct、或ccccgaa；连接在g的3’一侧的核苷酸序列：ccccgcc；连接在a的3’一侧的核苷酸序列ccccgcc；在3’末端的a之前的核苷酸序列：ggcgggg或ggggggg的除外。
本发明的轻度低温转录调控元件和轻度低温转录调控增强子与距离启动子的距离、方向无关。
本发明中，“轻度低温转录调控因子(蛋白质)”是指通过轻度的低温来激活，调控、大多数情况下是促进与轻度低温转录调控元件结合的、位于元件附近的基因的转录的蛋白质。
本发明涉及含有上述轻度低温转录调控元件或轻度低温转录调控增强子的载体。
本发明还涉及由该载体转化的真核细胞。
本发明又涉及由该载体转化的真核生物。如之后的实施例所示，轻度低温转录调控增强子可以稳定地插入到细胞染色体中。
本发明还涉及轻度低温转录调控因子及其控制物质的测定方法。该方法包含：使含有轻度低温转录调控元件的双链DNA探针与作为测定对象的蛋白质溶液接触，检测所结合的双链DNA探针，由此测定与轻度低温转录调控元件特异性结合的轻度低温转录调控因子的量。被调控物质的活性是通过对与DNA探针结合的轻度低温转录调控因子的量的变化进行定量来测定。
本发明涉及轻度低温转录调控因子的纯化方法。该方法包含：使含有轻度低温转录调控元件的双链DNA探针与蛋白质溶液接触，获得与轻度低温转录调控元件特异性结合的轻度低温转录调控因子(蛋白质)，接着将轻度低温转录调控因子分离。
发明效果
本发明的轻度低温转录调控元件在轻度低温下可以促进基因的转录。根据本发明，可以鉴定和纯化轻度低温转录调控因子(蛋白质)及其控制物质。

附图简述
图1是表示pCAT3启动子载体的模式图。MCS表示多克隆位点，SV40启动子表示来自SV40病毒的启动子，CAT表示氯霉素乙酰转移酶的编码序列，PA表示来自SV40病毒的多腺苷酸化信号，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。
图2是表示pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司)的模式图。MCS表示多克隆位点。该多克隆位点的EcoRV和XbaI之间插入萤火虫荧光素酶的编码序列，在CMV启动子的5’一侧插入了轻度低温转录调控增强子。Neor表示G418抗性基因。
图3是以用32P-ATP标记的5’-ttccccgccgacggatccag-3’作为探针，对将小鼠Balb/3T3细胞在37℃(泳道1)或32℃(泳道2)下培养8小时时的核蛋白质进行凝胶移位分析，检测与轻度低温转录调控元件结合的轻度低温转录调控因子。
实施发明的最佳方式
轻度低温转录调控元件的例子包含：ccccgcc、ccccgca、ccccgcg、ccccgct、ccccgtc、ccccgta、ccccgtg、ccccgtt、ccccgac、ccccgaa、ccccgag、ccccgat、ccccggc、ccccgga、ccccggg、ccccggt、ccccccc、cccccca、ccccccg、cccccct、ccccctc、cccccta、ccccctg、ccccctt、cccccac、cccccaa、cccccag、cccccat、cccccgc、cccccga、cccccgg、cccccgt、ccccacc、ccccaca、ccccacg、ccccact、ccccatc、ccccata、ccccatg、ccccatt、ccccaac、ccccaaa、ccccaag、ccccaat、ccccagc、ccccaga、ccccagg、ccccagt、cccctac、cccctcc、tcccgcc、tcccgca、tcccgcg、tcccgct、tcccgtc、tcccgta、tcccgtg、tcccgtt、tcccgac、tcccgaa、tcccgag、tcccgat、tcccggc、tcccgga、tcccggg、tcccccc、tccccca、tcccccg、tccccct、tcccctc、tccccta、tcccctg、tcccctt、tccccac、tccccaa、tccccag、tccccat、tccccgc、tcccacc、tcccaca、tcccacg、tcccact、tcccatc、tcccata、tcccatg、tcccatt、tcccaac、tcccaaa、tcccaag、tcccaat、tcccagc、tcccaga、tccctcc、acccgcc、acccgca、acccgcg、acccgct、acccgtc、acccgta、acccgtg、acccgtt、acccgac、acccgaa、acccgag、acccgat、acccggc、acccgga、acccggg、acccggt、acccccc、accccca、acccccg、accccct、acccctc、accccta、acccctg、acccctt、accccac、accccaa、accccga、acccacc、acccaca、acccacg、acccact、acccatc、acccata、acccatg、acccatt、acccaac、acccaaa、acccaag、acccaat、gcccccc、ggcgggg、agcgggg、gacgggg、ttcgggg、ggggggg、ggcggga、tgcggga、gacggga、tggggga、和ggcgggt，但并不限于此。
(i)轻度低温转录调控元件的制备
轻度低温转录调控元件和轻度低温转录调控增强子可以使用带有保护基团的四种脱氧核糖核酸，通过使用磷酰胺(phosphoroamidide)的固相合成法、使用氢膦酸酯的固相合成方法等获得(例如参照Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL印刷，35～81，83～115(1984)；J.Org.Chem.，49，2139(1984)；Tetrahedron Lett.，27，469(1986)；Tetrahedron Lett.，22，1859～1862；Tetrahedron Lett.，21，719～722(1980)；J.Am.Chem.Soc.，103，3185～3191(1981))。目前可通过市售的DNA合成装置容易地合成(例如Applied Biosystem公司制备等)。
(ii)所使用的启动子
启动子可使用原核生物、真核生物、病毒的启动子。优选哺乳动物启动子和病毒启动子。优选的启动子的例子包含小鼠胸苷激酶(TK)、巨细胞病毒(CMV)、SV40的启动子，但并不限于此。
(iii)编码序列
要表达的基因可以使用任何编码蛋白质的序列，没有特别限定。也可以使不编码蛋白质的RNA表达。
(iv)所使用的载体
将本发明的轻度低温转录调控元件或轻度低温转录调控增强子、启动子、以及编码要表达的蛋白质的编码序列或不编码蛋白质的目标序列连接，插入载体中。载体是原核细胞和真核细胞表达用载体。为哺乳动物细胞时，优选的载体的例子包括pCMV(Invitrogen公司)、pCAT3启动子载体(Promega公司)、pSV2-neo载体，但并不限于此。
(v)所使用的宿主细胞
用该载体转染宿主细胞。宿主细胞优选使用真核细胞，特别优选使用哺乳动物细胞。优选的哺乳动物细胞株的例子有：人类细胞株293、293T、U-2OS、Huh-7、HeLa等，猴细胞株COS-7、Vero等，小鼠细胞株NIH/3T3、Balb/3T3，B-6、Hepal-6、中国仓鼠细胞株CHO等。
转染的方法有：磷酸钙法、脂转染法、反转录病毒法、电穿孔法等。例如在磷酸钙法中，边搅拌边向磷酸溶液中一滴滴加入含有DNA(载体)的氯化钙溶液。产生DNA-磷酸钙的微细沉淀，将该溶液加入到宿主细胞中，则DNA-磷酸钙的沉淀通过吞噬作用被摄取到宿主细胞中，结果DNA被摄取到细胞内。
(vi)培养条件
宿主细胞在轻度低温下培养。培养基无需使用特别原料，可以是各细胞通常所使用的培养基。哺乳动物细胞培养用的典型的培养基的例子是添加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改性Eagle培养基(D-MEM)(Invitrogen公司)。
本发明还涉及轻度低温转录调控因子(蛋白质)及其控制物质的测定方法。该方法包含以下内容：将含有轻度低温转录调控元件的双链DNA探针与作为测定对象的蛋白质溶液接触，通过检测所结合的双链DNA探针来测定与轻度低温转录调控元件特异性结合的轻度低温转录调控因子的量。控制物质的活性通过对与DNA探针结合的轻度低温转录调控因子量的变化进行定量来测定。
首先，按照标准方法制备含有轻度低温转录调控元件的DNA寡核苷酸及其互补链。制备的寡核苷酸的末端例如用生物素标记，进行退火，制成双链。或者将寡核苷酸制成双链，然后进行标记，也可以不标记，最后以双链的形式检测。除此之外还可以利用市售的凝胶移位分析(EMSA：电泳迁移率变动分析)试剂盒(PIERCE公司、MolecularProbes公司等)。接着，将含有双链寡核苷酸、轻度低温转录调控因子、以及根据情况含有该被调控物质的蛋白质溶液例如核提取物混合，使双链寡核苷酸与轻度低温转录调控因子反应。接着，通过凝胶电泳例如聚丙烯酰胺凝胶电泳分离寡核苷酸、蛋白质、以及两者的结合物。游离的寡核苷酸快速流出，流到下部，但蛋白质所结合的寡核苷酸缓慢流动，在上部分出现。以与寡核苷酸特异性结合的蛋白质的形式检测轻度低温转录调控因子。例如，如果寡核苷酸用生物素标记，则电泳后将聚丙烯酰胺凝胶转印到尼龙膜上，使用紫外线使膜进行交联。膜上的生物素标记和过氧化物酶标记的链霉亲和素特异性结合，与化学发光底物的反应使其发光，使其在X射线膜上感光，进行检测。如果是上述的Molecular Probes公司的试剂盒，则可以使用未标记的寡核苷酸进行反应，使其电泳，将凝胶直接用染料染色，检测蛋白质所结合的寡核苷酸。由该蛋白质特异性结合的寡核苷酸的量可以测定轻度低温转录调控因子。并且，通过对该轻度低温转录调控因子的量所带来的影响进行定量，可以测定该控制物质的活性。
本发明还涉及轻度低温转录调控因子的纯化方法。该方法包含：使含有轻度低温转录调控元件的双链DNA探针与蛋白质溶液接触，获得与轻度低温转录调控元件特异性结合的轻度低温转录调控因子，接着分离轻度低温转录调控因子。
首先，按照标准方法制备含有轻度低温转录调控元件的DNA寡核苷酸及其互补链。接着，例如将制备的寡核苷酸与载体结合，使其固相化。例如将寡核苷酸进行生物素化，使互补链退火，以双链的形式与亲和素化磁珠结合。接着，将固相化的双链寡核苷酸、将可能含有轻度低温转录调控因子的蛋白质溶液例如核提取蛋白按照大小分成的组分混合，使双链寡核苷酸与轻度低温转录调控因子接触。接着，例如如果使用磁珠作为载体，则通过磁铁回收与轻度低温转录调控因子结合的双链寡核苷酸。充分清洗后，洗脱特异性结合的蛋白质、即轻度低温转录调控因子，这样可纯化轻度低温转录调控因子。根据需要，还可以通过凝胶电泳或柱层析等进一步纯化。可以从纯化的蛋白质中鉴定轻度低温转录调控因子的氨基酸序列、基因。
以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例1
将三个含有tccccgcc的8个碱基串联连接(tccccgcctccccgcctccccgcc)(SEQ ID No.1)，或者是将tccccgcc的5’末端的t突变为其它碱基，将三个所得的突变体同样地串联连接，将它们插入到pCAT3启动子载体(Promega公司)的多克隆位点上。该载体具有SV40的启动子。作为报道蛋白，具有氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因。阴性对照使用未进行任何插入的pCAT3启动子载体。
将这些质粒的各2.5～5.0μg/35mm培养皿与0.5～1.0μg/35mm培养皿的CDM8-LacZ(β-半乳糖苷酶表达载体，用于校正各转染效率。ATCC公司)一起在37℃下培养一天，对人细胞株293进行转染。
将转染的细胞分成两组，一组在32℃下、另一组在37℃下分别培养。培养基是添加了10％FCS的D-MEM。
36小时后，通过离心回收细胞，制备全细胞溶解液。用CAT ELISA试剂盒(Roche Diagnostics公司)测定在各温度下生成的氯霉素乙酰转移酶(CAT)蛋白质的量，使用β-半乳糖苷酶测定试剂盒(Stratagene公司)测定β-半乳糖苷酶(LacZ)活性。
36小时的数据如下表所示。转录活性采用将CAT蛋白质量除以β-半乳糖苷酶活性所得的值。使用未进行任何插入的pCAT3启动子载体作为对照时，以32℃/37℃的比为1，分别表示各突变体的低温转录促进(增强子)活性。
[表1]

最初的碱基突变为C、A或G的突变体与野生型显示大致同等的低温转录促进活性。这显示轻度低温转录调控元件为含有7个核苷酸的ccccgcc即足够。
使用ttccccgccgttccccgccgttccccgccg(SEQ ID No.2)代替上述轻度低温转录调控增强子tccccgcctccccgcctccccgcc(SEQ ID No.1)，也得到了同样的结果
实施例2
实施例1中显示，8个碱基中的最初的碱基是T、C、A、G的任何一种均与活性没有关系，因此，将三个带有T、C、A或G的8个碱基分别与tcccgcc、acccgcc、gcccgcc、ccccgct等碱基序列的5’一侧串联连接，将所得与实施例1同样地插入到pCAT3启动子载体(Promega公司)的多克隆位点中，测定低温转录促进(增强子)活性，得到表2的结果。转录活性采用将CAT蛋白质量除以β-半乳糖苷酶活性所得的值。作为阴性对照，使用未进行任何插入的pCAT3启动子载体，此时以32℃/37℃的比为1，阳性对照是将三个野生型tccccgcc串联连接使用，此时32℃/37℃的比校正为5，给出了各突变体的低温转录促进(增强子)活性。
[表2]
最初的一个碱基对低温转录促进(增强子)活性的影响
元件碱基序列 增强子活性野生型0t tccccgcc 5.0突变体0t1t tTcccgcc 5.1突变体0c1t CTcccgcc 4.6突变体0a1t ATcccgcc 4.8突变体0g1t GTcccgcc 4.9突变体0t1a tAcccgcc 3.1突变体0c1a CAcccgcc 3.0突变体0a1a AAcccgcc 2.9突变体0g1a GAcccgcc 2.8
突变体0t1g tGcccgcc 1.1突变体0c1g CGcccgcc 1.0突变体0a1g AGcccgcc 1.1突变体0g1g GGcccgcc 1.2突变体0t7t tccccgcT 4.8突变体0c7t CccccgcT 4.8突变体0a7t AccccgcT 5.2突变体0g7t GccccgcT 5.0阴性对照1.0
再次确认：显示低温转录促进活性的轻度低温转录调控元件的8个碱基例如tccccgcc中的第1号碱基是T、C、A、G的任何一种对其活性均没有影响，因此，不仅以8个碱基、还以7个碱基例如ccccgcc为基础，制作轻度低温转录调控增强子。
使用ccccgccccccgccccccgcc(SEQ ID No.4)代替上述轻度低温转录调控增强子tccccgcctccccgcctccccgcc(SEQ ID No.1)，也得到了同样的结果。
实施例3
由ccccgcc的7个碱基序列的5’末端将第1、第2、第3或第4号的一个碱基c突变成其它碱基，在5’一侧附加tt，在3’一侧附加g或t，制成10个碱基，将它们三个串联连接，插入到pCAT3启动子载体(Promega公司)的多克隆位点中。然后与实施例2同样地进行，得到以下结果。结果如表3所示。
[表3]
第1、2、3或4的一个碱基的突变体的
低温转录促进(增强子)活性
元件碱基序列 增强子活性野生型ccccgcc 5.0突变体1aAcccgcc 3.0突变体1gGcccgcc 1.1
突变体1t Tcccgcc 5.1突变体2a cAccgcc 1.3突变体2g cGccgcc 1.0突变体2t cTccgcc 1.1突变体3a ccAcgcc 1.0突变体3g ccGcgcc 1.3突变体3t ccTcgcc 1.2突变体4a cccAgcc 1.2突变体4g cccGgcc 1.2突变体4t cccTgcc 1.1阴性对照1.0
第1号碱基突变为T的突变体显示与野生型同等的低温转录促进活性。突变为A的突变体显示比野生型稍低的低温转录促进活性。突变为G的突变体的活性低。第2、3或4号的碱基突变为A、G、T的突变体的活性低。
实施例4
研究了将ccccgcc碱基序列的第1号碱基突变为T、并且还存在1个碱基突变时的低温转录促进活性。即，
将第1号碱基突变为T、除此之外将第5号碱基突变为A、C或T得到的突变体；
将第1号碱基突变为T、除此之外将第6号碱基突变为A、G或T得到的突变体；和
将第1号碱基突变为T、除此之外将第7号碱基突变为A、G；或T得到的突变体；
串联含有三个，将所得寡核苷酸与实施例3同样地插入到pCAT3启动子载体(Promega公司)的多克隆位点中，得到以下结果。结果如表4所示。
[表4]
两个碱基的突变体的低温转录促进(增强子)活性
元件 碱基序列 增强子活性野生型 ccccgcc 5.0突变体1t5a TcccAcc 2.1突变体1t5c TcccCcc 2.3突变体1t5t TcccTcc 1.6突变体1t6a TcccgAc 2.1突变体1t6g TcccgGc 2.0突变体1t6t TcccgTc 3.1突变体1t7a TcccgcA 2.8突变体1t7g TcccgcG 2.6突变体1t7t TcccgcT 2.6阴性对照1.0
第1号碱基突变为T、并且还存在一个碱基突变时，以及第5号碱基突变为C、A、或T，第6号碱基突变为T、A或G，第7号碱基突变为A、G或T，其低温转录促进活性比野生型降低，但是仍可见显著的活性。
实施例5
以上结果表明，核苷酸序列：X1cccX5X6X7(式中，X1表示c、t或a，X5表示g、c、a或t，X6表示c、t、a或g，X7表示c、a、g或t)是轻度低温转录调控元件，将它们连接所得的寡核苷酸序列是增强子，由此可以认为，与这些序列互补的核苷酸序列也可见低温转录促进活性。这里，将分别串联含有三个符合的序列或者是不符合的单一序列所得的寡核苷酸与实施例3同样地插入到pCAT3启动子载体(Promega公司)中，得到以下结果。结果如表5所示。
[表5]

以上可见，核苷酸序列：X1cccX5X6X7(式中，X1优选为c或t，也可以是a；X5优选为g，也可以是c或a，还可以根据情况为t；X6优选为c，可以是t或a，根据情况可以为g；X7优选为c，还可以是t、a或g)、以及这些序列的互补核苷酸序列可见低温转录促进活性。
实施例6
由实施例5的结果可以预测：含有两个ccccgcc的核苷酸序列是轻度低温转录调控增强子。因此，在具有巨细胞病毒(CMV)启动子的pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司)(图2)的多克隆位点(EcoRV和XbaI之间)插入由pGL3-basic载体(Promega公司)切出的萤火虫荧光素酶cDNA，在CMV启动子的5’一侧串联插入两个ttccccgccg caggacaaac gggtcgggaa cgcggaagtg ggtcagctcc gcctccaaatcagctgtccc cgcctcctag tcgctag(SEQ ID No.3)。
接着，将该质粒5.0μg/60mm培养皿转染人类细胞株U-2OS，在37℃下、在G418(Invitrogen公司)存在下培养三周，获得将该质粒稳定地插入到染色体中进行表达的细胞克隆。将该培养细胞分成两组，均在37℃下培养2天，然后一组在32℃下、另一组在37℃下分别进一步培养。培养基是10％FCS+D-MEM。温度变更48小时后，通过离心回收细胞，制备全细胞溶解液。使用Dual-荧光素酶报道测定试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay kit)(Promega公司)测定在各温度下生成的萤火虫荧光素酶活性。结果如表6所示。活性是以单位提取蛋白的萤火虫荧光素酶活性表示。
[表6]
插入到染色体中的轻度低温转录调控增强子的转录促进活性

该结果显示，低温转录调控增强子在稳定地插入到细胞染色体中的状态下，以及不同的轻度低温转录调控元件经由其它的核苷酸序列结合，可促进32℃下的转录，使蛋白质生产量增加。
实施例7
使哺乳类细胞生产蛋白质时，可以考虑将两种蛋白质的基因同时插入到一个表达载体中的可能性。这里，在用实施例6中使用的CMV启动子表达萤火虫荧光素酶的载体的低温转录调控增强子5’上游一侧沿与另一个荧光素酶表达相反的方向(3’至5’方向)进一步追加CMV启动子，研究对荧光酶表达的影响。与实施例6同样，转染人类细胞株U-2OS，一组在32℃下、另一组在37℃下分别进一步培养，此时，由于反向的CMV启动子被加入到5’上游而使表达没有降低，相反还见到在32℃下有5～10％的转录促进，可见蛋白质生产增加。由此可以认为，由相反方向的启动子同时生产两种蛋白质的载体也可以用作低温转录调控增强子。
实施例8
凝胶移位分析
将小鼠Balb/3T3成纤维细胞在添加了10％牛血清(CS)的Dulbecco′s改性Eagle培养基(D-MEM)(Invitrogen公司)中、在37℃下培养24小时，将一部分在32℃下、其余在37℃下进一步培养8小时，然后按照常规方法(John David Dignani，Russell M.Lebovitz，和RobertG，Roeder，Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in asoluble extract isolated from mammalian nuclei，Nucleic Acids Res.，1983，11：1475～1489)制备核蛋白质提取液。
将寡核苷酸、5’-ttccccgccgacggatccag-3’(SEQ ID No.5)用T4多核苷酸激酶和γ-32P-ATP标记，用Sephadex G50柱(Amersham Bioscience公司)纯化，然后与互补链ctggatccgtcggcggggaa(SEQ ID No.6)一起退火，得到5X105cpm/ng的探针。
将0.1ng该探针与0.5μg poly(dI-dC)一起与核蛋白质提取液混合，在20℃下放置(该结合缓冲液的组成是10mM Tris(pH7.5)、100mMNaCl、2mM EDTA、10％甘油)。经过30分钟后进行4％聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶在80℃下干燥，使X射线膜感光，检测与轻度低温转录调控元件结合的蛋白质，轻度低温转录调控因子(图3)。
产业实用性
本发明可广泛应用于蛋白质的生产。
序列表
<110>藤田润
<120>通过轻度的低温促进基因表达的序列
<130>666864
<150>JP 2005-256085
<151>2005-09-05
<150>JP 2005-355117
<151>2005-12-08
<150>JP 2006-157422
<151>2006-06-06
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：增强子
<400>1
tccccgcctc cccgcctccc cgcc           24
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：增强子
<400>2
ttccccgccg ttccccgccg ttccccgccg    30
<210>3
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：增强子
<400>3
ttccccgccg caggacaaac gggtcgggaa cgcggaagtg ggtcagctcc gcctccaaat  60
cagctgtccc cgcctcctag tcgctag                                      87
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：增强子
<400>4
ccccgccccc cgccccccgc c                                           21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：探针
<400>5
ttccccgccg acggatccag                                             20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：探针
<400>6
ctggatccgt cggcggggaa                                            20