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头孢氨苄的制备方法
    本发明涉及一种借助于固定在珠状的、交联的、亲水性的、对带有亲核基团的配体具有结合活性的共聚物上的青霉素酰胺酶制备头孢氨苄的方法。

    现有技术

    通过在使用青霉素酰基转移酶(青霉素酰胺酶)的条件下，酰化带有活化侧链如酰胺或酯的β-内酰胺残基(β-内酰胺核)而合成半合成的β-内酰胺抗菌素的方法是本领域技术人员众所周知的。

    多数情况下，酶在此结合到固态的、不溶于水的载体上，并且随后在水溶液中与β-内酰胺核和活化侧链接触。

    目前公开的方法的缺点是，通过酶合成期望的化合物相对于活化侧链水解为无价值地侧链酸以及对期望产品的水解的比率，即所谓的S/H值，经常是不利的，并且很难实现经济的生产。

    由WO93/12250已知，在通过固定在Eupergit(Rhm GmbH & Co.KG，达姆斯塔特，德国，也参见比较实施例1)上的大肠杆菌青霉素酰胺酶合成半合成的β-内酰胺抗菌素，头孢羟氨苄和头孢氨苄中，S/H值能够通过选择反应条件而受到有利的影响。然而，没有教导载体材料性质的影响。在WO93/12250中教导的方法的缺点特别是，需要从反应混合物中分离与β-萘酚络合的头孢氨苄，以至随后的纯化步骤是必须的，且出现产量降低。

    因此，有尝试开发最佳的载体材料。例如，WO97/04086公开了固定在由溶胀剂和含有游离氨基的聚合物组成的载体材料上的大肠杆菌青霉素酰胺酶，以及其用于制备β-内酰胺衍生物的用途。然而，这种公开的制备头孢氨苄的方法的缺点是，与活化侧链D-苯基甘氨酰胺(PGA)相比，使用的β-内酰胺核7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)摩尔过量3倍。如果使用化学计量过量的β-内酰胺核，则为了能够经济地运行，这些核必须以工业规模回收。这是昂贵的而且导致产率降低。另外，由于核是不稳定的，所以环境也导致产品不纯。

    同样，EP0 730 035教导了以可接受的产率在特殊的载体上制备头孢氨苄的过程。然而，使用的载体材料(EmphazeTM)的粒度仅为60-80μm。这对工业应用来说有很大的缺点。例如，用这种材料装填的色谱柱仅有低流动速率。

    用于酶的载体材料描述在DE198 04 518中。它提到该材料可以用于酶催化合成羟氨苄青霉素和氨苄青霉素。没有提及适合用于借助固定化的青霉素酰胺酶合成头孢氨苄。

    目的和解决方案

    鉴于上述讨论的现有技术，本发明因此的目的是，提供一种改进的合成头孢氨苄的方法，其克服了上述缺点。

    本发明的方法特别应使得能够实现一个有利的S/H值。此外，使用的载体材料应具有对工业方法有利的粒度，为120-250μm。

    此目的通过权利要求1中定义的方法得以实现。本发明方法的优选实施方案在从属于权利要求1的从属权利要求中限定。

    特别地，成功地以一种不可预见的技术上简单的方式，通过珠状的、交联的、亲水性的、对带有亲核基团的配体具有结合活性的载体聚合物材料实现了上述目的，该聚合物材料可通过由单体和稀释剂组成的单体相的相反转珠状聚合而制备，其中含有的单体是：

    (a)5-40％重量的亲水性的带有乙烯基的可自由基聚合的单体，其在室温下形成至少10％的水溶液，

    (b)30-50％重量的带有乙烯基和附加的能够在与配体的亲核基团发生类似聚合物的反应过程中产生共价键结合的官能团的可自由基聚合的单体，

    (c)20-60％重量的带有两个或多个烯属不饱和可聚合基团的可交联的可自由基聚合的单体，

    条件是，a)、b)和c)的总和为100％重量，使用的稀释剂是甲醇和水以1∶1.0-1∶4.0配比的混合物，其中单体相在具有5-7个碳原子的脂族烃有机溶剂组成的连续相中分布成滴状，其中单体相与连续相的比为1∶2.0-1∶4.0，并以此形式在聚合引发剂和保护胶体的存在下进行自由基聚合，条件是，单体与稀释剂的比为1∶1.7-1∶2.4，用青霉素酰胺酶涂覆，并将经涂覆的载体与一种水溶液接触，该水溶液含有

    (i)7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸和

    (ii)D-苯基甘氨酰胺，

    其比为1∶2-2∶1，优选1.5∶1-1∶1.5，特别优选为近似等摩尔比，即其比为1.2∶1-1∶1.2。

    所用的载体材料和其制备方法描述于DE 19804518。

    本发明的实施

    载体材料的制备

    单体

    为了保证单体混合物的亲水性，它必须主要由亲水性单体组成。亲水性单体是指那些在室温下形成至少10％的水溶液，并优选不含有离子基团或者能够由于加入酸或碱而被离子化的基团的单体。

    单体a)是5-40％重量，8-35％重量，特别是9-12％重量的亲水性的带乙烯基的可自由基聚合的单体，其在室温下形成至少10％的水溶液。

    特别合适的单体a)是丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺，在此优选甲基丙烯酰胺。其它的例子有不饱和可聚合羧酸的羟基烷基酯，例如丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸羟乙酯或N-乙烯基吡咯烷酮。

    单体b)是30-50％重量，优选35-45％重量的带乙烯基和附加的能够在与配体的亲核基团发生类似聚合物的反应中产生共价键结合的官能团，优选环氧乙烷基团(环氧基)的可自由基聚合的单体。环氧乙烷基团特别合适，以结合配体，获得它们的生物活性。

    优选的单体b)是甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或烯丙基缩水甘油醚。特别优选两种单体已大约相等的量同时使用。

    单体c)是20-60％重量，特别是25-55％重量，特别优选40-55％重量的亲水性、可交联的、带有两个或多个烯属不饱和可聚合基团的可自由基聚合的单体。优选的单体c)是N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)或N，N′-亚甲基双(甲基丙烯酰胺)。特别优选N，N′-亚甲基双(甲基丙烯酰胺)。非必要地，还可使用0-10％重量的其他种可交联的带有两个或多个烯属不饱和可聚合基团的可自由基聚合的单体。合适的是亲水性二(甲基)丙烯酸酯，例如聚环氧乙烷-二(甲基)丙烯酸酯。

    每种情况下，单体a)、b)和c)的总和为100％重量。

    稀释剂

    单体相由单体a)-c)组成，它们溶解在必须是由甲醇和水以1∶1.0-1∶4.0配比组成的混合物的稀释剂中。甲醇和水的特别有利的混合比是1∶1.2-1∶2.5，特别是1∶1.3-1∶1.7。

    单体与稀释剂的比

    单体与稀释剂的比特别关键。其必须在1∶1.7-1∶2.4的范围内，特别优选在1.9-2.1的范围内。

    连续相

    适合作为连续相的是具有4-7个碳原子的脂族烃有机溶剂。优选正庚烷，特别优选环己烷。

    单体相/连续相的比

    单体相与通过有机溶剂形成的连续相的比必须是1∶2.0-1∶4.0，优选1∶2.8-1∶3.3。

    其它的工艺条件

    作为其它组分，悬浮的单体相以已知方式含有聚合引发剂，优选无硫引发剂，特别优选是4，4′-偶氮双(4-戊酸)，以及保护胶体(乳化剂)，例如重均分子量为30000-80000的由95份甲基丙烯酸正丁酯和5份甲基丙烯酸-2-氯化三甲铵基乙酯生成的共聚物。

    此外，珠状聚合(也称作悬浮聚合)按已知方式进行，通过例如先加入连续相和保护胶体，将也存在有引发剂的单体相，例如在40-60℃下借助搅拌分布在有机相中，然后加热到60-70℃。水/甲醇混合物可以例如经过6小时接近完全共沸地除去。混合物反应约3-5小时结束，然后冷却到室温。将形成的珠粒抽滤，真空干燥例如12小时。可选择也将珠状聚合物过滤出来并水洗。优选干燥在流化床干燥器中进行，因为以这种方式能够特别有效地除去溶剂残余物。所得的聚合物珠(＝载体聚合物材料)的尺寸为50-500μm，特别是120-250μm。所谓的结合能力是指这样的酶催化活性，其可以在用某种酶最大加载载体聚合物材料时达到。结合能力以青霉素酰胺酶活性表示，以每克载体聚合物珠上的单位数[U/g湿态]计。本发明的载体聚合物珠的结合能力按此测量方法为至少220[U/g湿态]。

    聚合物珠在水中的溶胀性通过溶胀指数[ml湿态/ml干态]表示。本发明的载体聚合物珠的溶胀指数不大于1.5。

    可根据本发明使用的载体材料的涂覆

    在实施例中，载体材料在磷酸钾缓冲液中在pH 7.5条件下涂覆。但是，对于本领域技术人员很清楚的是，有非常大量的其它确保令人满意的涂覆的方法。

    头孢氨苄的合成

    前体(i)7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸和(ii)D-苯基甘氨酰胺使用的浓度是10-500mM，优选50-300mM和特别优选150-950mM。

    本发明的有益效果

    本发明的方法使得能够以有利的S/H比(合成/水解)合成头孢氨苄。在本发明中有利的是，这一点通过使用粒度为50-500μm，特别是120-250μm的载体材料实现。由此达到更佳的应用技术性能，例如在固定床反应器中更高的流动速率。由更高的流动速率，导致更好的时空产率。较大的载体颗粒在分批法中也是有利的，因为它们能够更快地过滤出来。这再一次提高了时空产率和由此提高了方法的经济性。

    实施例

    (下面的测定方法对多孔载体聚合物材料领域的技术人员来说是常用的，只是为了完整性而提及)

    对大肠杆菌(Ec 3.5.1.11)的青霉素酰胺酶(＝青霉素G-酰基转移酶)的结合能力的测定

    a)载体聚合物材料上青霉素酰胺酶的共价键结合

    将1g载体聚合物材料加到在5ml经消毒的1M的磷酸钾缓冲液(pH7.5)中的1530个单位的青霉素酰胺酶，并在23℃孵化48小时。

    然后，将聚合物珠加到烧结玻璃漏斗(孔隙率为2或3)上，并用去离子水洗两次，接着用0.1M的含有0.05％的4-羟基苯甲酸乙酯的磷酸钾缓冲液(pH7.5)，借助在漏斗上抽滤而洗两次。测定所得的加载有青霉素酰基转移酶的珠粒的湿重。

    b)结合能力的测定

    将250-300mg湿的用青霉素酰胺酶偶联的载体聚合物材料(聚合物珠)加入在37℃下的20ml，2％的青霉素G在0.05M，pH7.5的含有0.05％的4-羟基苯甲酸乙酯的磷酸钾缓冲液中的溶液中。在均匀的搅拌下，用0.5M NaOH滴定释放出的苯乙酸，保持pH值恒定在7.8约10分钟，在此记录NaOH的消耗量。

    然后，聚合物珠如在a)中一样经过玻璃漏斗借助抽吸而从20ml，0.05M，pH7.5的含有0.05％的4-羟基苯甲酸乙酯的磷酸钾缓冲液中获得，这种测量重复两次。

    c)结合能力的计算

    测量曲线的线性范围(通常此范围为1-5分钟)作为计算的基础并外推10分钟的间隔。结合能力以每克湿载体聚合物材料的青霉素酰胺酶单位数(U/g湿态)形式来说明。一个单位相当于每分钟1μmol水解的青霉素G(μmol/min)；这里1升0.5M NaOH与500μmol水解的青霉素G相当(载体聚合物材料的含水量大约恒定，因此可以忽略)。

    比较实施例1

    将1530个单位的源自大肠杆菌的青霉素酰胺酶溶解于6ml消毒的1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)中。将此溶液加入到1g EupergitC(RhmGmbH & Co.KG，达姆斯塔特，德国)中，并将所得的悬浮液在23℃孵化72小时。聚合物珠在烧结玻璃漏斗上收集并用0.1M的磷酸钾缓冲液洗涤。根据实施例5或6进行下面的头孢氨苄合成和测定的S/H值。

    EupergitC(一种由N，N′-亚甲基双甲基丙烯酰胺、烯丙基缩水甘油醚和甲基丙烯酰胺生成的共聚物)及其制备方法在DE-C 2722751，US-A 4 90 713或US-A 45 11 694中描述。

    比较实施例2

    根据WO97/04086，使用在该文献中公开的A型酶或B型酶而如在实施例6中所述合成头孢氨苄。

    比较实施例3

    将大肠杆菌青霉素酰胺酶如比较实施例1中所述固定在SepabeadsFP-EP或SepabeadsFP-EP/G(Resindion S.R.I.，米兰，意大利)上。根据实施例5或6进行下面的头孢氨苄的合成和测定S/H值。

    SepabeadsFP-EP或SepabeadsFP-EP/G是一种高度聚合的、交联的、如Eupergit一样带有环氧乙烷基团的丙烯酸系共聚物。根据制造商的信息，平均粒度是150μm-300μm。

    比较实施例4

    测量用EmphazeTM或可根据本发明使用的材料装填的色谱柱的流动速率。

    材料：Emphaze UltralinkTM生物支持介质，Lot#DC53515，Pierce，根据制造商的信息，平均粒度是50μm-80μm；根据本发明可以使用的材料，平均粒度是208μm。

    对具有玻璃漏斗底部和聚丙烯管端盖板的硼硅酸盐玻璃色谱柱(柱尺寸1×20cm)空测可比较的流出速率。载体材料悬浮在水中过夜，然后用水冲洗入各个柱中，通过沉降和慢慢流出液体，得到高度为6.5cm的填充床。通过轻敲而赶走可能的空隙。此上部开口的柱子通过流入水形成23cm的恒定水柱。仅借助静水压获得流动速率。借助秒表和10ml的量筒测定流动速率。

    对于按本发明可使用的制剂测定的流动速率是4.25ml/分钟。对EmphazeTM测定的流动速率是0.71ml/分钟。流动速率越高(更高的时空产率)，球形颗粒对于固定床反应器中的操作的适应性越好。在固定床反应器中的压力降也可以用数学方法计算：K.Buchholz和B.Gdelmann，“固定化生物催化剂的表征“，Dechema专论，第84卷，编辑为K.Buchholz，VCH Weinheim，1979，第128-129页)。

    可明显地看出，与EmphazeTM相比，按本发明可使用的材料对于在固定床反应器中的使用具有更好的应用技术性能。

    实施例1-3

    实施例1-3中相一致的试验条件：

    在一个2升的带有温度计、水分离器、回流冷凝管、氮气导管的搅拌烧瓶中，加入一种有机溶剂，3g作为保护胶体的由95份甲基丙烯酸正丁酯和5份甲基丙烯酸-2-氯化三甲铵基乙酯生成的共聚物，和5g干冰。搅拌并通入氮气的条件下，在50℃下将由水和甲醇以1∶1.5配比(实施例1)或由甲酰胺(实施例2和3)组成的单体相作为稀释剂，以及

    10g甲基丙烯酰胺，

    20g烯丙基缩水甘油醚，

    20g甲基丙烯酸缩水甘油酯和

    50g亚甲基双甲基丙烯酰胺，

    以及

    2g 4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)(作为聚合引发剂)，

    在有机相中分布，然后加热到65-70℃下沸腾。将混合物孵化约6小时，再冷却到室温。将生成的聚合物珠吸滤，洗涤，并在流化床干燥器中干燥。接着测定青霉素酰胺酶的结合能力[U/g湿态]和溶胀指数[ml湿态/ml干态]。

    下表中列出了实施例1-3的重要试验参数和结果  实施例1  (根据本发明)    实施例2    (比较实施例)    实施例3    (比较实施例)  有机溶剂  (连续相)  952g环己烷    669g环己烷    530g正庚烷+    530g四氯乙烯  单体总量  100g    100g    100g  稀释剂  80g甲醇+120g水  (＝1∶1.5)    263g甲酰胺    264g甲酰胺  单体+稀释剂  (单体相)  300g    363g    364g  单体/稀释剂的比  1∶2    1∶2.63    1∶2.64  单体相/连续相的比  1∶3.2    1∶1.8    1∶2.9  青霉素酰胺酶  (1530U)的结合能力  [U/g湿态]  252    194    192  溶胀指数  [ml湿态/ml干态]  1.3    4.0    3.9

    实施例4

    头孢氨苄的合成

    反应在固定床反应器中，在25℃和pH7.5下进行。将10ml由0.2M的7-ADCA和0.2M的D-苯基甘氨酰胺组成的混合物的水溶液导过含0.5ml的固定化青霉素酰胺酶的柱子。在反应过程中，通过添加在附设的搅拌下的储备容器中的HCl而使pH值保持恒定。以一定的时间间隔取出样品并如在实施例5所示借助HPLC分析。

    实施例5

    对实施例4和比较实施例1-3的反应产物通过使用RP-8柱(MerckKGaA，达姆斯塔特，德国)的HPLC进行分析。使用的流动相是经消毒的67mM的pH7.5的磷酸钾缓冲液。头孢氨苄用30％(体积/体积)的甲醇水溶液洗提。

    头孢氨苄的合成速率(VCeph)以及D-苯基甘氨酰胺的水解速率(VD-PhG)从HPLC分析测定，由此计算S/H值(合成速率/水解速率比(VCeph/VD-PhG))。结果在下表中列出。    酶源    载体/固定相    VCeph/VD-PhG    大肠杆菌    根据本发明    4.6    大肠杆菌    WO97/04086中的A型    (参见比较实施例2)    3.3    大肠杆菌    WO97/04086中的B型    (参见比较实施例2)    3.3    大肠杆菌    比较实施例1    3.5    大肠杆菌    比较实施例3    (Sepabeads FP-EP)    3.2    大肠杆菌    比较实施例3    (Sepabeads FP-EP/G)    2.9

    本发明方法的值由7个平行实施的试验系列组成，其得出下面的S/H值：5.3，4.7，3.6，4.6，4.3，5.2，4.7；

    显而易见，与比较实施例相比，用本发明方法能够达到明显提高约30％的S/H值。