一步层析法纯化抗血小板溶栓素工艺 本发明涉及一种利用生化手段制备药物的方法，尤其涉及一种一步层析法纯化抗血小板溶栓素(蛇毒纤溶酶)的工艺。
现有技术如：中国科学院昆明动物所在公开号CN1065680A中公开的“尖吻蝮蛇毒去纤酶的纯化方法”中介绍，第一步将尖吻蝮蛇毒经落后的阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-50柱层析，得15个蛋白峰，5～6峰为去纤酶，7～8峰为止血灵。将具有活性的蛋白峰收集，再分别经过2次以上阴离子交换剂柱层析纯化，采用的阴离子交换剂为更落后的DEAE-Cellulose、DE-52或DE-32和DEAE-Sephadex A-50或QAE-Sephadex A-25。其工艺缺点是：步骤多、周期长、流速慢(A-50流速为45ml/小时)。同时，所用的凝胶属于软胶，柱层析后，柱体积变化很大，必须重新再生，方可使用。再生的方法是用碱-酸-碱各浸泡0.5小时，每一步浸泡后需花费很多的蒸馏水洗至中性，三步处理完后，再用PH7.2～8.8的缓冲液平衡，再装柱，再平衡，方可使用。每上一次样都必须反复这样处理，费时、费力、周期特长，工作量非常大，不适于工业化生产。
本工艺的目的在于提供一种层析步骤少、便利、快速、分辨率高、产率高、无副作用的抗血小板溶栓素的纯化工艺。
本发明的目的可以通过以下措施来达到，纯化工艺包括：
a．蛇毒用PH7.0～9.0的缓冲液溶解，用高分辨率、高流速加高载量的阴离子交换剂柱层析，再用PH7.0～9.0的缓冲液洗脱，所用的梯度是双向梯度，即PH直线梯度和NaCl凹型梯度，纯化得抗血小板溶栓素酶溶液。
b．将所得地抗血小板溶栓素酶溶液，再经凝胶过滤柱层析，用无菌蒸馏水洗脱，得纯品的抗血小板溶栓素酶溶液。
c．分离纯化采用凝胶，阴离子交换剂一步层析分离，即可得到目的产物，使工艺周期大为缩短，全工序操作在8℃～25℃室温条件下进行。
将所得纯品抗血小板溶栓素酶溶液经赋形剂配方过滤灌装、冷冻干燥、压盖，即得注射用抗血小板溶栓素成品。
溶解蛇毒所用的缓冲液是0.02～0.12M Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)或P.B.S缓冲液(磷酸盐缓冲液)。纯化所用的阴离子交换剂是国际先进的DEAE-Sepharose.Fast.Flow或QAE-Sepharose.Fast.Flow。纯化所用的NaCl浓度为0～1.0M。
赋形剂和赋形配方均采用现有技术。
本发明工艺的优点是改变了以往较传统的利用慢胶DEAE-Sephadex A-50凝胶作为分离手段，本发明利用目前国际上最先进、最快速的新一代Bioprocess凝胶，即DEAE-Sepharose.Fast.Flow凝胶。具体优点如下：
1、在一般传统的柱层析中，采用的阴离子交换剂为落后的DEAE-SephadexA-50，分离纯化都需要经过三次以上的纯化步骤，每次需3～4天，三次共计10～12天。本工艺只需一步层析，即可得到目的样品，而且周期不到一天，周期仅为传统工艺的十三分之一。
2、一般的柱层析，梯度洗脱只采取一种NaCl梯度，本工艺采用的是双向梯度，即缓冲液的PH梯度和NaCl梯度，分辨率高，一步纯化样品的纯度即达到95％以上。
3、本工艺得率高，约为粗毒总量的10％。
4、本工艺生产的抗血小板溶栓素，经出血毒测定，剂量为300ug(0.2～0.5ml)，注射于大白鼠皮下，无出血现象，由此证明本工艺生产的产品安全可靠。
5、本工艺由于快捷，所以在室温8℃～25℃下即可进行。
6、用本工艺生产的抗血小板溶栓素分子量小，为3KD，纤溶作用强，对纤维蛋白有直接的溶解作用。经动物药效学实验表明，该酶能有效地溶解动静脉血栓，能有效地防止血栓形成，降低血液粘度，改善微循环。同时，通过狗的动物模型实验、证实该酶还能有效治疗不稳定性的心绞痛。
7、本工艺所采用的凝胶DEAE-Sepharose.Fast.Flow不需再生，只需在柱上用上述缓冲液平衡至相应的PH，即可上样。该凝胶可反复使用上千次，因此经济、方便、效果佳。
下面通过实施例对本发明工艺作进一步的说明。
实施例一：
1、称取尖吻蝮蛇毒5克，溶于30ml 0.02M PH7.5 Tris-HCl缓冲液中，经4000转/分离心两次，每次十分钟，取上清液置4℃冰箱中保存待用。
2、装柱：取5×60cm2玻璃柱一支，将用0.02M PH7.5 Tris-HCl缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose.Fast.Flow凝胶装柱，再平衡。
3、洗脱：取步骤1中溶解粗毒所得的上清液上样，贮存瓶为6000ml 0.02MPH7.5 Tris-HCl缓冲液，内含有0.6MNaCl，梯度瓶为6000ml 0.02M PH9.0Tris-HCl缓冲液，梯度洗脱为双向梯度，即缓冲液的PH和NaCl的凹型梯度。洗脱流速480ml/小时，紫外(280nm)检测吸收峰，上样5小时后用自动部分收集器收集洗脱液，每管24ml，每小时20管。共得13个蛋白峰，其中第8峰为抗血小板溶栓素，酶溶液约500ml，含蛋白量500mg。取酶溶液经SDS-PAGE电泳，测定结果其分子量为3KD左右，纯度为单一组份。
4、将上述收集的抗血小板溶栓素酶溶液，经超滤器超滤浓缩至50ml左右，待用。
5、脱盐：取Sephacryl S-300HR用水平衡，装柱(柱3.0×80cm2)。将步骤4的酶溶液上样，流速为40ml/小时，用无菌蒸馏水洗脱，得纯品抗血小板溶栓素酶溶液，检测确实单位酶量，然后经赋形剂配方过滤、分装、冷冻干燥、压盖，得注射用抗血小板溶栓素成品。
实施例二：
取尖吻蝮蛇毒5克，溶于0.02M PH8.0 P.B.S缓冲液(磷酸盐缓冲液)中，其它操作同实施例一，只是将Tris-HCl缓冲液改为磷酸盐缓冲液。PH7.5改为PH8.0，其阴离子交换剂DEAE-Sepharose.Fast.Flow柱用磷酸盐缓冲液重新平衡至PH8.0，即可上样，经分离纯化得抗血小板溶栓素酶溶液460ml，含蛋白量400mg。
以上两批不同缓冲液纯化的样品，经生物检测及动物药效学实验，均无显著性差异。
本产品不仅用于抗栓、溶栓，还可用于治疗不稳定性的心绞痛及预防溶栓后再梗形成，是国家一类新药。