因此，本发明的目的是提供一种在稳定的生产细胞中以良好的产
率生产糖基化真核多肽的糖基化的方法，所述糖基化尽可能与天然蛋
白的糖基化相似，所以至少部分地消除了现有技术的缺点。
该目的是按本发明通过生产真核多肽的突变蛋白的方法实现的，
其中
(i)将一种能同源重组的核酸分子引入含编码内源性靶多肽的靶
核酸序列的真核细胞，所述核酸分子包括：
(a)至少一段序列片段，该序列片段与所述靶核酸序列的基
因座中的序列是同源的，并且，与所述内源性靶核酸序
列相比，在成熟多肽的编码区具有突变，以及
(b)一段编码选择标记的核酸片段，
(ii)将所述细胞在使得被引入的核酸分子发生同源重组的条件
下培养，于是在同源重组后该细胞含有能表达靶多肽的突变蛋白的突
变靶核酸序列，
(iii)选择在其中发生了同源重组的细胞，以及
(iv)从所述细胞或/和细胞上清液分离突变蛋白。
突变的真核蛋白质(尤其是突变的人蛋白质)可通过本发明的方法
在同源细胞中生产。意外地，这使得能以高产率获得具有与天然蛋白
质很相似的糖基化型式的突变蛋白。本发明方法的一个优点在于，蛋
白质可在真核细胞中被突变，并且通过该细胞合成的突变蛋白与内源
性地出现的细胞蛋白质相似。本发明方法进一步的优点在于，生成的
细胞(该细胞生产突变蛋白)的性能不因位点非特异性基因整合而被不
利地改变。因此，该细胞的基因组除了待表达蛋白质的基因座以外未
以任何方式改变，于是排除了相关的不利效果。
通过本发明的方法生产的人突变蛋白由于缺失、添加或/和取代个
别的氨基酸或整个肽片段而不同于相应的天然蛋白质。优选生产的突
变蛋白在N端和/或C端具有突变，例如缺失、插入、取代或/和与其
它蛋白质(例如人蛋白质)融合。
本发明的突变蛋白优选是非天然存在的多肽，并且与待突变的多
肽的等位基因变异(这在其它起始细胞中是天然出现的)不同之处在于
至少一个氨基酸不同。非天然的突变蛋白特别优选地由于缺失、添加
或/和插入个别的氨基酸或肽片段而不同于天然的等位基因变异。
应用于本发明方法中的细胞是任意的真核细胞，它具有待突变的
靶基因的至少一个内源性拷贝。该细胞优选是人细胞，特别优选是无
限增殖化人细胞，例如HeLa细胞、Namalwa细胞或HT 1080细胞。
意外地发现了，当应用的起始细胞含增大数量的染色体(靶基因处
于其上)时，可通过同源重组生产细胞，与只含两个拷贝的靶基因的细
胞相比，该细胞生产增大产率的突变的人蛋白质。这类起始细胞的实
例是具有基因重排的肿瘤细胞系，例如HeLaS3(Puck等，实验医学杂
志(J.Exp.Med.)103(1996)，273～284)和Namalwa(Nadkarni等，
癌(Cancer)，23(1969)，64～79)，它们含增大的染色体7拷贝数。
可进行突变靶基因的内源基因激活以进一步改善突变多肽的表
达。
为此，可将另外的积极地影响表达产率的序列引入基因组，其中
例如所述靶核酸序列的内源表达控制序列被异源表达控制序列至少部
分地替代。该异源表达控制序列可能含一个异源启动子或/和增强子，
该异源表达控制序列优选含一个病毒启动子，尤其是CMV启动子。当
应用合适的启动子时，内源启动子的替代不但能使表达增强，还容许
合成突变蛋白。所述异源启动子可以是可调启动子或构建型启动子。
此外，该启动子可用于钝化对内源启动子有阻抑效果的顺式元件。这
还可导致产率的增大。
被引入起始细胞的核酸分子包括至少一段序列片段，该序列片段
容许在靶基因的基因座中通过同源重组整合，并且适合将突变引入成
熟靶多肽的编码区。所述核酸分子优选含两个侧翼序列，它们与靶基
因座的区域是同源的。该侧翼序列优选各自具有至少150bp的长度并
且含编码成熟靶多肽的靶基因座序列的区域，该序列与天然序列相比
被修饰了。
此外，所述核酸分子含一种选择标记基因。这可以是真核细胞的
任意合适的选择标记基因，它导致在表达时的可选择表型，例如抗生
素抗性、辅源营养，表面蛋白的表达等。新霉素磷酸转移酶基因是特
别优选的选择标记基因。
此外，所述核酸分子可以任选地含一种负选择标记基因，例如HSV
胸苷激酶基因，在选择剂的存在下，它的表达破坏细胞。
如果希望在细胞中扩增修饰的靶基因，则所述核酸分子含一种扩
增基因。合适的扩增基因的实例有二氢叶酸还原酶、腺苷脱氨酶、鸟
氨酸脱羧酶等。二氢叶酸还原酶基因是特别优选的扩增基因。
当存在扩增基因时，可在同源重组后扩增突变靶核酸序列以便增
大细胞中的拷贝数。
本发明的方法能使应用的细胞基因组中存在的全部内源性基因突
变。所述靶核酸序列优选是组织纤溶酶原激活物(tPA)、促红细胞生成
素、胰岛素、肿瘤坏死因子、白细胞介素或白细胞介素受体序列。通
过本发明的方法获得的突变蛋白特别优选是一种其生物性质与相应的
天然蛋白质的性质不同的多肽，例如得自t-PA、包括t-PA的K2域和
P域的多肽(EP 0 382 174)。
可应用已知技术分离所述突变蛋白。该突变蛋白优选是从在悬浮
液中培养的细胞的上清液分离的。可在悬浮液中培养的细胞对于大规
模生产是特别有利的。这大为简化了在生产过程中所需的培养细胞的
转移。这导致大为节省生产时间和生产资源，于是显著减少了费用。
所述突变蛋白特别优选是从在无血清培养基中培养的细胞的上清液分
离的。与存在血清时培养的细胞相比，从无血清培养基中培养的细胞
可以更简便、更廉价地分离突变蛋白，因为需要更少的纯化步骤。
本发明进一步的主题是可通过前述方法之一从人细胞获得的突变
的人多肽，其特征在于人糖基化和不存在所述物种的外源多肽。“不
存在所述物种的外源多肽”表示相对于所需蛋白质的量来说少于3wt％
的所述物种的外源多肽杂质，优选少于1wt％，最优选少于0.1wt％。
本发明进一步的主题是生产一种表达人靶多肽的突变蛋白的人细
胞的方法，其特征在于：
(i)将一种核酸分子引入含编码内源性靶多肽的靶核酸序列的人
细胞，所述核酸分子包括：
(a)至少一段序列片段，该序列片段与所述靶核酸序列的基
因座中的序列是同源的，并且，与所述内源性靶核酸序
列相比，在成熟靶多肽的编码区具有突变，
(b)任选地一种所述靶核酸序列的异源表达控制序列，以及
(c)一段编码选择标记的核酸片段，
(ii)将所述细胞在使得被引入的核酸分子发生同源重组的条件
下培养，于是在同源重组后该细胞含有能表达靶多肽的突变蛋白的突
变靶核酸序列，
(iii)选择在其中发生了同源重组的细胞，以及
(iv)分离这样选择的细胞。
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子另外还含一种扩增基
因，并且所述突变靶核酸序列在同源重组后被扩增了。
本发明又一主题是可通过前述方法获得的人细胞，它含至少一个
编码突变的人多肽的内源基因。
本发明的细胞可在合适的培养条件下培养，并且它优选是在悬浮
液中生长的细胞，特别优选是在无血清培养基中生长的细胞。
本发明又一主题是通过前述方法生产的人细胞在生产人多肽的突
变蛋白方面的应用。
本发明又一主题是一种药物制剂，其特征在于，它含作为活性物
质的前述突变蛋白，以及任选含其它活性物质或/和常规药物载体、辅
助物质或添加剂。
实施例
含K2域和P域的t-PA突变体的构建：
a)载体构建
导向载体包括如下元件(按5′-3′顺序列出)：
A：6kb Bg III片段，它含约3.5kb的t-PA基因5′上游区(Friezner
等，1986，生物化学杂志(JBC)261(15)：6972)。
B：大约5.2基因激活序列(作为AgeI片段)，它含处于RSV启动
子和作为终止子的SV40的晚期聚腺苷酸化位点控制下的新霉素磷酸
转移酶(NEO)基因，编码鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)的精氨酸突变体
(Simonsen等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.
USA)80(1983)，2495)的基因，该基因受早期SV40启动子和作为终止
子的早期SV40聚腺苷酸化位点(Kaufmann等，分子细胞生物学(Mol.
Cell.Biol.)，2(1982)，1304；Okayama等，分子细胞生物学，3(1983)，
280以及Schimke，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，263(1988)，5989)
和巨细胞病毒(CMV)启动子(Boshart等，细胞(Cell)，41(1995)，p21)
的控制。
C：从t-PA cDNA分离的大约200bp片段，它相应于核苷酸位置1～
199，并且它含信号序列的编码区和成熟t-PA的最先三个氨基酸
(Pennica等，1983，自然(Nature)301：214)。
D：大约1.5kb EcoRI片段，它含tPA基因的内含子G的大部分
(Friezner等，在上面所引的文献中，Ny等，1984，PNAS，81：5355)。
这些元件是从合适的起始原料分离的，并且是通过PCR和适当的
融合PCR引物装配的。接着将融合的元件连接入pBR322并引入大肠埃
希氏菌。还可将所述片段从相应的起始原料切割下来再通过接头连
接。
b)人细胞系
将HeLa用作进行内源性基因激活的细胞系，其中证实t-PA基因
的转录可通过添加醋酸佛波豆蔻酯来诱导(Waller和Schleuning，
1985，生物化学杂志，260：6354)。在通过电穿孔法引入导向载体后，
通过添加G418选择含该载体的细胞。通过用能检测所需多肽的表达的
ELISA(Imubind-Total tPA，American Diagnostics)测试所述细胞的
上清液鉴定由于同源重组而分泌了具有t-PA的K2域和P域的多肽的
细胞。