高转移人肝癌细胞系及其建立方法 本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种人肝癌转移细胞系的建立及其建系方法。
肿瘤的侵袭与转移是恶性肿瘤最基本的生物学特性之一，也是肿瘤患者死亡的重要原因。然而有关转移的确切机制尚不甚了解。因此，肿瘤转移已成为当前肿瘤学研究的一个热点。有关肿瘤转移的研究还主要局限于手术切除的肿瘤标本和某些有限转移特性肿瘤细胞系的转移相关指标的观察，而它们均不能精确反映肿瘤生长转移的整个临床过程，直接影响着转移机制及其干预治疗的深入研究。人类癌瘤成功地移植于裸鼠体内，使体外整体实验研究人类肿瘤生物学特性，特别是人类恶性肺瘤的实验性自发转移成为可能。人体肿瘤转移动物模型可模拟人癌转移的自然过程，它的建立虽可为转移机制地基础研究及临床干预研究提供较为理想的模型，但与细胞系相比，人肿瘤动物模型尚存在某些不足，主要概括为：①它只能提供肿瘤转移过程的结局，而不能直接观察到整个转移过程变化的各个环节；②肿瘤细胞转移常受到宿主个体差异及体内多种因素的干扰，直接影响到肿瘤转移的遗传学、药理学和病因学等单因素分析和研究；③不易直接观察到某些影响肿瘤生长转移相关的单一因子对肿瘤细胞的作用；④无法直接观察到细胞的活体形态，以及瘤种传代繁琐、费用大和瘤标本难以冷冻保存等等。而肿瘤细胞系的建立，可为研究肺瘤个体差异，如癌变机理、肿瘤抗药特性，筛选抗肿瘤药物等，提供了理想的研究对象，还可从中筛选具有一定特性的细胞系，供在某方面有特殊需要的研究应用，从而达到与裸鼠模型互补的效果。
原发性肝癌目前已成为我国最常见的恶性肿瘤之一，其高侵袭转移直接影响了病人的预后。自六十年代陈瑞铭建立了世界上第一株人肝癌细胞系以来，国内外已有许多建成的人肝癌细胞系被报道，但至今尚未见到具有高转移潜能的人肝癌细胞系被建立。
本发明的目的是提供一种具有高转移潜能的人肝癌细胞系及其建系方法，为人肝癌的遗传学改变规律，肝细胞肝癌的病因学，肿瘤转移机理的研究，以及抗转移的药物筛选提供理想的实验对象。
本发明利用人肝癌高转移裸鼠模型移植瘤组织作为建系瘤源，采用体外培养结合动物体内再接种生长的方式交替进行，建成了一株具有高转移潜能的人肝癌细胞系，命名为MHCC97。保藏号为CGMCCN0.0371，本发明建立高转移人肝癌细胞系的具体方法如下：
1.取肝细胞癌患者肝转移灶的手术标本，原位接种于裸鼠肝内，建立高转移的人肝癌裸鼠模型。该患者血清HbsAg阳性，HCV-DNA阴性，AFP高水平表达。裸鼠BALB/C nu/nu由中国科学院上海药物研究所提供。
2.制备肿瘤细胞悬液：
荷瘤裸鼠处死，分离取出皮下和肝内移植瘤块，用眼科镊在DMEM培液中充分撕拉，逐将该培养液移入离心管中，静置10分钟左右，吸出含有瘤细胞的上层培养液于另一新离心管内，1000rpm×5分钟，弃上清，沉淀细胞用无菌蒸馏水低渗处理10秒钟，致红细胞膜破裂溶解，速补足DMEM培养液，同前离心，沉淀用完全培养液(DMEM＋10％人AB型血清)悬浮，移入培养瓶，37℃，5％CO2条件下孵育。次日吸去飘浮未贴壁的死细胞和杂细胞的培液，加足培养液，每二天更换一次。
3、瘤细胞的体内外交替生长
瘤细胞体外培养一段时间后，将瘤细胞再回注到裸鼠皮下，每只裸鼠细胞接种量为＞5×106/0.2m1。待瘤结节长至0.5-1.0cm3大小取出分离，如上处理再进行体外培养，经重复5-6次，由此获得的瘤细胞MHCC97能在体外长期稳定生长和传代。
本发明采用AB型血清的高糖DMEM培养MHCC97细胞，使其能在体外长期生长和稳定传代。
经实验观察与验证。体外生长的MHCC97具有典型的上皮样形态，接触性生长抑制丧失。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该细胞裸鼠接种成瘤率和原位接种的肺转移率为100％，接种部位和方式无限制。细胞的裸鼠体内移植瘤与原移植瘤的组织结构相似，符合肝细胞肝癌的病理学特征。此外，移植瘤与转移灶癌细胞AFP呈阳性表达同时显示HBsAg阳性。由此可见，MHCC97细胞系仍保留瘤组织原有的生物学特性，它的建立可为肝癌转移机制的基础研究和临床的干预研究提供较理想的模型。
图一为贴壁生长的MHCC97细胞(HE×200)显示，细胞均呈簇样生长，细胞为典型的上皮样细胞，其形状不规则，细胞排列紧密，界限清楚，接触性抑制丧失。细胞有伪足样突起伸出，超微结构显示该细胞符合一般上皮性恶性肿瘤的病理学特征，表现为核变异大，核膜深陷，核仁多，边移，常染色质增多；胞质内溶酶体增多，并可见较多的髓样小体；线粒体肿胀，糖元可见。
图二为MHCC97细胞核和肺内转移灶(HE×400)显示。
肝内接种30天以后，肺部自发转移率100％(20/20)，未见明显的淋巴结肿大，提示该细胞能以血道转移为主。符合临床肝癌转移特征。
图三为MHCC97细胞系G-显带模型显示。
结果显示该细胞染色体核型变异大，为超二倍体细胞，染色体均发生数目和结构的畸变，染色体数分布范围在59-65条。G-显带分析，染色体数目改变主要表现为染色体单体，三体和多体。符合恶性肿瘤的遗传学特征。