一种HUPBL－SCID鼠动物模型及其构建方法.pdf

本发明公开了一种HuPBL－SCID鼠动物模型。该HuPBL－SCID鼠动物模型，是将经CD40抗体刺激的人外周血淋巴细胞转输SCID小鼠，转输后用rhIL－15进行免疫，得到HuPBL－SCID鼠动物模型。其构建方法，包括以下步骤：1)体外培养人外周血淋巴细胞，培养时加入CD40抗体进行刺激；2)将步骤1)得到的人外周血淋巴细胞转输SCID小鼠；3)用rhIL－15对SCID小鼠进行免疫，得到HuPBL－SCID鼠动物模型。本发明具有重复性好，效果显著，小鼠遗传背景清楚、死亡率低，操作方法简便、安全、实验的成本较低且适合大规模动物实验的优点，具有良好的应用前景。

1、  一种HuPBL-SCID鼠动物模型，是将经CD40抗体刺激的人外周血淋巴细胞转输SCID小鼠，转输后用rhIL-15进行免疫，得到HuPBL-SCID鼠动物模型。

2、  一种权利要求1所述HuPBL-SCID鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
1)体外培养人外周血淋巴细胞，培养时加入CD40抗体进行刺激；
2)将步骤1)得到的人外周血淋巴细胞转输SCID小鼠；
3)用rhIL-15对SCID小鼠进行免疫，得到HuPBL-SCID鼠动物模型。

3、  根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：在转输前12-36小时，给SCID小鼠注射40-60μL抗ASGM1。

4、  根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于：在转输前2-4小时，对SCID鼠用放射线进行照射，照射剂量为150-250cGy。

5、  根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于：所述SCID小鼠的鼠龄为6-8周。

6、  根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中淋巴细胞的分离方法为密度梯度离心法；培养人外周血淋巴细胞时，所述CD40的浓度为40-60ng/mL，所述刺激时间为8-12小时，所用培养基为RPMI-1640完全培养基。

7、  根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述CD40的浓度为50ng/mL，所述刺激时间为10小时，

8、  根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中每只SCID小鼠注射经CD40抗体刺激的人外周血淋巴细胞的数量为1×10⁷至1×10⁸个；所述注射途径为腹腔注射或静脉注射。

9、  根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中每只SCID小鼠注射经CD40抗体刺激的人外周血淋巴细胞的数量为5×10⁷个；所述注射途径为腹腔注射。

10、  根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中rhIL-15的免疫剂量为0.5-2μg/只，转输当天进行第一次免疫，此后，每隔24小时免疫一次，共十次；免疫方式为腹腔注射。

一种HuPBL-SCID鼠动物模型及其构建方法
技术领域
本发明涉及动物模型及其构建方法，特别是涉及细胞免疫学和实验动物学技术领域的一种HuPBL-SCID鼠动物模型及其构建方法。
背景技术
医学研究的最终目的是改善人民健康。然而对人类疾病的多种研究不能直接在人体内进行，需要先进行动物的体外和体内实验。在过去的生物医学研究中，因缺乏合适的动物模型用于研究人体细胞在体内的生理及病理机能，而且由于道德、伦理、法律等多方面的制约，在人体内的实验受到极严格限制，因此涉及人体细胞的研究一般只能进行体外试验，而体外试验的结果与体内情况往往相去甚远。近年来，陆续报道了有关实验用动物模型的研究，如将人的胎儿胸腺、胎肝和胎骨甚至成人的外周血造血干细胞移植到患有严重联合免疫缺陷综合征(severe combined immunodeficiencysyndrome，SCID)的小鼠体内，分别构建成SCID hyTHy/Liv、SCID huBone、SCID HuPBL等几种人鼠嵌合小鼠模型。其中，人外周血淋巴细胞(HuPBL)，具有来源方便，重建后的动物模型中T、B淋巴细胞都具有功能，并可以检测到人免疫球蛋白的存在的优点，因而更广受重视。
1988年，Mosier等首先证明人外周血淋巴细胞(HuPBL)输入SCID鼠后可形成人体的免疫系统并维持数月(Mosier DE et al.Transfer of a functional human immunesystem to mice with severe combined immunodeficiency.Nature，1988；335：256)。他们将HuPBL经腹腔注入SCID鼠，发现可在小鼠的腹腔和外周淋巴器官检出人的T细胞和B细胞(Mosier DE et al.Immunodeficient mice xenografted with humanlymphoid cells：new models for in vivo studies of human immunobiology andinfectious diseases.J Clin Immunol.1990；10：185)。然而，早期的HuPBL-SCID模型，只有少量的人淋巴细胞能够转移成功(大约0.1％)，用这样的模型分析抗原特异的细胞免疫和体液免疫极度困难，大大降低了模型的价值。
针对上述缺陷，人们采取了多种方法试图改进，如增加淋巴细胞的输入数量、转输之前给予小鼠亚致死量的放射线照射、注射抗ASGM1(Anti asialo GM1)以清除小鼠体内NK细胞的排斥反应，但是这些方法的效果并不理想。人们又尝试使用人造血细胞刺激因子进行改进，先后有Murphy WJ，et al.使用人生长因子激素作为刺激剂(Humangrowth hormone promotes engraftment of murine or human T cells in severecombined immunodeficient mice.Proc Natl Acad Sci USA.1992；89：4481)，BombilF et al.使用IL-4作为刺激剂(Bombil F et al.Human recombinant interleukin-4(HurIL-4)improves SCID mouse reconstitution with human peripheral bloodlymphocytes.Immunobiology 1996；196：437)，Coccia MA et al.使用IL-6作为刺激剂(Human IL-6 enhances human lymphocyte engraftment and activation but nothuman antibody production in SCIDhu PBL mice.Immunobiology 1998；198：396)，但这几种改进方法都只能促进人T淋巴细胞在SCID小鼠体内重建，且促进作用有限。1995年，Martensson C et al.(Enhancement of specific immunoglobulin productionin SCID-hu-PBL mice after in vitro priming of human B cells with superantigen.Immunology.1995；86：224)采用体外葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激HuPBL后再转输SCID小鼠，该方法促进了B淋巴细胞在小鼠体内的重建，但主要是促进了B细胞的重建，对T淋巴细胞的重建效果不明显。总体看来，上述方法并没有真正把人的免疫系统很好地重建在SCID小鼠体内，且需要转输的淋巴细胞的量较大。因此，迫切需要一种既能促进T淋巴细胞重建又能促进B淋巴细胞重建的实验用动物模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种T、B淋巴细胞都具有完全功能的实验用HuPBL-SCID鼠动物模型。
本发明所提供的HuPBL-SCID鼠动物模型，是将经CD40抗体刺激的人外周血淋巴细胞(HuPBL)转输SCID小鼠，转输后用重组人白细胞介素15(rhIL-15)进行免疫，得到HuPBL-SCID鼠动物模型。
为获得更好的效果，可在转输前，先后用抗ASGM1和放射线对SCID鼠进行处理。
本发明的第二个目的是提供一种上述HuPBL-SCID鼠动物模型的构建方法。
本发明所提供的HuPBL-SCID鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
1)体外培养人外周血淋巴细胞，培养时加入CD40抗体进行刺激；
2)将步骤1)得到的人外周血淋巴细胞转输SCID小鼠；
3)用rhIL-15对SCID小鼠进行免疫，得到HuPBL-SCID鼠动物模型。
为获得更好的效果，所述构建方法中还包括：在转输前12-36小时，给SCID小鼠注射40-60μL抗ASGM1和在转输前2-4小时，对SCID鼠用放射线进行照射，照射剂量为150-250cGy，优选为200cGy。
构建时，一般采用6-8周的SCID小鼠，鼠龄过大构建的模型效果较差。
采用HIV、HBV均呈阴性的人血液分离人外周血淋巴细胞，分离方法为密度梯度离心法(Ficoll density gradient centrifugation)；培养人外周血淋巴细胞时，所述CD40的浓度为40-60ng/mL，优选为50ng/mL，所述刺激时间为8-12小时，优选为10小时，所用培养基优选为RPMI-1640完全培养基。
所述步骤2)中每只SCID小鼠注射经CD40抗体刺激的HuPBL的数量为1×10⁷至1×10⁸个，优选为5×10⁷个，数量过少，重建效果不好；过多，则移植物抗宿主病(GVHD)发生的几率越大，造成小鼠的死亡率也会越高；所述注射途径可为腹腔注射或静脉注射，优选为腹腔注射，在相同数量HuPBL的注射条件下，腹腔注射途径引起的GVHD较轻，且腹腔注射容易操作。
所述步骤3)中rhIL-15的制备方法可参见文献：孙汭等，重组人白细胞介素15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达。中国生化药物杂志2000年第21卷163-165；孙安源等，重组人白细胞介素15的纯化及生物活性鉴定。中国免疫学杂志2001年第17卷292-295，rhIL-15的免疫剂量为0.5-2μg/只，优选为1.0μg/只，转输当天进行第一次免疫，此后，每隔24小时免疫一次，共十次；免疫方式为腹腔注射。剂量过小，促进转移重建的效果不是很理想，剂量过大，则对T细胞有较强的促增殖作用，可导致GVHD的发生，同时rhIL-15本身的一些副作用也可能造成小鼠死亡，采取这种免疫方式可大大降低小鼠的死亡率，同时重建效果十分理想。
在转输HuPBL后的第7、14、21天，可取小鼠的尾静脉，检测人免疫球蛋白的水平；转输HuPBL后的第28天，可处死小鼠，检测小鼠淋巴器官人淋巴细胞地水平及功能，若指标达到要求则HuPBL-SCID鼠动物模型构建成功。
CD40是与B淋巴细胞表面特异性结合并在其表面进行表达的一类分子，二者结合后，CD40可以促进B细胞的增殖，分化和发育，进一步引起免疫球蛋白分泌增加。因此用小剂量CD40抗体在体外使B细胞活化、增殖，有利于B淋巴细胞的体内重建。
IL-15是一种造血促进因子，它可以促进NK细胞的发育、分化，促进T细胞的增殖和B细胞的成熟。其中，rhIL-15是基因重组的人IL-15，是一类促造血的细胞因子，但迄今为止，还未见报道它可以促进HuPBL在SCID鼠体内重建。
本发明将rhIL-15与CD40抗体联合使用共建HuPBL-SCID动物模型，具有重复性好，效果显著，小鼠遗传背景清楚、死亡率低，操作方法简便、安全、实验的成本较低且适合大规模动物实验的优点，实验动物模型转移效率高，重建后的T、B淋巴细胞具有完全功能，弥补了现有动物模型转移效率较低，重建效果较差的缺陷，填补了国内外对该项研究的空白。该模型将在免疫学基础研究，人类疫苗的研制，人类的病毒性疾病如HIV病原学研究，肿瘤的动物模型构建，自身免疫性疾病等多种人类疾病模型的构建等方面发挥十分重要的作用，具有良好的应用前景。
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、HuPBL-SCID鼠动物模型的构建及其T、B淋巴细胞的检测
动物：6-8周CB-17 SCID小鼠，体重20g左右，雌、雄性均可。饲养条件：在无菌条件下，饲养温度22℃，湿度55％，12小时白/昼节律，饮用水中给于适当的抗生素。
RPMI-1640完全培养基：2mM谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，20％FCS，50μg/mL链霉素，100U/mL青霉素。
一、HuPBL-SCID鼠动物模型的构建及检测
HuPBL-SCID鼠动物模型的具体构建方法，包括以下步骤：
1、SCID小鼠处理：将6-8周CB-17 SCID小鼠分为实验组和对照组，每组5只。在转输HuPBL前24小时，给每只SCID小鼠腹腔注射50μL抗ASGM1(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.Japan)，并在转输HuPBL前4小时，对每只SCID小鼠用直线加速器进行照射，照射剂量为200cGy。
2、人外周血淋巴细胞(HuPBL)的体外培养及CD40抗体刺激：从血库取HIV和HBV均呈阴性的人血液，用密度梯度离心法分离出人外周血淋巴细胞。将分离出的HuPBL分成两组，一组置于含50ng/mL CD40抗体(Cappel，West Chester，PA)的RPMI-1640完全培养基中生长，一组置于RPMI-1640完全培养基中生长(对照组)，10小时后将两组HuPBL洗涤三次，调细胞浓度为1×10⁸个/mL，备用。
3、转输HuPBL：将步骤1的实验组SCID小鼠每只腹腔注射0.5mL(5×10⁷个)步骤2中经CD40抗体刺激的HuPBL，将对照组SCID小鼠每只腹腔注射0.5mL步骤2中未经CD40抗体刺激的HuPBL。
4、rhIL-15免疫：转输后当天，给步骤3中的每只SCID小鼠腹腔注射1μg rhIL-15进行第一次免疫，rhIL-15的制备方法可参见文献(孙安源等，重组人白细胞介素15的纯化及生物活性鉴定。中国免疫学杂志2001年第17卷292-295)，此后，每隔24小时以相同剂量免疫一次，共十次，得到HuPBL-SCID鼠动物模型。
5、SCID小鼠的监测
1)体内免疫球蛋白(Ig)的检测：在转输HuPBL后的第7、14、21天，取SCID小鼠的尾静脉，采用人免疫球蛋白定量试剂盒(山东潍坊3V公司)并按照试剂盒说明书的操作流程检测SCID小鼠体内的人免疫球蛋白水平，测定免疫球蛋白G(IgG)的OD₇₀₀值和免疫球蛋白M(IgM)的OD₃₄₀值，按照标准品(试剂盒自带)的OD值做标准曲线，计算待测样品的数值，结果实验组和对照组相比IgG和IgM都有十分明显的增加，实验组IgG在21天达到2.8mg/mL，IgM达到1.5mg/mL，而相应的对照组IgG为1.1mg/mL，IgM为0.5mg/mL。
2)转输HuPBL后第28天，取实验组小鼠的外周血后处死小鼠进行解剖观察，小鼠的胸腺、淋巴结的部位长出人的胸腺和淋巴结，脾脏开始变大，小鼠并无明显的病理变化。且在小鼠血清中检测出人的免疫球蛋白，上述检测结果证明在SCID鼠体内已建成类似于人体的免疫系统，HuPBL-SCID鼠动物模型构建成功。
二、HuPBL-SCID鼠动物模型T、B淋巴细胞的检测
实验材料：在无菌条件下，取步骤一中实验组和对照组小鼠的脾脏淋巴细胞、胸腺、骨髓和淋巴结，体外分离小鼠器官淋巴细胞的方法为：先把器官剪碎，过200目不锈钢钢丝网，然后用70％和40％ Percoll分离液分离淋巴细胞，详细步骤可参考Mebius RE等论文(Transfer of primitive stem/progenitor bone marrow cells fromLT alpha-/-donors to wild-type hosts：implications for the generation ofarchitectural events in lymphoid B cell domains.J Immunol.1998；161：3836-43)。
采用流式细胞术检测分离的步骤一中实验组和对照组小鼠各器官、组织中人T、B淋巴细胞的重建效果，包括以下步骤：
1、用常规淋巴细胞表面分子检测法，使用PE标记的抗HLA-ABC(Becton，Dickinson and Company)，CY标记的抗CD3(Becton，Dickinson and Company)，FITC标记的CD19抗体(Becton，Dickinson and Company)。结果表明：实验组和对照组相比，T淋巴细胞：胸腺增加185倍，脾脏增加177倍，淋巴结增加392倍，外周血增加16倍；B淋巴细胞：脾脏增加124倍，淋巴结增加146倍，外周血增加21倍。胸腺中人淋巴细胞占总淋巴细胞的比例为59.24±4.87％，脾脏中人淋巴细胞占总淋巴细胞的比例为81.24±6.23％，淋巴结中人淋巴细胞占总淋巴细胞的比例为91.03±5.74％，骨髓中人淋巴细胞占总淋巴细胞的比例为24.09±3.79％，外周血中人淋巴细胞占总淋巴细胞的比例为21.32±5.68％。
2、PHA、LPS是T、B淋巴细胞特异性的促有丝分裂原，SCID小鼠本身没有T、B淋巴细胞，因而若经体外刺激后淋巴细胞有明显的增值，肯定是人T、B淋巴细胞的扩增。取步骤一中实验组和对照组小鼠的小鼠脾脏淋巴细胞，一部分用于FACS检测；另一部分做T、B淋巴细胞的体外扩增试验，方法为用RPMI-1640完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，取200μL细胞悬液置于96孔培养板中，对照组加入或不加入10μg/mL PHA(Sigma公司)或LPS(Sigma公司)，实验组加入或不加入10μg/mL PHA或LPS。(分别在第18、36、72小时收集PHA刺激组和其对照组培养上清，-70℃保存，用于细胞因子的测定。)培养三天后，加入1mCi(3.7×10⁴Bq)[³H]胸腺嘧啶脱氧核苷(中国科学院上海原子能技术公司)继续培养8小时，用液体闪烁计数器(LS-6500，Beckman，U.S.A)测定结果，结果如表1和表2所示：
表1 体外PHA刺激人鼠嵌合模型脾脏淋巴细胞的扩增
分组              PHA    [³H]胸腺嘧啶脱氧核苷(cpm)
对照组淋巴细胞    -              214±51
实验组淋巴细胞    -              208±63
对照组淋巴细胞    +              652±97
实验组淋巴细胞    +              2,118±248**
表2 体外LPS刺激人鼠嵌合模型脾脏淋巴细胞的扩增
分组              LPS    [³H]胸腺嘧啶脱氧核苷(cpm)
对照组淋巴细胞    -              213±32
实验组淋巴细胞    -              250±43
对照组淋巴细胞    +              628±125
实验组淋巴细胞    +              1593±269**
注：**表示显著
表1和表2数据表明，在PHA和LPS刺激下，实验组T、B淋巴细胞的增殖明显高于对照组，表明实验组人HuPBL在SCID小鼠体内重建的效果更佳。
将PHA刺激组和其对照组在第18、36、72小时收集的培养上清，用定量IL-2和IFN-γ ELISA试剂盒(RayBiotech，Inc.)并按照试剂盒说明书的操作流程检测。测定培养上清的OD值后，用标准品(试剂盒自带)绘制标准曲线，计算实验组和对照组的结果。刺激后第72小时IFN-γ实验组为548pg/mL，而对照组只有247pg/mL；刺激后第72小时IL-2实验组为329pg/mL，而对照组只有153pg/mL。在不同时间点，实验组产生的IL-2和IFN-γ都显著高于对照组，表明实验组重建后的T淋巴细胞可以分泌大量细胞因子。