基因的一个碱基置换SNP与点突变的检测方法、 检测装置及其检测芯片 技术领域
本发明涉及基因表达等方面能够检测并分析DNA基因中一个碱基置换SNP(单核苷酸多态性：人遗传密码中的变种)与点突变，即基因中一个碱基置换SNP和点突变的检测方法、检测装置及检测芯片装置。
背景技术
所谓一个碱基置换SNP就是指人的DNA在1000bp和2000bp之间其碱基序列中就有一个碱基发生变化，对于人来说不论是正常人还是病人通常认为有数十万乃至数百万个SNP，因此人们期待着它能作为一种揭开病因有效预防疾病的一种标志物。
所谓点突变就是在已知的基因中其碱基序列有一个碱基发生改变，并且由于这个碱基变化而翻译成蛋白质的功能发生异常，有时它会成为一种疾病的原因。
作为测定分析DNA基因碱基序列差异的一种手段，通常使用DNA序列测定法(决定碱基序列的方法)，PCR-SSCP(聚合酶链反应单链多态性(Polymerase chain reaction-single stranded polymorphism)法，等位基因特异杂交法，DNA芯片法等。
DNA序列测定方法有化学降解法(Maxam-Gilbert法)和Sanger双脱氧终止法(即酶法)，但现在主要使用双脱氧终止法，通过PCR法(聚合酶链反应法)使人基因待分析的片段扩增，用2种引物进行序列分析一种是使用PCR法的引物，另一种是设定在扩增DNA内地引物，从而来决定该基因片段内的基因顺序。用不同样品DNA进行这样程序操作来检测基因的一个碱基置换SNP和点突变。
PCR-SSCP(Polymerase chain reaction-single stranded polymorphism)法用PCR法扩增人基因待分析的片段，在高温下变形成为单链，并把它放在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳使PCR法扩增双链DNA中的每个单链均形成二次结构(分子内氢键)，根据泳动距离的差异检测基因的一个碱基置换SNP和点突变。
在等位基因特异杂交法中，就是通过PCR法扩增待分析基因片段，在膜(尼龙膜)的区域内制作20个左右碱基的PCR产物或寡核苷酸探针，使之标记上的放射线同位素32p样品DNA(被检DNA)进行杂交。通过调控杂交温度等条件，根据放射性同位素的强弱之差来检测基因的一个碱基置换SNP和点突变。
DNA芯片法其原理几乎与等位基因特异杂交法一样，就是将20个左右碱基的PCR产物或寡核苷酸探针固定在一定的位置上(基盘上)，使之标记荧光的DNA样品(被检DNA)进行杂交。通过调控杂交温度等条件，根据荧光强弱之差来检测人基因的一个碱基置换SNP和点突变。
当进行等位基因特异杂交法中的杂交时为了用放射性同位素标记DNA，使用放射性同位素和保存放射性同位素都需要非常大的开支。当进行DNA芯片法时，用荧光色素标记时，由于荧光色素有很大的分子结构即使足够的频率也无法遮盖住DNA，所以荧光标记探针的荧光强度不高，另外荧光的退色及在基盘上如玻璃等上沾有的荧光色素(一部分背景有荧光)都将成为问题。
为了解决上述几个问题，在特开平9-288080号公报及第57次分析化学讨论会论文集(P137-138,1996年)公开了一种方法，其方法既简单又具有高度灵敏性，它是用来检测DNA杂化物的形成和检测双链DNA的方法，即把探针DNA固定于电极上，在嵌入体存在的情况下使这个探针DNA与样品DNA反应，通过电化学作用检测双链DNA并检测杂化物。
但是，基因的一个碱基置换SNP和基因突变的数量之大，例如就人来说，为了制作15KB密度(分辨率)的一个碱基置换SNP基因图，必须至少鉴定200万个碱基置换SNP。而且有关已知疾病的基因点突变数目极其多。把所有的一个碱基置换SNP和点突变网罗起来分析用现有的方法几乎是无法实现的。
本发明的目的就是为了解决上述的问题，以多个样品DNA为研究对象，提供一种一个碱基置换SNP和点突变的装置，它可以检测并分析大量的碱基置换SNP和点突变，既能快速大量处理又能高度灵敏性地进行检测和分析。也就是说，本发明就是要基于在特开平9-288080号公报记载的电化学进行双链DNA检测与杂化体的检测的原理，实现一种大量且高度敏感性地检测和分析一个碱基置换SNP和点突变的检测和分析装置。
发明的概述
本发明为了解决上述课题，提供一种用于基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测芯片，包括：能够添加和除去样品DNA的密闭内部空间，在该空间底部形成的测定电极即多个金电极，在所述空间部配置的不与所述金电极接触的对极即共同电极；在所述金电极上，固定有不同基因序列所形成的PCR产物或寡核苷酸，在所述共同电极和所述金电板之间施加电压，能够测出电流。
为了解决上述课题，本发明还提供一种基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测装置，包括：能够添加和除去样品DNA的密闭内部空间，在该空间底部形成的多个金电极，在所述空间部配置的、不与所述金电极接触的共同电极，可在所述共同电极和所述金电极之间施加电压并能够测出电流的测定装置；在所述金电极上，固定有不同基因序列所形成的PCR产物或寡核苷酸。
也可以将所述内部空间、所述金电极和所述共同电极都包含在检测芯片内，使所述检测芯片能够拆装自如地安装在上述检测装置上，并能与其电连接。
也可以通过珀耳帖(Peltier)元件变换所述检测芯片的温度，控制上述杂交温度条件。
为了解决上述课题，本发明提供一种基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测方法，其方法为，在空间部内添加样品DNA或从样品DNA扩增的基因DNA，使之进行杂交形成双链，再向上述空间部内添加含有电化学活性分子的电解质，调控温度使电化学活性分子与上述双链结合，在所述共同电极和所述金电极之间施加电压，检测流过的电流值，从而检测样品DNA的一个碱基置换SNP和点突变。
附图的简要说明
图1是说明本发明的检测基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测装置的实施例的整体构造的立体图；
图2是说明本发明的用于检测基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测芯片的实施例的整体构造的立体图；
图3是说明图2的检测芯片的使用状态的立体图；
图4是用于说明本发明的基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测装置及检测芯片的电极及配线等的结构的图。
本发明的最佳实施方式
为了更详细地阐述本发明，按照实施例参照附图进行说明。
本发明基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测方法、检测装置以及检测芯片的实施方式如图1所示，本发明基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测装置1由杂交用检测芯片2和测定装置3构成，其测定装置3把检测芯片2插入之后，可以检测分析杂交形成的双链DNA。
在图2中，检测芯片2由陶瓷或合成树脂材料等形成卡式或盒式芯片，它由主体部4和自上方装在该主体部4上的上盖5(图中用假想线表示)构成。该检测芯片2用抗酸性及抗碱性的材料作成，特别优选的是上盖5是透明的，从外面可以观察到内部。
在主体部4的大致中央处，形成有长方形的凹槽6。将上盖5装在主体部4上而形成一体时，该凹槽部分就成为密闭的空间部S。在空间部S的底面，即在凹槽6的底面7上，距阵状排列、蒸镀金的点，形成一种由多个金电极8构成的阵列金电极9。
图2的右侧显示金电极8的放大图，如该放大图所示，对于PCR产物、5′末端寡核苷酸来说，巯基化导入SH基使之成为SH化寡核苷酸10，它被固定在金电极8上。PCR产物是双链DNA，使一条链5′末端巯基化，导入SH基的该寡核苷酸有20-50个碱基长度，通过导入其基端的巯基被固定在金电极8上。
在检测芯片2的端部11上并排设有多个终端端子12。金电极8分别与配线13连结，该配线的另一端又分别与各终端端子12相连。
如图4(a)所示，与金电极9相对的配线也可以一根一根地与金电极8对应连接，并各自与终端端子12相连，如图4(b)所示，它采用矩阵配线结构，作为用于液晶显示装置的、由多个纵、横导线14、15构成的格子状配线，与分别近接阵列状配置的金电极9的纵、横导线连接。此时，纵、横导线的一端与终端端子12连接。
在本实施例中，对极即共同电极16配列在不与金电极9相接的位置上，该金电极9在凹槽6的底面上形成距阵状排列。共同电极16的配线同金电极一样由金的蒸镀而形成。共同电极16与共同电极用终端端子17相连。进而各金电极9与对极即共同电极16之间的电流值以参照电极28的值为基准进行测定，形成每次测定均能得到正确的电流值的结构。其中参照电极28以与凹槽6内部空间连接的方式配线。
在检测芯片2的主体部4和上盖5的两侧，形成有与凹槽6连通的左右注入孔18、19(参照图2中的上方所表示的放大图)，这个注入孔通常由栓塞塞住，形成密闭空间S。可取下栓塞将配置的注射器20、21插入该注入孔18、19。由此，可迅速将溶液注入由凹槽6和上盖5形成的密闭空间部S内，或者迅速更换或混合空间部S内的溶液。
测定装置3有用于插入检测芯片2的插入口22。如图4(c)所示，在插入口22的内部，配设有与共同电极用终端端子17及各个金电极用终端端子12连接并向共同电极用终端端子17及各个金电极用终端端子12施加电压的电路23。当在共同电极用终端端子17及各个金电极用终端端子12之间施加电压时，可用电路23上设置的检测器24测定共同电极16和各个金电极8之间的电流。
基于该检测的电流的测定数据，由与检测器24连接的A-D转换器25等数字化，通过微机26用作进行样品的分析鉴定等的处理数据。在测定装置3上还装有由珀耳帖元件构成的温度调控装置。
下面，说明上述结构构成的本发明的基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测装置1的作用。检测芯片2由上盖体结合在主体部4而形成密闭结构。如图3所示，将注射器20、21插入注入孔18、19，注入包含样品DNA的溶液。
又，样品DNA是从生物材料中提取出来的DNA经过DNA分解酶或超声波处理而形成的，或者是在特定基因上通过PCR(聚合酶链反应法)扩增的DNA。这些样品DNA在将要杂交之前要进行高温处理使之变性。
在被固定的PCR产物或寡核苷酸DNA(单链)上加上样品DNA(单链)时，具有互补的碱基的PCR产物或寡核苷酸DNA和样品DNA就会进行杂交。这时，把检测芯片2插入安装到测定装置3内的插入口22，通过测定装置3内装有的珀耳帖元件调控温度，将其调节到适合杂交的温度条件。
该杂交进行完了后，将检测芯片2从测定装置3拔出，用注射器从一侧的注入孔18注入洗净液，再从另一侧的注入孔19把空间部S内的液体抽空，将没有进行杂交的样品DNA冲洗掉。
经过这种冲洗之后，将含有电化学活性分子的电解质溶液用注射器从注入孔18、19注入到空间部S内。电化学活性分子的作用是通过杂交使双链DNA的电阻值等电学性质发生变化。关于这一点在特开平9-288080号公报上已有详细的阐述。
将这样处理后的检测芯片2再次装到测定装置3中，将检测芯片2的共同电极用终端端子17及各金电极用终端端子12连接到电压电路23，若在共同电极16和各金电极8之间施加弱电压时，在与杂交产生的双链DNA连接的金电极8上通过电路23及共同电极16有微弱电流流过。通过测定装置3内的珀耳帖元件调节温度，测定不同温度下的电流值。
如图4(c)所示，在测定装置3中通过对各金电极端子12自动切换扫描端子27，使电流依次流过杂交后的双链DNA并检测出该电流，把该检测结果通过A-D转换器转换为数字数据，由微机作为测定数据储存到存储器等中。根据该测定数据进行样品DNA的鉴定和分析。例如通过与事先被储存的各种DNA数据等进行比较就可以分析和鉴定样品DNA。
下面，说明本发明的基因的碱基置换、点突变等电化学检测装置的实施例。
首先说明实施例1。
在基因p53的第72个位点密码子中显示一个碱基置换SNP检测的实施例。寡核苷酸具有相当于以下2种多态性(遗传的多态性)的碱基序列，将该寡核苷酸通过各金电极的点进行固定。
p53Pro(第72个位点密码子为Pro)
p53Arg(第72个位点密码子为Arg)
p53的第72个位点密码子为Pro的、从正常人末梢血液中采取的DNA和扩增PCR产物，经过高温变性后进行杂交反应，该PCR产物是从这个DNA扩增的片段，它包括p53外显子4中的密码子72。电解质溶液用0.1MAcOH-AcOK(pH5.6),0.1M KCl,0.05mM NFc，在20度下测定470mV(Ag/AgCl参照电极标准)杂交前后电流值的变化。
从末梢血液中采取的DNA
p53Pro的电流变化(％)52％
p53Arg的电流变化(％)15％
PCR产物
p53Pro的电流变化(％)65％
p53Arg的电流变化(％)13％
同样地，p53的第72个位点密码子为Arg的、从正常人末梢血液中采取的DNA和扩增PCR产物进行杂交反应，其中，该PCR产物是从这个DNA扩增的片段，它包括p53外显子4中的密码子72。
从末梢血液中采取的DNA
p53Pro的电流变化(％)46％
p53Arg的电流变化(％)17％
PCR产物
p53Pro的电流变化(％)53％
p53Arg的电流变化(％)11％
这些电流变化在碱基序列完全匹配和配误时有明显的变化。
下面，说明实施例2。
该实施例中，由于碱基置换数的不同所测定的电流值不同，由此，匹配错误的量是可以测定的。把dT20,dT10dAdT9,dT8dA4dT8,dAdT19,dT3dT17,dT19dA,dT17dA3七种寡核苷酸分别固定于金电极的各点上。将dA20进行杂交反应。
电解质溶液用0.1M AcOH-AcOK(pH5.6),0.1M KCl,0.05mM NFc，在20度下，以470mV(Ag/AgCl参照电极标准)测定杂交前后电流值的变化。其测定结果如表1所示。
(表1)dT20 dT10dAdT9 dT8dA4dT8 dAdT19 dA3dT17 dT19dA dT17dA3电流变化(％) 37 22 15 14 14 20 12Tm(度) 46 36 21 45 46 42 41
表1中的电流变化几乎是依赖于碱基匹配错误量的变化。尤其在末端存在匹配错误时，看到了大于Tm值的变化。在以前的SSCP中这样的检测是无法进行的，本方法为第一次搞清。
工业上的可利用性
本发明的基因中一个碱基置换SNP和点突变的检测方法、检测装置以及检测芯片的结构如上述所述，故可以多个样品DNA为对象，高灵敏度地检测分析大量的一个碱基置换SNP和点突变。
本发明的检测装置具有高度灵敏性又能大量快速进行处理，在生物学、医学领域方面，能有效地进行与基因及其表达性状有关的分析。通过本发明的一个碱基置换SNP和点突变的检测、分析装置进行分析，可以将药物代谢酶、癌抑制基因等特定基因用于基因诊断领域。
例如在本发明的检测装置中，其装置具有高灵敏度并能大量快速进行处理，故可收集日本人的一个碱基置换SNP和点突变的数据，对与病症相关的一个碱基置换SNP和点突变进行鉴定，有助于癌症、高血压等成年人病的预防等。