对实施方案的描述
1.将与HLA I类信号肽融合的并连接于人CD4功能区3和4的水蛭
素束缚在细胞膜上
为了在哺乳动物的细胞中表达异种的水蛭素构建物，应用重叠延伸
的PCR技术，使来自人HLA I类A2.1，氨基酸-1至-24(Holmes.
1987)的膜定向性信号肽前导序列与水蛭素变异体1(Dodr，1984)
融合(图1)。
用如下引物扩增了此HLA A2.1前导序列：
5′-cagtgtcgacggatccatggccgtcatggcgccccga-3′[hla-1]<SEQ ID 1>
(导入SalI和BamHI限制性位点)和：
5′-gtcagtgtaaacaaccgcccaggtctgggtcagg-3′ <SEQ ID 2>
用如下引物扩增hirudin序列：
5′-acccagacctgggcggttgtttacactgactgcacc-3′及 <SEQ ID 3>
5′-gacgctgcagaattcttgcaggtattcnccgggatt-3′[hir-3] <SEQ ID 4>
(导入末端EcoRI和PstI位点)。
借助于琼脂糖凝胶电泳纯化所得到的PCR产物(108和228bp)，然
后用于第三次PCR，使用侧翼引物hla-1和hir-3。对形成的PCR产物
(300 bp)用SaII和BamHI消化，并亚克隆进入pBluescript SK(+)
(Stratagene)。
将由编码CD4功能区3和4(Maddon，1985)的cDNA组成的锚
定体，连同转移终止序列(ST)，CD4(CD4166-435)的跨膜功能区
和细胞质功能区一起，加入到HLA-水蛭素盒中。
但是，为确保当以其C-末端连接于此CD4锚定体时，水蛭素能
保持可移动性并有活性，制备了如下3段不同的甘氨酸接头(称为G1、
G2、G3-图1A)：
-甘氨酸接头1(G1：GGSGG)，此寡核甘酸对是由5′-
aattaggaggttctggaggctgca-3′<SEQ ID 5>(含有突变的EcoRI识别序
列和PstI位点)和5′-gcctccagaacctcct-3′<SEQ ID 6>组成；
-甘氨酸接头2(G2)和接头3(G3)是分别由重复2次或3
次的核心序列(GGSGG)组成。
将这3段接头导入HLA-水蛭素片断的3′末端。
在插入CD4锚定体之前将这些甘氨酸接头寡核苷酸退火，并分别
连接进入包含HLA-水蛭素盒的质粒EcoRI/PstI位点中。
用如下引物扩增了CD4166-435：
5′-tgtctgcaggaaccagaagaaggtggaattca-3′ <SEQ ID 7>
(导入PstI和EcoRI位点)和：
5′-gtgggatccgcctggcctcgtgcctcaa-3′ <SEQ ID 8>
(含有一个末端BamHI)。
将形成的PCR产物克隆进入pBluescript并测序。在CD4166-435中，
发现V328突变成A328。将PstI/BamHI CD4片断亚克隆进入HLA-水
蛭素-Gl，-G2，和-G3质粒，并且通过DNA序列分析核实这些
构建物。
将此3个cDNA构建物的每一个亚克隆进入哺乳动物表达载体
pHβActpr-l gpt(Gunning，1987)的BamHI位点，此载体包含有人β
-肌动蛋白增强子和启动子区，以及驱动gpt抗性基因的SV40增强子
成分，使之可在霉酚酸存在下对克隆进行选择(图1C和1D)。通过
限制性内切酶基因定位测定核实了最终构建物的取向。
按照标准的程序，以磷酸钙将包含有单独HLA-水蛭素-G1/2/3
-CD4构建物的载体转移进入小鼠成纤维细胞DAP.3品系
(Merguelies.1983)。在以5％胎牛血清，氨苄青霉素，链霉素和谷
氨酰胺补充的DMEM培养基(Gibco)中培养生长18小时之后，用甘
油处理细胞30分钟。然后用磷酸缓冲盐水(PBS)洗细胞2次。再加
入含有黄嘌呤，次黄嘌呤和霉酚酸达最后浓12μg/ml的新鲜培养基。
对于阴性对照，是使以表达HLA-DR的人II类构建物转染的
DAP.3细胞(细胞品系513)(Lechler，1988)，培养生长在含有霉
酚酸的相同培养基内。
分别用鼠单克隆抗体4185-81-7(Schlaeppi，1991)和OKT
-4(Reinherz，1979)，借助于FACS(荧光激活细胞分类法)检测
了存活的克隆对水蛭素和CD4的表达。在冰浴上用鼠抗体对105个细胞
染色30分钟，并加入FITC-结合标记的羊抗小鼠多克隆抗体作为第二
抗体。
如在图2中所显示，在DAP.3细胞表面，这些水蛭素-CD4构建
物很好地被表达了。在具有3个不同长度甘氨酸接头的水蛭素-CD4
之间，未检测出表达水平有任何显著性差异。
因此，抗凝血多肽可在细胞表面稳定地被表达。
2.在CHO-K1细胞表面表达具有来自P-选择素C-末端的定向
序列的水蛭素-CD4。
除HLA-水蛭素-G1/2/3-CD4构建物之外，还构建了具有来自
人P-选择素的定向序列的另外二个构建物(图1B)。来自CD4的跨
膜区被用于这些构建物，同时用来自P-选择素的相应序列(Johnston，
1989)代替了转移终止序列和C-末端。
为了将CD4功能区3和4加跨膜区(CD4166-395)融合于人P-
选择素(P-sel754-789)的转移终止序列和细胞质1区和2区(McEver，
1989)，实施了重叠延伸的PCR反应。为了扩增此分子的CD4部分，
使用了如下引物：
5′-tgtctgcaggaaccagaagaaggtggaattca-3′[CD4-5] <SEQ ID 7>
(导入PstI和EcoRI限制性位点)和：
5′-gtctgaaacgctttctgaagaagatgcctagcccaatgaaaagcaggaggccg-3′<SEQ ID 9>
平行地，为了扩增P-选择素的C-末端区，使用了如下引物(导入一
个末端BamHI位点)：
5′-tgggctaggcatcttcttcagaaagcgtttcagacaaaaaga-3′and <SEQ ID 10>
5′-gaccaggatccggacaggtctctta-3′[P-selN3] <SEQ ID 11>
以琼脂糖凝胶纯化所形成的PCR产物之后，用侧翼引物CD4-5
和P-selN3实施了第三次PCR。用PstI和BamHI消化所形成的PCR
产物(832bp)，亚克隆进入pBluescript并进行测序。然后，用PstI/BamHI
切割此CD4-P-sel片断(CD4166-395-P-sel754-789)，并亚克
隆进入含有HLA-水蛭素G1或G2的质粒。
将最后的HLA-水蛭素-G1/G2-CD4-P-选择素构建物亚克
隆进入pHβActpr-lgpt的BamHI位点，并被转染进入CHO-K1细胞
(ATCC CCL 61)，在以5％胎牛血清，氨苄青霉素，链霉素和谷
氨酰胺补充的RPMI 1640培养基(Gibco)中培养此细胞。
通过电穿孔法，按照标准的程序进行了转染。简单地说，将5×106
个细胞再悬浮于350ml无血清培养基中，并转移至1ml的电穿孔小杯
中，电极(Bio-Rad)间的距离为0.4cm。在150ml内加入10μl质粒
DNA之后，将样品缓慢地搅拌并保持在冰浴中。在基因脉冲发生仅
(Bio-Rad)中以无穷大电阻，960μF和350V使细胞经受电穿孔作用。
电穿孔后的次日，用PBS洗细胞，并加入包含有霉酚酸，黄嘌呤和次黄
嘌呤的新鲜培养基。
最近发现，当用P-选择素cDNA转染CHO-K1细胞时，细胞
内没有聚积P-选择素蛋白，而是被表达在细胞表面(Disdier，1992)。
如通过用OKT-4和4158-81-7单克隆染色可断定(图3)，对
于上述产生的CHO-K1转染子，水蛭素-G1-CD4-P-选择素
和水蛭素-G2-CD4-P-选择素都在其表面表达了，使用的阴性对
照是CHO-K1细胞系，它表达融合CD4功能区3和4的TFPI(TFPI
-CD4166-435)，培养在含有霉酚酸的相同培养基内。
用完整长度的人P-选择素转染CHO-K1细胞(Johnston，1989)
作为阳性对照，此P-选择素是作为3142bp的SalI片断被亚克隆进入
包含有SV40-驱动的新霉素(G418)抗性基因的pHβActpr-lneo中。
用400μg/ml的G418处理这些细胞，2周后用棉拭子挑出单独的克隆，
转移至12孔培养板内。用10μg/ml的4158-81-7和未稀释的OKT
-4杂交瘤上清液，分析了存活克隆对水蛭素和CD4的表达。
用抗-CD62 mAb(Becton Dickinson)按照制造商的建议，
对人P-选择素进行了检测。对于这些CD62-标记的细胞，观察到与
使用水蛭素-CD4-P-选择素相类似的FACS分布图(图3E)，证
实CHO-K1细胞在质膜可表达P-选择素。
因此，当在细胞表面表达时，含有P-选择素定向序列的嵌合蛋白
质仍然具有功能作用。
3.如以特异性抗体所检测的，锚定在细胞表面的水蛭素可结合凝血酶
为了测定以这种方式束缚于细胞表面的水蛭素是否仍保持其凝血
酶结合活性，采用了如下的结合试验。
每次实验之前，将稳定转染的细胞在T75培养摇瓶中培养36小时。
用细胞剥离器脱离下DAP.3细胞，而通过用PBS，5mM EDTA在37
℃处理10分钟，使CHO-K1细胞与塑料瓶分离。细胞用含有0.1％
BSA(w/v)的PBS洗4次之后，将150μl 2.5×105个细胞在37℃
同递增浓度的凝血酶共温育1小时。用含有0.1％ BSA的PBS洗此细
胞4次，并在冰浴上同兔抗-人凝血酶原免疫球蛋白(100μl中
10μg/ml)(Dakopatts)再孵育30分钟。再洗2次之后，将细胞同FITC
-标记的猪抗-兔免疫球蛋白(Dakopatts)共温育30分钟。最后，将
转染子洗3次，并用流式细胞仅进行分析。
如图4所显示，在细胞表面表达的水蛭素保持了结合凝血酶的能
力，甘氨酸接头长度不影响对凝血酶的结合。
为了测定饱和水蛭素-CD4表达细胞所需的凝血酶量，将2个克
隆同最高达82U/ml的凝血酶共温育。当分析阳性细胞百分数时，可见
转染子在41U/ml凝血酶含量下被饱和(图4C)。但是，根据平均荧光
强度(mfi)，即使在82U/ml细胞也未被饱和(图4D)。在这些实验
性高凝血酶浓度下，对表达HLA-DR的对照细胞的背景结合也显著
增加了。
为了进一步阐明凝血酶对水蛭素-CD4结合的特异性，进行了如
下阻断实验。将DAP.3 HLA-水蛭素-G3-CD4转染子同10μg/ml
的抗-水蛭素mAb或适当的对照(小鼠IgG1和IgG2a，Dakopats)，
在冰浴中共同预孵育30分钟，在含有0.1％ BSA的PBS中洗2次后，
如上述同凝血酶在37℃共温育1小时。同上述对凝血酶的结合进行了
分析。
同4158-81-7的预温育抑制了凝血酶对水蛭素-CD4的特异
性结合(图5A)。通过同凝血酶共温育，以及以mAb 4107-76-1
(Schlaeppi，1991)和抗-凝血酶原免疫球蛋白的标记比较，证明了水
蛭素-CD4对凝血酶的结合。4107-76-1定向针对水蛭素-凝血
酶复合物，检测到未结合凝血酶的水蛭素和凝血酶都不与内源性凝血酶
受体结合。如图5B所示，以4107-76-1检测的凝血酶结合类似于
以抗-凝血酶原免疫球蛋白组分所观察到的结合。
因此，在DAP.3细胞表面表达的水蛭素保持了对凝血酶的特异性结
合。
按同样的方式以水蛭素-CD4转染猪的永生化上皮细胞
(IPEC)。如图15A所示，只有转染的细胞结合凝血酶，并且这种结
合可被4158-81-7以剂量依赖性方式所阻断(图15B)。应用人血
浆再钙化试验系统进一步研究了在IPEC上表达，表面束缚的水蛭素的
功能作用。如图15C所示，与不存在细胞的对照血凝结时间370秒相比
较，未转染的IPEC使再钙化血浆的凝结时间缩短至大约170秒。同诱
导TF表达的IL-1预温育进一步使凝血时间减少至100秒以下。与之
相反，转染的IPEC使凝血时间延长，即使是同诱导TF表达的IL-1
预温育之后也是如此。同4158-81-7共温育则以剂量依赖性方式降
低了这种抗凝血作用，表明此作用是由于存在细胞表面水蛭素(图
15D)。
因此，在IPEC表面表达的水蛭素可结合凝血酶，并且也能抑制人
血浆凝结。
4.CHO-K1细胞表达的水蛭素-CD4-P-选择素对凝血酶的结合
为了探查水蛭素-CD4-P-选择素当被表达在CHO-K1细胞
表面时是否也能结合凝血酶，将这些细胞同凝血酶在37℃共温育1小
时。用抗-凝血酶原免疫球蛋白染色，并加上FiTC-标记的第二抗体
层之后，借助于流式细胞仪对细胞进行分析。
检测出完全不同的结合曲线，如图6A所示。以抗-凝血酶原免疫
球蛋白，在同相当低浓度的凝血酶共温育之后，可检测出凝血酶对表达
与CD4连接的不相干蛋白质的CHO-K1细胞的本底结合。但是，通
过以特异性抗-水蛭素/凝血酶mAb 4107-76-1染色，证实了凝血
酶对水蛭素的特异性结合(图6B)。以这种抗体，未能测定出对照CHO
-K1细胞的本底结合。图6还表明，表达水蛭素的克隆显示有对凝血
酶不同程度的非特异性结合，意味着它们对内源性凝血酶受体具有不同
的表达水平。用其它几个克隆证实了这种非特异性结合的变化。
为了比较，将来自表达水蛭素-G1-CD4和水蛭素-G2-CD4
(即无P-选择素序列)的二个CHO-K1转染子的结果显示在图6C
和6D中。与表达连接于CD4-P-选择素锚定器的水蛭素的转染子相
比较，除了由于对嵌合蛋白质较好的表达，凝血酶的结合稍有增加(较
高的mfi)之外，未检测出结合曲线有任何大的差异。
5.水蛭素-CD4-P-选择素被贮存在分泌颗粒中，激活时可被释
放出。
为了测定水蛭素在细胞内的积蓄和它从分泌颗粒到细胞表面的路
径，以编码水蛭素-CD4-P-选择素或水蛭素-CD4的cDNA瞬时
地转染了分泌性鼠垂体细胞系(D16/16)。出于二个理由选择了这个
细胞系。第一，已知这些细胞在特殊的贮存颗粒内表达ACTH，用佛波
醇酯激活时，在细胞表面释放出ACTH。第二，在体外培养过程中内皮
细胞(这种细胞对于研究P-选择素构建物的细胞内定向似乎是理想的
细胞类型)会迅速地丧失其Weibel-Palede贮存颗粒。
转染后48小时，以抗水蛭素和抗ACTH抗体对D16/16细胞染色。
在以水蛭素-CD4-P-选择素转染的细胞内，发现水蛭素在颗粒内
均匀地分布在细胞质中(图16A)。以ACTH-特异染色时，观察到
同样的颗粒分布形式，表明了与水蛭素的共-定位(图16B)。用二种
抗体同时染色时证实了这点(图16C)。
相比之下，以水蛭素-CD4转染的D16/16细胞不将水蛭素积蓄在
细胞内的颗粒中，而是在细胞表面表达了高水平的水蛭素(图16D)。
双重染色(图16F)仅显示有水蛭素和ACTH的少量共-定位。
用佛波醇酯PMA激活表达水蛭素-CD4-P-选择素的细胞，并
借助于流式细胞术进行了分析。对于未受刺激的细胞4158-81-7不
能在细胞表面检测出水蛭素(图17A)。但是在PMA刺激30分钟之
后，在细胞表面检测出了水蛭素(图17B)。而且，激活的D16/16细
胞可特异性地与凝血酶结合，不同于未激活细胞(图17C-以4107-
76-1染色的)。
因此，通过应用含有颗粒的垂体细胞系D16/16，清楚地证明，水
蛭素-CD4-P-选择素可被定位于特定的细胞内贮存颗粒中，并且
激活时在细胞表面可释放和暴露出功能性嵌合分子。
6.当使凝血酶催化位点失活时可消除凝血酶和水蛭素-CD4之间的相
互作用。
已明了凝血酶对带有和不带有P-选择素定向序列的水蛭素-
CD4的特异性结合(图4和6)。为了进一步增强凝血酶-水蛭素相互
作用的特异性，将凝血酶(210nmol，在50μl Tris-缓冲盐水(TBS)
中，含0.1％ BSA，pH7.4)同如下成分在37℃预温育1小时：
-天然的全长水蛭素(Biopharm)，以10倍摩尔过量：
-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮二盐酸化物(“PPACK-HCl”)
(Calbiochem)，以100倍摩尔过量；或者
-合成的含有水蛭素残基53-64的C-端水蛭素十二肽类似物，
带有硫酸根合-Try64(Amertican Diagnostica)，以100倍摩尔过
量。
用一个小的生色寡肽底物(H-D-Phe-Pip-Arg-
pNA·2HCl(“S-2238”)(Quadratech)分析凝血酶依赖性催
化活性。
为了确定凝血酶是否已被PPACK-HCl和水蛭素失活，将5μl每
种反应混合物用95ml TBS，0.1％BSA稀释，同50μl 4mM S-
2238在37℃共温育10分钟。
如所预料的，与不加抑制剂温育的凝血酶相比较，对于同PPACK
-HCl或水蛭素共温育的凝血酶未观察到任何颜色改变，另一方面，如
通过S-2238的断裂作用所测定的，此十二肽不影响凝血酶依赖性催
化活性。
将这三种不同的制备物加到表达束缚于细胞表面的水蛭素的转染
子中。应用上述的程序，用抗-凝血酶抗体或抗-水蛭素-凝血酶抗
体，对凝血酶的结合进行了检测。如从图7A可见，以水蛭素或PPACK
-HCl失活的凝血酶，没有被在DAP.3细胞表面所表达的水蛭素结合。
此外，只观察到凝血酶-十二肽复合物的部分结合。与DAP.3转染子不
同，CHO-K1细胞显示了相对较高的凝血酶-PPACK-HCl结合(图
7B)。发现这种相互作用是非特异性的，如用抗-水蛭素-凝血酶mAb
4107-76-1所显示的。未检测到凝血酶-PPACK-HCl-水蛭素
的特异性结合。
这证实水蛭素已特异性地束缚在细胞表面，并且在凝血酶的催化位
点与它强烈地结合。
7.在细胞表面表达锚定于CD4功能区的全长和截短的TFPI。
为了使TFPI束缚在细胞膜上，将由人CD4166-435组成的融合蛋白连
接于包含所有3个Kunitz功能区的全长TFPI(TFPI1-276)，或者连
接于缺少了Kunitz功能区III和C-末端的TFPI截短形式(TFPI1-183)
(Wun，1988)(图8)。按类似于上述用于水蛭素的路径，通过应用
盒式克隆方案将TFPI和CD4序列融合，进行了这些合成，但是不同于
水蛭素，TFPI是哺乳动物蛋白质，因此含有内源性信号肽。
用如下引物扩增了编码TFPI的N-末端部分的DNA，此TFPI包
含有Kunitz功能区I和II(675bp)：
5′-catcgtcgacggatcctagatgatttacacaatgaagaaagtacatgcactttgggc-3′ <SEQ ID 12>
(导入SalI和BamHI限制性位点)；和
5′-ggacctgcagaattcaaaaaggctgg-3′ <SEQ ID 13>
(包含EcoRI和PstI位点)
用如下引物扩增了编码Kunitz第III功能区连同TFPI C-末端
(315bp)的DNA：
5′-agcctttttgaattccacggtccctcat-3′ <SEQ ID 14>
(具有EcoRI位点)，和
5′-cattgctataacaactgcagatatttttaac-3′ <SEQ ID 15>
(含有PstI位点)。
如上所述扩增了CD4166-435。
通过将限制性位点导入TFPI183 cDNA的3′末端和TFPI184-276
cDNA的5′末端，在重组体融合蛋白中H184和G185被突变成C184和R185
(图8)。而且P186被突变成S186。通过导入PstI位点除去了TFPI的
终止密码子，因此使M276突变成I276，并加入了氨基酸C277。在将PstI
位点导入CD4功能区3 N-末端的过程中，L164和Q165被分别突变成
C164和R165。发现TFPI184-276 cDNA中K265被突变成E265，CD4166-435
中V328被突变成A328(如上所述)
将所有的PCR产物克隆进入pBluescrpt SK(+)。
将全部TFPI-CD4 cDNA连接进入pHβActpr-1gpt表达载体
的BamHI位点。
如上面所述，借助于磷酸钙对保持在补充DMEM中的DAP.3进行
了转染。通过FACS法，用10μg/ml的鼠抗-人TFPI mAb 4903或4904
(American Diagnostica)以及未稀释的OKT-4杂交瘤上清液
(Reinherz，1979)，分析了克隆对TFPI和CD4的表达。4903是针对
Kunitz功能区I的，而4904针对Kunitz功能区II。如上所述，每个样
品用105个细胞进行分析，用细胞系531作为对照。
如图9所示，细胞表面既能表达TFPI1-276-CD4也能表达
TFPI1- 183-CD4。
8.束缚在细胞表面的TFPI1-183-CD4和TFPI1-276-CD4能与FXa结合
为了测定以此方法束缚于细胞表面的TFPI是否保持其FXa结合活
性，采用了如下的结合试验：
通过以PBS，5mM EDTA在37℃处理10分钟，分离出被稳定
转染的DAP.3细胞。以过量PBS，0.1％ BSA(w/v)洗细胞之后，将100μl
中的2.5×105个细胞同递增浓度的FXa在37℃共温育1小时。
然后洗细胞2次，在冰浴上用100μl 10μg/ml的兔抗-人FXa免
疫球蛋白(RAFX-IG，Enzyme Research Laboratories)再共温
育30分钟。再洗2次之后，将细胞同FITC-标记的猪抗兔多克隆免疫
球蛋白共温育30分钟，并借助于流式细胞仪分析。
如图10中所示，在细胞表面表达TFPI1-276-CD4和TFPI1-183-
CD4的DAP.3细胞，以剂量-依赖性方式强烈地结合FXa(图10)，
在0.02nM就可检测到显著的结合。在全长TFPI-CD4和截短的TFPI
-CD4之间，未发现对FXa结合有任何差异。
还可能用多克隆抗-TFPI免疫球蛋白组分(4901)或者用单克隆
4903和4904阻断对FXa的结合。
在冰浴上将细胞同递增浓度的4901，4903或4904共温育30分
钟，用抗-血红蛋白抗血清(Dakopatts)作阴性对照。然后在PBS，
0.1％ BSA中洗细胞2次，同5nM FXa 37℃共温育1小时。然后
再洗细胞，如上述同RAFX-IG共温育，并通过FACS法分析FXa的
结合。
与同无关的抗-血红蛋白多克隆对照共温育的细胞相比较，在
10μg/ml和80μg/ml多克隆4901下FXa对TFPI1-276-CD4的结合分别
降低了27％和55％(图11A)。还发现对于同4901预温育的
TFPI1- 183-CD4细胞FXa的结合降低了(图11B)。
与同种型-匹配的小鼠免疫球蛋白相比较，当用4903或4904阻断
TFPI1-276-CD4时，在40μg/ml mAb下观察到FXa结合降低了33％
(图12)。在mAb4903和4904之间未发现其阻断活性的的差异。
这首次证明，当作为膜结合的融合蛋白被表达时，TFPI仍保持其
Fxa结合活性。
9.TFPI1-183-CD4和TFPI1-276-CD4都具有抗FXa功能活性
为了测定束缚于细胞表面的TFPI是否保持了其抑制FXa功能作用
的能力，应用生色底物N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-PNA·2HCl(“S-
2765”)(Quadratech)分析FXa的蛋白水解活性。
如前面所述分离出转染的DAP.3细胞，用过量的TBS，pH7.4，
0.1％BSA洗4次。每孔加入0.5×106个细胞(在100μl)，与不同
浓度的Fxa在37℃共温育1小时。加入50μl 4mM S-2765，在37
℃再温育2小时。每30秒测定一次OD405值，确定达到OD405＝0.1所
需的时间，表明仍具有FXa活性。
所表达的TFPI-CD4以剂量依赖性方式抑制了FXa活性，发现加
入低浓度FXa(0.16nM)时具有最大的抑制作用(图13)。在一系
列实验中，未观察到在表达TFPI1-183-CD4或TFPI1-276-CD4的细胞
之间，FXa抑制作用的任何显著的差异。
因此，当束缚于细胞表面不论在TFPI1-183-CD4还是在TFPI1-276
-CD4表达细胞表面，Kunitz功能区II仍保持有功能作用。
10.TF1-129/FVIIa复合物的结合作用与Kunitz第III功能区的存在无关
组织因子和因子VIIa的结合可用于证实Kunitz功能区I是否也保
持有功能作用。
分别在E.Coli和CHO-K1中产生了重组人TF1-129和FVIIa
(O′Brien，1994)。以等摩尔浓度将它们混合，并在25℃温育15分
钟，获得TF1-129/FVIIa复合物。
按标准方法制备了兔抗-人TF多克隆免疫球蛋白。
将表达TFPI1-276-CD4或TFPI1-183-CD4的DAP.3细胞同5nM
FXa在37℃共温育1小时。洗细胞2次，并将TF1-219/FVIIa复合物加
入到100μl的2.5×105个细胞中。在37℃温育1小时之后，洗转染子
2次，并在冰浴上同50μl兔抗-TF多克隆免疫球蛋白(2.5μg/ml)共
温育30分钟，随后洗2次，然后同FITC标记的猪抗兔免疫球蛋白共温
育。借助于流式细胞术仅对阳性细胞进行分析。
TF1-219/FVIIa可同等有效地与TFPI1-276-CD4(图14A)和
TFPI1 -183-CD4(图14B)结合，而完全没有检出有对对照细胞系531的
结合。
为了证实TF1-219/FVIIa复合物对Kunitz功能区I的特异性结合，可
通过用1.5-丹磺酰-Glu-Gly-Arg-氯甲基酮，二盐酸化物
(“1，5-DNS-GGACK·HCl”)预温育使FVIIa失活。此抑制剂结合
于FVIIa的活性位点，抑制它对TFPI的结合，而不影响形成TF1-219/FVIIa
复合物(Bajaj，1992)。
首先将FVIIa用100倍摩尔过量的1，5-DNS-GGACK·HCl在20
℃共温育18小时，并借助于离子交换层析再次纯化。将活性位点受抑
制的FVIIa(FVIIai)同等摩尔浓度的TF1-219在25℃共温育15分钟，
然后加到100μl的2.5×105个细胞中。随后的步骤同上所述。
如从图14可以看出，同具有结合“活性的”TF1-219/FVIIa相比较，
TF1-219/FVIIai复合物对TFPI-CD4表达细胞的结合显著地减少了。在
以TFPI1-276-CD4或TFPI1-183-CD4转染的DAP.3之间未见有任何差
异。
因此，当在TFPI1-183-CD4和TFPI1-276-CD4中束缚于细胞表面
时，Kunitz功能区I也保持其功能作用。所以显然，束缚在细胞表面的
TFPI是作为一个整体发挥其功能活性。
11.在IPEC上表达的TFPI-CD4可结合相关的人凝血因子和猪TF
如在图18中所示，可在IPEC上表达TFPI-CD4融合蛋白并保持
有结合FXa和FVIIa的能力。为了证明TFPI可同猪TF发生物理性相
互作用，采取了应用可溶性人TF的竞争性抑制法。如图19A中所示，
与TF-阴性对照转染子(没有用IL-1α激活的)的结合相比较，存
在饱和浓度的FXa和FVIIa时，可溶性人TF对TFPI-转染的IPEC(用
IL-1α预处理的)的结合显著地降低了。这表明猪TF在同可溶性人
TF竞争VIIa，并因此竞争对TFPI的结合。图19B显示的结果支持了
这点，如果将这些转染子同递增浓度的抗猪TF抗体共温育，则可溶性
人TF对TFPI-CD4转染的IPEC(用IL-1α预激活的)的结合增加
了。这种抗体的作用可反映出对猪TF和FVIIa之间或者猪TF-VIIa
复合物和TFPI-CD4之间相互作用的抑制。二种方法的结果都提示，
在IPEC表面表达的TFPI-CD4融合蛋白可同猪TF-FVIIa发生物理
性相互作用。
12.在IPEC上表达的TFPI-CD4可抑制TF-依赖性血纤维蛋白的形
成
图20A显示图解说明TFPI-CD4转染的IPEC前凝血剂表型的单
个代表性实验的结果。与对照的IPEC相比较，在转染的细胞上存在融
合蛋白质时，相应延长了凝血时间。但是，只有当使用TF-阴性IPEC
时，在IL-1α激活-RFPI-CD4表达对凝血时间没有影响之后，才能
观察到这种作用。因此，如所预料的，TFPI-CD4抑制了TF-依赖
性血纤维蛋白的形成，但不抑制TF-无关的血纤维蛋白形成。在预温
育步骤中以递增浓度使用抗TFPI抗体，能够使凝血时间正常化返回到
用未转染的IL-1α激活的对照IPEC所看到的时间(图20B)，表明
存在转染细胞时凝血时间的延长，完全是由于TFPI的特异性抑制作
用。
13.在细胞膜表达蛋白C激活物
为了表达含有从Agkistrodon Contortrix Contortrix毒液中分离
出的蛋白C激活物的异源性构建物(McMullen，1989；Kisiel，
1987)，合成了编码此蛋白质的cDNA。该蛋白质的序列是如下<SEQ
ID 16>：
V I G G D E C N I N E H R F L A L V Y A N G S L C G
G T L I N Q E W V L T A R H C D R G N M R I Y L G M
H N L K V L N K D A L R R F P K E K Y F C L N T R N
D T I W D K D I M L I R L N R P V R N S A H I A P L
S L P S N P P S V G S V C R I M G W G T I T S P N A
T L P D V P H C A N I N I L D Y A V C Q A A Y K G L
A A T T L C A G I L E G G K D T C K G D S G G P L I
C N G Q F Q G I L S V G G N P C A Q P R K P G I Y T
K V F D Y T D W I Q S I I S G N T D A T C P P
根据猪密码子的应用倾向性(它至少适合于绝大多数哺乳动物细
胞)，合成了如下单健DNA<SEQ ID 17>：
GTG ATC GGC GGC GAC GAG TGC AAC ATC AAC GAG CAC CGC
TTC CTG GCC CTG GTG TAC GCC AAC GGC AGC CTG TGC GGC
GGC ACC CTG ATC AAC CAG GAG TGG GTG CTG ACC GCC CGC
CAC TGC GAC CGC GGC AAC ATG CGC ATC TAC CTG GGC ATG
CAC AAC CTG AAG GTG CTG AAC AAG GAC GCC CTG CGC CGC
TTC CCC AAG GAG AAG TAC TTC TGC CTG AAC ACC CGC AAC
GAC ACC ATC TGG GAC AAG GAC ATC ATG CTG ATC CGC CTG
AAC CGC CCC GTG CGC AAC AGC GCC CAC ATC GCC CCC CTG
AGC CTG CCC AGC AAC CCC CCC AGC GTG GGC AGC GTG TGC
CGC ATC ATG GGC TGG GGC ACC ATC ACC AGC CCC AAC GCC
ACC CTG CCC GAC GTG CCC CAC TGC GCC AAC ATC AAC ATC
CTG GAC TAC GCC GTG TGC CAG GCC GCC TAC AAG GGC CTG
GCC GCC ACC ACC CTG TGC GCC GGC ATC CTG GAG GGC GGC
AAG GAC ACC TGC AAG GGC GAC AGC GGC GGC CCC CTG ATC
TGC AAC GGC CAG TTC CAG GGC ATC CTG AGC GTG GGC GGC
AAC CCC TGC GCC CAG CCC CGC AAG CCC GGC ATC TAC ACC
AAG GTG TTC GAC TAC ACC GAC TGG ATC CAG AGC ATC ATC
AGC GGC AAC ACC GAC GCC ACC TGC CCC CCC
使此单链DNA对互补的寡核苷酸退火，得到双链分子。在此双链
DNA的二端包括有限制性位点，CD4锚定器和P-选择素信号序列以
类似于前面所述的方式与这些位点相连接。如前面所述，将所形成的分
子连接进入pHβActpr-1gpt载体。
作为DNA的另一种来源，可基于已知的蛋白质序列，对蛇cDNA
文库进行筛选。
14.TFPI-CD4和水蛭素-CD5的共表达可导致对TF-依赖性凝血和
TF-无关的凝血的抑制
产生了表达TFPI-CD4和水蛭素-CD4的稳定转染子。如图21A
中所示，此初级转染子表达了不同水平的水蛭素和低水平的TFPI。但
是，尽管大多数转染子进行这种适度的表达，与对照相比较，这些细胞
的前凝血剂表型显著地减少了(图21B)。在IL-1α激活的IPEC的
细胞表面存在二种抗凝血分子，明显地延长了血浆凝结的时间至大约
300秒钟，接近于被认为是再钙化人血浆自发凝结的时间。以抗-水蛭
素和抗-TFPI抗体进行的阻断研究证实，这些双转染子的表型改变是
由于所表达的水蛭素和TFPI对凝血的特异性抑制作用。
应该理解的是，上面仅以实施例的方式对本发明进行了描述，并且
可能对其进行修改，而仍属于本发明的范围。
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序列表
(1)一般信息
(i)申请人：
(A)名称：RPMS Technology Limited
(B)街道：Commonwealth Building
(C)城市：Du Cane Road
(D)州：伦敦
(E)国家：英国
(F)邮编(ZTP)：W12 0NN
(ii)发明名称：凝血抑制作用
(iii)序列数：17
(iv)计算机可读形式
(A)存储媒体类型：软盘720K
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Ver 2.0/Microsoft Word 97
(v)目前申请数据：
申请号：PCT/GB98/
(2)SEQ ID NO：1信息
(i)序列特征：
(A)长度：38个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.1：
cagtgtcgac ggatccatgg ccgtcatggc gccccga 37
(2)SEQ ID NO：2信息
(i)序列特征：
(A)长度：34个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.2：
gtcagtgtaa acaaccgccc aggtctgggt cagg 34
(2)SEQ ID NO：3信息
(i)序列特征：
(A)长度：36个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.3：
acccagacct gggcggttgt ttacactgac tgcacc 36
(2)SEQ ID NO：4信息
(i)序列特征：
(A)长度：37个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.4：
gacgctgcag aattcttgca ggtattcttc cgggatt 37
(2)SEQ ID NO：5信息
(i)序列特征：
(A)长度：24个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.5：
aattaggagg ttctggaggc tgca 24
(2)SEQ ID NO：6信息
(i)序列特征：
(A)长度：16个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.6：
gcctccagaa cctcct 16
(2)SEQ ID NO：7信息
(i)序列特征：
(A)长度：32个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.7：
tgtctgcagg aaccagaaga aggtggaatt ca 32
(2)SEQ ID NO：8信息
(i)序列特征：
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.8：
gtgggatccg cctggcctcg tgcctcaa 28
(2)SEQ ID NO：9信息
(i)序列特征：
(A)长度：53个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.9：
gtctgaaacg ctttctgaag aagatgccta gcccaatgaa aagcaggagg ccg 53
(2)SEQ ID NO：10信息
(i)序列特征：
(A)长度：42个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.10：
tgggctaggc atcttcttca gaaagcgttt cagacaaaaa ga 42
(2)SEQ ID NO：11信息
(i)序列特征：
(A)长度：25个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.11：
gaccaggatc cggacaggtc tctta 25
(2)SEQ ID NO：12信息
(i)序列特征：
(A)长度：57个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.12：
catcgtcgac ggatcctaga tgatttacac aatgaagaaa gtacatgcac tttgggc 57
(2)SEQ ID NO：13信息
(i)序列特征：
(A)长度：26个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.13：
ggacctgcag aattcaaaaa ggctgg 26
(2)SEQ ID NO：14信息
(i)序列特征：
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.14：
agcctttttg aattccacgg tccctcat 28
(2)SEQ ID NO：15信息
(i)序列特征：
(A)长度：31个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.15：
cattgctata acaactgcag atatttttaa c 31
(2)SEQ ID NO：16信息
(i)序列特征
(A)长度：231个氨基酸
(B)类型：蛋白质
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物体：Agkistrodon contortrix contortrix
(xi)SEQ ID NO：16序列描述
Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asn Ile Asn Glu His Arg Phe Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Tyr Ala Asn Gly Ser Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Gln
20 25 30
Glu Trp Val Leu Thr Ala Arg His Cys Asp Arg Gly Asn Met Arg Ile
35 40 45
Tyr Leu Gly Met His Asn Leu Lys Val Leu Asn Lys Asp Ala Leu Arg
50 55 60
Arg Phe Pro Lys Glu Lys Tyr Phe Cys Leu Asn Thr Arg Asn Asp Thr
65 70 75 80
Ile Trp Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asn Arg Pro Val Arg
85 90 95
Asn Ser Ala His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro Ser
100 105 110
Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Thr Ile Thr Ser Pro
115 120 125
Asn Ala Thr Leu Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Ile Leu
130 135 140
Asp Tyr Ala Val Cys Gln Ala Ala Tyr Lys Gly Leu Ala Ala Thr Thr
145 150 155 160
Leu Cys Ala Gly Ile Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Lys Gly Asp
165 170 175
Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu Ser
180 185 190
Val Gly Gly Asn Pro Cys Ala Gln Pro Arg Lys Pro Gly Ile Tyr Thr
195 200 205
Lys Val Phe Asp Tyr Thr Asp Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ser Gly Asn
210 215 220
Thr Asp Ala Thr Cys Pro Pro
225 230
(2)SEQ ID NO：17信息
(i)序列特征：
(A)长度：693个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO.17：
gtgatcggcg gcgacgagtg caacatcaac gagcaccgct tcctggccct ggtgtacgcc 60
aacggcagcc tgtgcggcgg caccctgatc aaccaggagt gggtgctgac cgcccgccac 120
tgcgaccgcg gcaacatgcg catctacctg ggcatgcaca acctgaaggt gctgaacaag 180
gacgccctgc gccgcttccc caaggagaag tacttctgcc tgaacacccg caacgacacc 240
atctgggaca aggacatcat gctgatccgc ctgaaccgcc ccgtgcgcaa cagcgcccac 300
atcgcccccc tgagcctgcc cagcaacccc cccagcgtgg gcagcgtgtg ccgcatcatg 360
ggctggggca ccatcaccag ccccaacgcc accctgcccg acgtgcccca ctgcgccaac 420
atcaacatcc tggactacgc cgtgtgccag gccgcctaca agggcctggc cgccaccacc 480
ctgtgcgccg gcatcctgga gggcggcaag gacacctgca agggcgacag cggcggcccc 540
ctgatctgca acggccagtt ccagggcatc ctgagcgtgg gcggcaaccc ctgcgcccag 600
ccccgcaagc ccggcatcta caccaaggtg ttcgactaca ccgactggat ccagagcatc 660
atcagcggca acaccgacgc cacctgcccc ccc 693