导入外源遗传物质的高效受体技术.pdf

摘要
申请专利号：	CN99114681.6	申请日：	1999.02.23
公开号：	CN1264737A	公开日：	2000.08.30
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回\|\|\|实质审查的生效申请日:1999.2.23\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/05	主分类号：	C12N15/05
申请人：	中国科学院成都生物研究所;
发明人：	吴伯骥; 谢明唐; 王爱霞
地址：	610041四川省成都市人民南路四段九号
优先权：
专利代理机构：	四川高新专利事务所	代理人：	张澎
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

本发明公开了一项导入外源遗传物质的高效受体技术。用进入花粉母细胞形成期到减数分裂偶线期的花粉母细胞,或用进入精母细胞形成期到减数分裂偶线期的精母细胞为受体细胞,进行外源遗传物质导入的遗传操作,使受体细胞对内源和外源系统具有普遍包容作用,本发明使外源遗传物质在受体中被整合及整合后有效表达遗传几率均大为提高,为外源遗传物质、DNA和基因的导入提供了有效的受体技术,在基因工程遗传操作的工业化应用中具有重要的实用价值。

权利要求书

1.导入外源遗传物质的高效受体技术，其特征是：用进入花粉母细胞形
成期到减数分裂偶线期的花粉母细胞，或用进入精母细胞形成期到减数分
裂偶线期的精母细胞为受体细胞，进行外源遗传物质导入的遗传操作。
2.根据权利要求1所述导入外源遗传物质的高效受体技术，其特征是：所
述外源遗传物质导入的遗传操作是将外源遗传物质，DNA和基因直接引入
所述高效受体。
3.根据权利要求1所述导入外源遗传物质的高效受体技术，其特征是；
所述外源遗传物质导入的遗传操作是将外源遗传物质，DNA和基因包裹或
拼接在载体中，引入所述高效受体。
4.根据权利要求2和3所述导入外源遗传物质的高效受体技术，其特征
是：所述受体包含天然受体和人工受体。

说明书

导入外源遗传物质的高效受体技术

本发明涉及生物工程高新技术，特别是基因工程技术。

生物工程技术，特别是基因工程技术的发展，给生物学、医学、农业和
食品工业等带来巨大利益和希望。目前，外源遗传物质导入技术主要有两大
类，一是直接导入法，即勿需载体，通过不同技术将外源遗传物质，DNA
和基因直接引入受体：二是间接导入法，即将外源遗传物质，DNA和基因
包裹或拼接在载体中，然后，通过不同技术引入受体。外源遗传物质导入的
受体也主要有两大类，一是天然受体，包括生物体，生物体各个器官和组织
及其细胞；二是人工受体，包括人工诱导的生物体各个器官和组织及其细胞
的离体培养细胞。外源遗传物质导入的这些技术和受体的成功率还不高，特
别是在高等动植物遗传操作中，成功的机率更低。关键的问题是受体是否能
接受外源遗传物质，接受后外源遗传物质在受体中可否被整合，整合后能否
有效表达和遗传。这些问题的解决有赖于遗传学、发育遗传学和分子细胞生
物学基础研究的突破。

本发明的目的是提供一项导入外源遗传物质，DNA和基因的高效受体
技术。为达到上述目的，本发明的技术方案是，用进入花粉母细胞形成期到
减数分裂偶线期的花粉母细胞，或用进入精母细胞形成期到减数分裂偶线期
的精母细胞为受体细胞，进行外源遗传物质导入的遗传操作，通过授粉或受
精，获得转基因的植株或个体，或通过人工培养，获得转基因的再生植株或
细胞无性系。这里所说的花粉母细胞，是指植物的花粉母细胞，是二倍体细
胞，位于花药中；这里所说的精母细胞，是指动物的精母细胞，是二倍体细
胞，位于精巢中；减数分裂偶线期是指成熟分裂前期同源染色体配对时期：
授粉是指植物的人工和自然授粉，受精是指动物的人工和自然的受精。

采用本发明的方法，将外源遗传物质在特定的时期和特定的位置导入受
体，使外源遗传物质在受体中被整合及整合后有效表达遗传几率均大为提
高，本发明在人为影响物种发育过程中，为外源遗传物质、DNA和基因的
导入提供了有效的受体技术，在基因工程遗传操作的工业化应用中具有重要
的实用价值。

进一步的研究结果表明，高等植物花粉母细胞在细胞减数分裂前至减数
分裂偶线期，花粉母细胞的染色质以非完整染色体的形式在细胞核内外和细
胞内外普遍存在着特殊转移运动和染色体重建，此时细胞蛋白质的免疫化学
性质表现出广泛的共性特征，即对自身不同发育时期的细胞或组织及异源物
种的细胞或组织的蛋白质免疫反应表现出某些免疫化学的共性特征，揭示不
同物种个体发育中记录着并在一定发育时期重现部分共性的结构事件和功能
事件，可能涉及物种起源的结构和功能的共性特征。以这一时期的抗花粉母
细胞血清为参考抗血清，内源和外源的不同发育时期的抗原系统产生的免疫
双扩散沉淀线和融合型火箭免疫沉淀峰与花粉母细胞抗原产生的沉淀线和沉
淀峰能广泛地形成共同的融合沉淀线和沉淀峰。表明了这一时期的花粉母细
胞对内源和外源系统的普遍包容作用。

用进入花粉母细胞形成期到减数分裂偶线期的花粉母细胞，或用进入精
母细胞形成期到减数分裂偶线期的精母细胞为受体细胞，进行外源遗传物质
导入的遗传操作，可克服受体对外源遗传物质的亲和障碍和接受障碍，从而
大大提高外源遗传物质导入的成功率。

本发明技术的具体实施可按以下程序：

1.用细胞学手段确定植物花粉母细胞和动物精母细胞已进入母细胞形成
至减数分裂偶线期时期。

2.采用直接或间接导入法，将外源遗传物质、DNA和基因导入花药内花
粉母细胞或精巢精母细胞中。

3.确定花药内花粉成熟和精巢内精子成熟后，或进行自然和人工的授粉
和受精，或直接进行人工诱导培养。

4.授粉和受精产生的受精卵发育成个体后以及人工诱导分化成个体后，
检测外源遗传物质、DNA和基因是否导入，完成工程植物和动物的建立，
按使用目的用于生产。

5.人工培养经检测证明外源遗传物质、DNA和基因已导入的细胞无性
系，按使用目的用于生产。

6.本技术可以采用同样的技术实施程序，作为一项受体技术广泛用于动
植物的遗传操作。

采用常规石蜡切片和DIPA活体荧光染色法，在OPTON显微镜下对花粉
母细胞发育的观察表明，在细胞核内外进行转移的染色质片段，呈滴状，一
个细胞核发生转移的染色质片段数量远远大于染色体数目，然后聚集进入粗
线期，继续进行减数分裂，在此期间对花粉母细胞完成一次染色体的重新组
装。目前，在被子植物中观察到这一现象的就有43科102属，这一重要的
共性结构事件是普遍存在的。

分别取百合、油菜和南瓜成熟花粉母细胞(Mc)、四分体细胞(Tc)、成熟
花粉细胞(Pc)和花柱头细胞(Sc)，制备抗原和抗血清，进行有关的免疫双扩
散和融合型火箭免疫电泳。以进入花粉母细胞形成期到减数分裂粗线期的花
粉母细胞这一时期的抗花粉母细胞血清为参考抗血清，内源和外源的不同发
育时期的抗原系统产生的免疫双扩散沉淀线和融合型火箭免疫沉淀峰与花粉
母细胞抗原产生的沉淀线和沉淀峰能完全融合，同时也发生部分融合。表明
了这一时期的花粉母细胞对内源和外源系统的普遍包容作用。

将带标记的Gus基因导入南瓜花粉母细胞中，Gus基因被南瓜基因组整
合的频率和表达的频率比在其它受体(譬如成熟花粉和其它体细胞)提高2
至3倍

本技术可以采用同样的技术实施程序，作为一项受体技术广泛用于动物
的遗传操作。