克隆、表达及测序一体化载体及其用途 本发明涉及重组DNA技术，更具体地涉及一种新的克隆、表达及测序一体化的表达载体。本发明还涉及该新型表达载体的构建方法和用途。
目前，利用原核表达系统表达真核基因仍然是大量获得真核基因产物的主要方法。作为最早和最广泛使用的表达系统之一，原核表达系统中的大肠杆菌表达系统到目前为止仍然是表达蛋白质的基本系统。尽管经过了近四十年的研究，并在分子生物学基础研究和基因工程生产等方面都取得了令人瞩目的成就，但是目前尚无一个完善的系统能保证所有外源基因的高表达。另一方面，由于表达载体的特殊要求，因此不具备克隆载体的通用性，目前也无一载体能利用商品化的序列测定系统进行测序。这些都是目前所用表达系统的主要缺陷。
为了在原核表达系统中表达外源基因，一般必然涉及克隆、测序和表达等步骤。其中克隆外源基因已广泛采用PCR技术，因而较为方便。但是克隆和表达一个已知外源基因仍很麻烦，至少需要两次克隆：(1)要用克隆载体来克隆PCR扩增出的基因片段，并在克隆载体中鉴定基因序列；(2)再将基因片段克隆至表达载体中，以便进行表达。这一过程不仅导致基因在多次克隆中出现错误的几率上升，而且在AUG前必须有一个酶切位点以便于插入表达基因，并且使得Shine-Dalgarno(SD)序列与AUG之间的序列被固定，从而不利于各种基因的表达。
因此，本领域中一直需要一种能在同一载体上进行克隆、测序和表达的载体。
本发明的目地之一就是提供一种克隆、表达、测序一体化的载体，从而减少克隆次数并简化克隆操作过程。
本发明的另一目的是提供一种新的克隆、测序和表达外源基因的方法，从而减少克隆次数并简化克隆操作过程。
本发明的还涉及一体化载体的用途，它被用于克隆、测序和表达外源基因，从而可减少克隆次数并简化克隆操作过程。
本发明的一体化载体依次含有以下元件：(1)控制外源基因转录启动子，(2)反向测序引物序列，(3)核糖体结合位点序列(RBS序列)和SD序列，(4)紧跟于SD序列下游的多克隆位点，(5)正向测序引物序列，其中元件(3)和(5)的位置可互换，(6)控制外源基因终止的终止子，其中，多克隆位点含有平末端类型的限制性内切酶的酶切位点，而且SD-AUG间隔为5-8个核苷酸。
使用本发明的克隆、表达、测序一体化的载体，可使外源基因表达的全过程在一个载体上即能完成。在一个较佳例子中，本发明的一体化表达载体还可灵活改变从SD到AUG间的序列，从而实现对翻译起始序列的自由设计。
为了实现本发明的目的，本发明一体化载体应含有启动子，尤其是强启动子如pL启动子、lac启动子、trp启动子、tac启动子等。为了便于分离产物，较佳地可以选用热敏型的启动子。这类热敏型启动子是本领域技术人员熟知的，它们通常在常温(30℃左右，如32℃)时是不起作用的，但是当温度升高(如约40℃)时就发挥启动子的作用。在本发明的一个优选例中选用了热敏型的强启动子pL启动子(参见Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989))。为了配合该pL启动子的使用，同时使用了其抑制基因CI857-2H(参见《分子克隆》；以及陈南春，高辉，陈苏民等。“cI857基因的体外定位同义突变”，生物化学杂志，1994，10：509-512)。
当然，也可以使用化学诱导型的启动子。当培养基中加入有关的诱导物时，这类启动子就发挥其诱导作用，如lac启动子、trp启动子等。
为了具有测序的功能，本发明的一体化载体还含有测序引物序列。许多测序载体中的测序引物序列都可选择用于本发明。在一体化载体中，测序引物序列的位置是在多克隆位点的上游或下游附近，而且较佳地可在载体中同时含有正向和反向的测序引物序列。
一些已知的通用测序引物序列也可以用于本发明，其中包括例如pUC/M13引物序列、SP6/T7T3引物序列、pBR322引物序列。在本发明的一个优选例中，使用的是M13mp18的通用测序引物序列。更佳地，在多克隆位点上游具有M13mp18的反向测序引物序列(#1201)，在多克隆位点下游具有M13mp18的通用正向测序引物序列(#1211)。
此外，正向测序引物序列和反向测序引物序列的位置也可互换。较佳地，反向测序引物序列宜在多克隆位点的上游。
在本发明中，在多克隆位点上游和测序引物序列之间有核糖体结合位点(RBS)序列，一般核糖体结合位点序列含有SD序列(AAGGAG)。许多已知的核糖体结合位点都可用于本发明，较佳地该核糖体结合位点衍生自噬菌体。
在本发明的一个优选例中，选用的是T7噬菌体基因10的RBS序列。研究表明，T7噬菌体基因10的RBS序列具有翻译增强活性(Olins PO，Devine CS，Rangwala SH，etal.The T7 phage gene 10 leader RNA，a ribosome-binding site thatdramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli.Gene 1988；73：227-235；Olins PO和Rangwala SH.A novel sequence element derived frombacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene inEscherichia coli.J Biol Chem 1989；264：16973-16976；Olins PO和Rangwala SH.Vector for enhanced translation of foreign genes in Escherichia coli.Methods Enzymol1990；185：115-119)，人们称之原核翻译增强子Epsilon(enhancer of proteinsynthesis initiation)，该RBS序列包含了AAGGAG(SD序列)。使用该RBS序列时，可进一步提高翻译表达量。
紧跟着RBS序列下游的是多克隆位点。换言之，在SD序列下游是多克隆位点。虽然已有技术中已有许多种类的多克隆位点，但是为了构建出一体化的载体，需要对多克隆位点的结构和位置进行优化。即该多克隆位点宜含有平末端类型的限制性内切酶的酶切位点，而且SD-AUG间隔为5-8个核苷酸。
如上所述，常规的利用PCR技术克隆和表达外源基因的过程存在两个主要问题：第一是要进行再次克隆，从而无法保证第二次克隆完全正确；第二是在AUG前必须有一个酶切位点以便于插入表达基因，这导致问题是AUG前的序列很难控制，而使得SD与ATG之间的序列被固定，因而不利于基因的表达。
研究表明，SD-AUG间隔以及AUG上下游序列对基因表达的水平有极大的影响，其差别可达2000倍(Gold L.＂Postranscriptional regulatory mechanisms inEscherichia coli.＂Ann Rev Bilchem.1988：57：199-233)。当SD序列固定时，SD-AUG间隔一般为5-13bp，Ringquist等人(Ringquist S，Shinedling S和Barrick D.等人.＂Translation initiation in Escherichia coli：sequences within the ribosome-binding site＂.Mol Microbiol 1992；6：1219-1229)和Min KT等人(Min KT，Kim MH和Lee DS.“Search for the optimal sequence of the ribosome binding site by randomoligonucleotide-directed mutagenesis”.Nucleic Acids Res 1988；16：5075-5088)的实验表明，SD-AUG间隔以5bp为最佳。关于SD-AUG间隔区组成的一些研究结果还可有：de Boer HA和Hui AS.＂Sequences within ribosome binding site affectingmessenger RNA translatability and method to direct ribosomes to single messengerRNA species＂，Methods Enzymol 1990；185：103-114。
其次，AUG前的三个核苷酸以UAU、CUU组合为最佳，一定要避免AGG、UUC、UCA(Min KT，Kim MH和Lee DS.“Search for the optimalsequence of the ribosome binding site by random oligonucleotide-directedmutagenesis”.Nucleic Acids Res 1988；16：5075-5088)。考虑最佳组合序列时发现，AUG前根本就没有一个限制性内切酶的识别序列能满足要求。常用的EcoRI位点正是应当避免的序列，因为它在AUG前的三个核苷酸正好是UUC。
为了提高表达效率，在多克隆位点中宜含有平末端类型的限制性内切酶的酶切位点，如SspI、Bst1107I、HpaI、DraI和EcoRV位点。在本发明的一个较佳例子中，在SD序列后紧跟着的是EcoRV位点。这使人们可以方便地利用该酶的平末端特性，从而在设计表达外源基因时AUG前的序列具有极大的灵活性。
在另一优选例子中，采用5-8个核苷酸的SD-AUG间隔，并且AUG前的三个核苷酸均由A和U组成，从而进一步提高表达效率。
本发明的一体化载体还含有终止序列。在本领域中已知众多终止序列元件几乎都可用于本发明。较佳地是原核生物的终止序列。在本发明的一个例子中选用了rrnBT1T2片段，该片段是强终止序列，而且还有稳定作用。
至于复制起点ori和抗性基因等元件，没有任何特别限制。比如，抗性筛选基因可选用四环素抗性基因、新霉素抗性基因、或氨苄青霉素抗性基因。
图1是载体pJL6的结构示意图。
图2是本发明的一种一体化载体pLCM182的构建示意图。
图3是本发明一种一体化载体pLCM182中克隆-表达-测序元件的局部序列图。
图4是用本发明的一体化载体pLCM182表达表达hIL-4、hIL-17和hIL-1RA的电泳图。其中从左至右依次为：泳道1，蛋白质分子量标准；泳道2，hIL-1RA；泳道3，hIL-4；泳道4，hIL-17；泳道5，pLCM182空白载体对照。
图5是pJT6的序列表图。
下面结合附图和实施例，进一步详细地阐述本发明。应理解，这些具体实施例用于说明目的而并非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照本领域常规技术操作的条件进行，如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
克隆、表达、测序一体化载体的构建
A.材料
主要菌株与载体
大肠杆菌DH5α购自Gibco；去除了两个HindIII位点的cI857基因(cI857-2H)(陈南春，高辉，陈苏民等。“cI857基因的体外定位同义突变”，生物化学杂志，1994，10：509-512)和pJL6(结构示意图见图1，详细序列可参见图5)从第四军医大学生化教研室获得；pKK233-2和pUC18购自Pharmacia公司。
主要实验试剂及材料：
各种工具酶购自Promega公司。T7 DNA测序试剂盒购自Pharmacia公司。全自动荧光测序试剂盒Big Dye购自PE公司。
人工合成DNA片段由Cybersyn公司合成，包括如下片段：
T7噬菌体基因10的核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)序列(OlinsPO，Devine CS，Rangwala SH，等人，“The T7 phage gene 10 leader RNA，aribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes inEscherichia coli.”Gene 1988；73：227-235)：
上链：5’-AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATCG-3′；
下链：5’-GATCCGATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAA-3′；
两片段经退火后形成双链，5’为EcoRI粘端，3’为BamHI粘端，中间含EcoRV位点。
载体构建及序列测定
请参见图2的构建步骤流程。基本步骤如下：首先将合成的DNA片段退火后插入pUC18载体的EcoRI、BamHI位点之间，然后以M13mp18的正反测序引物(来自T7 DNA测序试剂盒，Pharmacia)扩增出该段序列以备后用。同时，将pKK233-2的强转录终止序列rrnBT1T2(SspI-HindIII)插入pUC18的SspI-HindIII之间，取代LacZ序列；其次，将pJL6的pL启动子序列(EcoRI-BamHI)插入前一载体的EcoRI-BamHI之间；再将cI857-2H(BglII-KpnI)插入前一载体的EcoRI-PvuII之间；最后，将正反测序引物扩增出的片段(含T7噬菌体基因10的核糖体结合序列[RBS]、多克隆位点及两端的测序引物)插入前一载体的BstXI-HindIII之间。构建全过程步骤均经酶切鉴定以确定无误。将构建的载体命名为pLCM182。利用ABI 377全自动测序仪测定pLCM182的序列，以M13mp18的正反向测序引物双向测序。
所构建的载体pLCM182如图2所示，序列测定与预期结果一致。其中克隆、表达、测序元件的局部序列如图3所示。
10 20 30 40 50 60 70AGGAAACAGC TATGACCATG ATTACGAATT TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATCGGATC CTCTAGAGTC
80 90 100 110GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGGCACTGGC CGTCGTTTTA CAGCTT
在这种一体化载体的克隆、表达、测序元件局部序列中，第5-20碱基为M13mp18的反向测序引物(#1201)；第27-50碱基为T7噬菌体基因10的RBS序列，其中AAGGAG是SD序列；第50-91碱基为多克隆位点，其中包含EcoRV(该位点紧接SD序列)、BamHI、XbaI、SalI、PstI、SphI、HindIII；第95-111碱基为M13mp18的通用测序引物(#1211)。
构建出的载体pLCM182中，以强启动子pL及终止子rrnBT1T2控制外源基因转录及终止。在SD序列上游含M13mp18的反向测序引物(#1201)序列；SD序列下游紧跟多克隆位点及M13mp18的通用测序引物(#1211)序列。外源基因插入该载体后，可直接诱导表达，有表达还可直接利用通用测序引物测序，所测定的序列直接反应了表达载体上的实际序列，避免了从克隆载体到表达载体的克隆过程中所产生的错误，从而极大限度地保证了表达基因的正确性。此外，对多克隆位点进行的改造，可以适应多种形式的表达需要。
实施例2
用一体化载体进行基因的克隆、测序和表达
由Cybersyn公司合成以下人工DNA片段，作为引物：
人IL-4 PCR引物序列为：
上游：5’-ATAATGCACAAGTGCGATATCACCTTA-3′；
下游：5’-TTGGATCCTCAGCTCGAACACTTTGAATA-3′；
人IL-17 PCR引物序列为：
上游：5’-AATATGATAGTGAAGGCAGGAATCAC-3′；
下游：5’-AAGGATCCTTAGGCCACATGGTGGACAA-3′；
人IL-1RA PCR引物序列为：
上游：5’-TATATGCGACCCTCTGGGAGAAAATC-3′；
下游：5’-AAGGATCCTTACTCGTCCTCCTGGAAGT-3′。
将用PHA刺激的人外周血单个核细胞mRNA的反转录产物，作为人白细胞介素-4(hIL-4)和人白细胞介素-1受体拮抗剂(hIL-1RA)基因的来源。将原代培养的人成纤维细胞mRNA反转录产物，作为人白细胞介素-17基因(hIL-17)的来源。
利用PCR技术从相应模板中扩增出hIL-4、hIL-17和hIL-1RA基因，将上述三种基因分别插入pLCM182的EcoRV-BamHI位点之间。此外，在克隆后的载体中，SD-AUG之间的间距分别为5、6、8个核苷酸。鉴定所得的阳性克隆直接作热诱导表达。
其中热诱导表达方法如下：将振摇过夜的大肠杆菌以1％接种至培养基中，在32℃振摇，约2-3小时后，待其恰巧进入生长平台期时，立即转入42℃继续培养，在4-5小时后收获细菌，测定其中的表达产物。
表达结果如图4所示，从左至右分别为：1，蛋白质分子量标准；2，hIL-1RA；3，hIL-4；4，hIL-17；5，pLCM182空白载体对照。其中hIL-4、hIL-17以及IL-1RA的表达量经条带灰度扫描分析均高于25％。
高表达的基因表达克隆可利用测序引物直接进行测序。上述基因直接在表达载体上利用通用测序引物测序，序列结果与文献报道一致。
如上所述，本发明一体化载体的优点是，所有被克隆的基因均由PCR得到，并在同一载体上进行序列测定，结果均正确；而且各基因克隆的表达量均高于报道水平。因此该载体的构建在实际工作中极大地方便了基因的克隆、测序及表达。
尽管本发明是根据最佳实施例进行描述的，但是应理解：本领域一般技术人员在阅读了本发明的讲授内容后，可以进行各种变动和修饰，这些都落于本发明权利要求所限定的范围内。