低聚木糖的清洁高效制备方法.pdf

本发明提供了一种低聚木糖的清洁高效制备方法，其步骤包括将木聚糖溶解于水或缓冲液配制成木聚糖溶液，向该溶液中加入木聚糖酶，水解木聚糖得酶解液；然后向上述酶解液中加入乙醇，离心取上清液获得低聚木糖溶液；再从上述低聚木糖溶液分离得到低聚本糖。应用本发明低聚木糖的清洁高效制备方法制备低聚木糖的工艺流程实现了低消耗无污染，效率高，生产能力强，所得产品的性质最接近自然产物。

1、  一种低聚木糖的清洁高效制备方法，包括以下步骤：
步骤A：将木聚糖溶解于水或缓冲液配制成木聚糖溶液，向该溶液中加入木聚糖酶，水解木聚糖得酶解液；
步骤B：向上述酶解液中加入乙醇，离心取上清液获得低聚木糖溶液；
步骤C：蒸馏除去上述低聚木糖溶液中的乙醇，即得到低聚木糖。

2、  根据权利要求1所述的低聚木糖的清洁高效制备方法，其特征在于，所述的
步骤B为：加入1-5倍体积的乙醇并混合均匀，离心取上清液即获得低聚木糖溶液。

3、  根据权利要求2所述的低聚木糖的清洁高效制备方法，其特征在于，所述步骤B中向酶解液中加入3倍体积乙醇。

4、  根据权利要求1-3之一所述的低聚木糖的清洁高效制备方法，其特征在于，所述步骤A中木聚糖溶液浓度为6-30％。

5、  根据权利要求4所述的低聚木糖的清洁高效制备方法，其特征在于，所述步骤C后还有：进一步浓缩制成低聚木糖糖浆或干燥制成低聚木糖粉剂。

6、  根据权利要求1所述的低聚木糖的清洁高效制备方法，其特征在于，所述的乙醇是浓度等于或高于75％的乙醇。

7、  根据权利要求1所述的低聚木糖的清洁高效制备方法，其特征在于，在步骤A前还有木聚糖的制备过程，具体如下：
步骤H：原料预处理；
步骤I：用碱溶液抽提出原料中的碱溶性物质；
步骤J：向碱抽提溶液中加入乙醇，混匀后用酸调节溶液pH；离心或过滤收集沉淀物即为粗提木聚糖；
步骤K：用乙醇洗涤粗提木聚糖至少一次，得到的沉淀物即为净化的木聚糖。

低聚木糖的清洁高效制备方法
技术领域
本发明涉及一种功能性低聚糖的制备方法，具体地说涉及一种低聚木糖的酶法制备方法，更具体地说涉及一种低聚木糖的清洁高效制备方法。
背景技术
低聚木糖又称木寡糖，是由2-7个木糖以β-1，4-糖苷键连接而成的功能性低聚糖。与其它低聚糖相比，低聚木糖具有更好的稳定性，能够专一性地促进双歧杆菌增殖，因此，它是最有效的双歧因子，每人每天只需摄取0.7克就能达到整肠作用(一般活性低聚糖日用量为2-10克)。
低聚木糖的制备通常包括以下三个主要过程：
1、木聚糖的提取：用碱溶液、热水、高压蒸汽爆破等方法可以将木聚糖从植物纤维原料中抽提出来；加乙醇可以使粗提木聚糖从抽提液中沉淀出来；经过超滤、乙醇沉淀、再溶解、再沉淀、过氧化氢或次氯酸盐处理、柱层析等方法可以使粗提木聚糖净化。
2、木聚糖的降解：向植物纤维原料的抽提液，或木聚糖溶解液中加入一定量的木聚糖酶进行水解反应，产生降解程度不同的混合物。所用的木聚糖酶通常由经过选育的高产菌株或基因工程菌发酵产生，常见菌株包括芽孢杆菌、产碱杆菌、梭状芽孢杆菌、假单孢杆菌、黑曲霉、里氏木霉、顶青霉等。
3、低聚木糖的分离：含低聚木糖的混合物溶液经离心分离、活性碳脱色、层析分离、离子交换、超滤等方法提纯，最后再经真空浓缩、冷冻浓缩、喷雾干燥等方法制成产品。
以上每一个过程都有多种不同的方法可选用，因此低聚木糖制备技术出现多样性。虽然不同的制备技术所采取的方法多种多样，但是总体工艺流程主要过程如下：
1.向酶解底物即木聚糖中加入木聚糖酶，在一定的条件下让木聚糖充分水解；
2.通过活性碳或离子树脂吸附进行脱色、脱盐；
3.收集酶解产生的低聚木糖；
4.进一步对低聚木糖溶液进行浓缩或干燥获得产品。
这样的技术中存在的问题是酶解反应液体积大、浓度低、杂质多，从而后处理效率低、化工程序多、对设备要求高，因此生产成本居高不下。
有些学者已经意识到上述技术的局限性，开始使用精制的木聚糖作酶解反应的底物。目前制备精制木聚糖的基本方法如下：向碱抽提液中加入3倍体积的浓度高于90％的乙醇，使木聚糖等从原料抽提液中沉淀出来，离心或过滤分离出粗提木聚糖；将粗提木聚糖溶解于水，再加3倍体积的乙醇使木聚糖沉淀并分离出木聚糖；重复数次以去除与木聚糖等大分子相随的可溶性小分子杂质，在这过程中有的还加入过氧化氢或次氯酸盐等氧化剂使制品颜色变淡。可见这是一个繁琐、耗资、产生污水的过程。
虽然使用了精制的木聚糖作酶解反应底物，所产生的低聚木糖的分离技术同样未能避免一些低效率的工序如超滤、活性炭或离子树脂吸附/洗脱等等。因此，清洁高效地制备低聚木糖的新方法亟待产生。
发明内容
本发明的目的是提供一种低成本无污染的制备低聚木糖的方法，本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
本发明低聚木糖的清洁高效制备方法，包括以下步骤：
步骤A：将木聚糖溶解于水或缓冲液配制成木聚糖溶液，向该溶液中加入木聚糖酶，水解木聚糖得酶解液；
步骤B：向上述酶解液中加入乙醇，离心取上清液获得低聚木糖溶液；
步骤C：从上述低聚木糖溶液分离得到低聚木糖。
本发明方法中所述的乙醇，推荐使用浓度等于或高于75％的乙醇，优选浓度高于90％的乙醇，最好是浓度为95％的乙醇。
本发明方法步骤A将木聚糖溶解于水或缓冲液，配制成木聚糖溶液，木聚糖溶液的浓度无特殊要求，只要便于操作即可，本发明推荐木聚糖浓度是6-30％，在配制时可视需要加热搅拌使均一化；本发明中所述水是可食用的水，可以是自来水、纯净水或蒸馏水，优选纯净水和蒸馏水；本发明所述的缓冲液推荐可食用的乙酸(pH4-5.5)或柠檬酸缓冲液(pH4-7)；本发明方法中所述的木聚糖酶，可由现有技术制得，本发明推荐使用极耐热性木聚糖酶，优选海栖热袍菌木聚糖酶B。本发明的水解条件，根据所选用的木聚糖酶的特性而定。
本发明方法步骤B中乙醇的用量，可视乙醇的浓度和生产成本而定，乙醇浓度较低时，适当增加乙醇用量，可提高沉淀效果，本发明推荐乙醇用量为酶解液的1-5倍体积，优选3倍体积。
本发明步骤C中得到的粗产品即低聚木糖溶液可进一步浓缩至所要求的浓度，如总糖含量70％的糖浆；或进一步干燥制成粉剂。
本发明方法中所述的木聚糖可通过现有技术制备得到。但为了更好地实现发明目的，本发明推荐使用按下述方法制得的木聚糖：用碱溶液抽提出植物纤维原料中的碱溶性物质；向碱抽提溶液中加入乙醇，混匀后用酸调节溶液pH；离心或过滤收集沉淀物即为粗提木聚糖；用乙醇洗涤粗提木聚糖至少一次，得到的沉淀物即为净化的木聚糖。
本发明中所述的溶液浓度，若无特殊说明，均指重量百分比。
应用本发明低聚木糖的清洁高效制备方法制备低聚木糖地工艺流程(图1、图2)，总体特征是充分利用了木聚糖的溶解特性以及大分子与小分子物质在溶解度方面的差别，以最少的化学试剂和最少的加工步骤获得最接近自然的产品。具体地说该工艺流程以分离效果分明、可操作性强的溶解/沉淀/离心等方法取代了脱色、超滤、离子交换、活性炭吸附等分离步骤；同时，在试剂种类、溶剂浓度、反应体积等方面结合效益和环保要求实现低消耗无污染。
本发明进一步的技术方案中，以高浓度木聚糖作底物产生高浓度酶解液，(见图3、图4、图5)提高了纯化低聚木糖的效率，降低后处理的负荷。
用极耐热性木聚糖酶来水解木聚糖，其有益效果是：
(1)极耐热性木聚糖酶已经实现基因工程菌的高效表达，产酶水平高，易纯化；
(2)65-90℃高温下进行水解反应不需要采取防腐措施。
通过乙醇沉淀法纯化酶解液中的低聚木糖，其有益效果是：
(1)可使用连续流式离心机，效率高，生产能力强；
(2)不需要其它脱盐、脱色和提取过程，所得产品的性质最接近自然产物。
附图说明
图1是以木聚糖为原料制备低聚木糖的工艺流程示意图。
图2是以植物纤维为原料制备低聚木糖的工艺流程示意图。
图3是粗提木聚糖的产品成分分析图谱；HPLC分析柱：Sugarpak1；6.5mm×300mm糖柱分析，色谱条件：柱温：85℃；流动相：水；流速：0.5mL/min；示差折光检测器灵敏度：4，外标法标定，进样量为10μL。标准样品购于Sigma公司。
图4是酶解液中木聚糖的水解产物成分分析图谱。HPLC分析柱：Sugarpak 1；6.5mm×300mm糖柱分析，色谱条件：柱温：85℃；流动相：水；流速：0.5mL/min；示差折光检测器灵敏度：4，外标法标定，进样量为10μL。标准样品购于Sigma公司，根据标样，峰14.0为木糖，峰11.4为木二糖。
图5是低聚木糖产品中的成分成分分析图谱及相对含量。HPLC分析柱及色谱条件同上，根据标样，峰14.0为木糖，峰11.4为木二糖。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本发明方法：
实施例1：
(1)将无霉变稻草抖去灰尘并晒干后磨成1-20mm长的碎草丝；
(2)称取草丝10kg，加入2.5％的KOH溶液501，浸泡4个小时以后蒸煮15分钟，挤出溶液；向草渣中再加入2.5％的KOH溶液201，再次蒸煮15分钟，挤出溶液。合并两部分挤出液，以连续流式离心机离心获得上清液约501；
(3)加入95％的乙醇150L，混匀后用磷酸调节pH值至6.0，离心收集被沉淀的粗提木聚糖；
(4)向粗提木聚糖沉淀块中加入95％的乙醇501，打碎后低速搅拌2小时使其充分平衡，离心收集沉淀物；再加乙醇重复前述过程2次，获得净化的木聚糖，(见图3)HPLC分析柱：Sugarpak1；6.5mm×300mm糖柱分析，色谱条件：柱温：85℃；流动相：水；流速：0.5mL/min；示差折光检测器灵敏度：4，外标法标定，进样量为10μL。标准样品购于Sigma公司。密封保藏或干燥后保存；
(5)将上述净化木聚糖以25％(w/v)的浓度溶解于纯净水，加热搅拌使均一化以后降温至70℃，加入(约20U/g)海栖热袍菌木聚糖酶B，保温并低速搅拌12个小时，所得到的酶解液采用HPLC高压液相色谱检测其中糖的成分及含量见图4；低聚木糖含量的分析在Waters HPLC 246-E高压液相色谱仪上，用Sugarpak1，6.5mm×300mm糖柱分析。色谱条件：柱温：85℃；流动相：水；流速：0.5mL/min；示差折光检测器灵敏度：4，外标法标定，进样量为10μL。标准样品购于Sigma公司。
(6)加入3倍体积的95％的乙醇并混合均匀，离心除去酶解液中的未水解的木聚糖、非木聚糖大分子(包括酶蛋白)，获得低聚木糖溶液；
(7)从上述低聚木糖溶液中蒸馏回收乙醇，并进一步浓缩得到总糖含量70％糖浆，其中低聚木糖成分及相对含量见图5。
实施例2：与实施例1基本相同，不同之处在于木聚糖购于美国Sigma公司，货号：x0627。将木聚糖溶于柠檬酸缓冲液，配制成浓度为30％的木聚糖溶液。
实施例3：与实施例1基本相同，不同之处在于木聚糖由下述方法制备：
以2％的NaOH溶液从玉米芯中浸提出木聚糖；向碱抽提液中加入3倍体积的浓度约95％的乙醇，使木聚糖沉淀出来，离心分离出沉淀物；将沉淀物溶解于水，再加3倍体积的乙醇使木聚糖沉淀，离心收集沉淀；重复2次获得净化的木聚糖。将木聚糖溶于柠檬酸缓冲液，配制成浓度为20％的木聚糖溶液。
实施例4：与实施例3基本相同，不同之处在于用碎麦草作原料。
实施例5：与实施例3基本相同，不同之处在于用甘蔗渣作原料。
实施例6：与实施例3基本相同，不同之处在于所用的木聚糖酶是疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶(Sigma，x2753)，反应温度65℃，pH6.5。
实施例7：与实施例3基本相同，不同之处在于所用的木聚糖酶是放线菌木聚糖酶，反应温度为60℃，pH5.0。
实施例8：与实施例2基本相同，不同之处在于用自来水配制木聚糖溶液浓度为6％，得到产品纯度稍低。
实施例9：与实施例1基本相同，不同之处在于用蒸馏水配制木聚糖溶液浓度为15％。
实施例10：与实施例1基本相同，不同之处在于用硫酸调节pH值至4，将净化的木聚糖溶于可食用乙酸(柠檬酸)缓冲液，配制成浓度为5％的木聚糖溶液。
实施例11：与实施例1基本相同，不同之处在于用乙酸将pH值调至7，将净化的木聚糖溶于柠檬酸缓冲液，配制成浓度为35％的木聚糖溶液。
实施例12：与实施例1基本相同，不同之处在于用70％的乙醇301净化粗提木聚糖，重复4次。
实施例13：与实施例1基本相同，不同之处在于75％的乙醇201净化粗提木聚糖，重复6次。
实施例14：与实施例1基本相同，不同之处在于90％的乙醇401净化粗提木聚糖1次。
实施例15：与实施例1基本相同，不同之处在于低聚木糖溶液经过真空干燥产生黄色粉末。
实施例16：与实施例1基本相同，不同之处在于步骤(6)中向酶解液中加入1倍体积的80％的乙醇分离低聚木糖。
实施例17：与实施例1基本相同，不同之处在于步骤(6)中向酶解液中加入5倍体积的80％的乙醇分离低聚木糖。