微生物活菌组合物及其制备方法 本发明涉及一种利用已知的酪酸梭菌、双歧杆菌活菌作为有效成份，调节肠道功能及增强体液免疫力的组合物及其制备方法。
在正常人的肠道中生存着大量微生物，细菌总数约100万亿个，微生物间相互作用形成肠道菌群并保持着微生态平衡。在受到饮食、药物、微生物、气候及宿主本身生理状况发生剧烈变动的情况下，肠道菌群平衡遭到破坏，致病菌大量繁殖，产生大量的有害物质，有益菌的生长受到抑制，从而导致肠道功能紊乱。尤其是自五十年代使用抗生素以来，虽然抗生素在医学领域中起了很大的作用，然而随着时间的推移，抗生素带来的忧虑也越来越明显，长期应用抗生素所引起抗药菌株的产生、肠道菌群失调、抗生素相关性腹泻、二重感染已成为目前临床上难以解决的一大问题。
微生态制剂是一种口服非致病性活菌制剂，它能改进肠道细菌的平衡，对人或动物产生有益的作用，国外早在30年前就已进入实际应用阶段，至今这门科学发展迅速，日本、德国、美国、法国、意大利、荷兰和丹麦等国已都有产品投放市场。我国近年来也陆续出现了一些产品。
目前用于研制生态制剂的细菌，主要有双歧杆菌、乳杆菌、枯草杆菌、肠球菌、大肠杆菌、酵母菌、腊样芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、棒状杆菌、类杆菌及表皮葡萄球菌等。其中以双歧杆菌应用最广，这与双歧杆菌是人体内微生物主要成员有关，它是人类大肠中的优势菌，对人体有营养和保护作用，对肠内腐败菌、食物中毒菌、病原菌等有抑制作用，菌群失调的恢复主要是双歧杆菌的恢复，双歧杆菌制剂可调整肠道菌群微生态平衡。双歧杆菌是Orla-Jensen1924年发现，并记载于Peter H.A Sneath主编1986年出版的《伯杰氏系统细菌学手册》(Berger’s Manual of Systematic Bacteriology)第二卷第1418页。本菌存在于土壤和粪便中，其菌种分离方法是将粪便按1∶9(重量、体积比)加入无菌生理盐水，振荡混匀后接种于SSCM培养基，37℃厌氧培养48小时，然后用接种环划线接种于双歧杆菌选择性培养基表面，37℃厌氧培养72小时；生长培养特性：厌氧条件下生长良好，菌落：灰白色，呈露珠样，针帽大小，边缘整齐，突起，表面光滑，为厌氧性细菌，镜检：革兰氏染色阳性，呈直形或弯曲状，两端着色较深，可出现“Y”、“V”型的排列形态，不形成芽胞。据报导日本至今双歧杆菌制剂就有70余种。这些生态制剂在目前主要用于治疗腹泻、调整肠道菌群。国内已有用枯草杆菌活菌制剂预防和控制烧伤创面的感染；用乳杆菌、肠球菌制剂降低胆固醇等。另还有几种双歧杆菌活菌制剂，如口服双歧杆菌活菌制剂商品名为回春生或丽珠肠乐，是由青春型双歧杆菌制备而成的活菌制剂；如商品名为培菲康，由两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌组成的活菌制剂等。
酪酸梭菌是1933年由日本千叶医科大学宫入近治首先发现报告，并记载于Peter H.A Sneath主编1986年出版的《伯杰氏系统细菌学手册》(Berger’s Manual of Systematic Bacteriology)第二卷第1160页。本菌存在于土壤、动物和人的肠道中，可从土壤、动物和人的粪便中分离；其分离方法是取粪便，按1∶9(重量、体积比)比例加入无菌生理盐水，振荡混匀后接种于SSCM培养基，37℃厌氧培养24小时，然后用接种环划线接种于酪酸梭菌选择性培养基表面，37℃厌氧培养48小时；培养特征及菌体形态，生长培养特性：厌氧条件下生长良好，菌落：为灰白色，大小约1-6mm，边缘不整齐，呈油煎蛋样，中心有突起，表面不光滑，为厌氧性细菌，镜检：革兰氏染色呈阳性，菌体呈直杆形，两端较圆，大多数菌体中央有芽胞。酪酸梭菌是人体肠道内暂住非定植性正常菌群，除能调整和补充正常菌群外，能与双歧杆菌、乳酸菌等肠内的有益菌共生，并促使其增殖和发育，抑制有害菌和腐败菌的生长和繁殖。它能减少胺、吲哚待物质的产生；产生B组维生素、维生素K、淀粉酶、酪酸醋酸和乳酸待代谢产物；代谢产物酪酸为人体肠上皮细胞新陈代谢的主要能量来源，可促进肠上皮组织的再生和修复；酪酸梭菌为梭状芽胞杆菌，在胃肠内不受胃酸、胆汁等地影响，对多种抗生素有较强的耐受性，可与抗生素共用。
近半个世纪以来，酪酸梭菌制剂在日本、韩国、台湾等亚洲国家和地区被广泛应用。可调整肠道菌群微生态平衡、具有增殖双歧杆菌的作用。
但将酪酸梭菌和双歧杆菌活菌混合的制剂，利用酪酸梭菌对双歧杆菌的增殖作用共同发挥其有益作用的制剂尚未见文献报导。
本发明的目的是为了提供一种将酪酸梭菌和双歧杆菌联合起来制成一种新的微生态制剂，利用酪酸梭菌增殖双歧杆菌的作用，更为有效地发挥复合菌制剂调节人体肠道菌群及提高人体体液免疫力的作用，可防治胃肠疾病，改善胃肠功能，且无毒无副作用的微生物活菌组合物。
本发明的目的可通过如下措施来实现：
一种微生物活菌组合物它包括酪酸梭菌活菌菌粉、双歧杆菌活菌菌粉和载体；其中以重量计每克组合物中含酪酸梭菌数为105-1010个，含双歧杆菌活菌数为105-1010个。
本发明的目的还可通过如下措施来实现：
一种微生物活菌组合物的制备方法：先培养酪酸梭菌和双歧杆菌，再从培养物中分离菌体，将菌体按体积比1∶(0.8-1.5)加入乳品，将乳品菌液在低温真空下冻干得到菌粉；再按每克组合物中分别含酪酸梭菌和双歧杆菌活菌数105-1010个称取菌粉，然后按常规制剂比例加入载体至1克，并按常规制剂方法制剂即可。
酪酸梭菌和双歧杆菌的培养方式可采用液体培养；上述两种菌体的培养对培养基中的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。其中碳源可为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可为胨、大豆粉、肉膏、米糖、麦皮、尿素、玉米浆、铵盐、硝酸盐，以及其它有机或无机含氮化合物。至于其它营养源则可适当添加一些无机盐类。对温度、时间等培养条件并无严格限制，以适于使用菌的生长为准，并以选择酪酸梭菌、双歧杆菌产量最高的条件为好。例如，培养基的PH范围可为4-9，尤以接近中性为好。
本发明相比现有技术具有如下优点：
1、本发明首次将酪酸梭菌和双歧杆菌联合制成新的微生态制剂，利用酪酸梭菌除能调整和补充正常菌群外，还能与双歧杆菌、乳酸菌等肠内的有益菌共生，并促使其增殖和发育功能，来增殖双歧杆菌，使这一双菌制剂更能有效地发挥其调节人体肠道群及提高人体体液免疫力的作用。本发明的防治胃肠功能失调及改善胃肠功能、提高人体体液免疫力的效果经卫生部食品卫生监督检验所对小白鼠进行的试验证实。
2、本发明的组合物急性毒性，经小白鼠口服大于10000mg/kg，无任何中毒症状及死亡情况。
3、本发明组合物的稳定性在常温下留样考察一年，稳定性良好。
本发明还将结合实施例作进一步详述：
实施例一：
一种微生物活菌组合物的制备方法包括下述步骤：(1)将从成人粪便和婴儿粪便中分离出的酪酸梭菌和婴儿型双歧杆菌菌种接种于庖肉培养基，在38℃下，将酪酸梭菌和婴儿型双歧杆菌分别培养10小时和30小时；(2)将(1)接种培养后的菌种进行传种；其中酪酸梭菌传种用GAM(GAM Broth“Nissui”日水制药株式会社)；双歧杆菌传种用Bf液体培养基；均在38℃下厌氧培养，酪酸梭菌培养12小时，双歧杆菌培养36小时；(3)按2.0％的接种比例，酪酸梭菌和双歧杆菌分别用LDS培养基和Bf液体培养基，在36℃下厌氧增菌培养24小时；(4)将(3)增菌培养的菌体培养液(应留样计数)进行14000rpm离心分离得到菌体沉淀，将菌体按体积比1∶1.1加入脱脂牛奶并混匀；牛奶菌液留样计数，测定总量，然后将牛奶菌液放入-70℃低温冰箱预冻14小时；(5)将预冻的牛奶菌液在低温真空下冻干得到菌粉；(6)在酪酸梭菌菌粉和婴儿型双歧杆菌菌粉中按常规制剂比例加入淀粉、蔗糖，并按常规制剂方法制成片剂，每克片剂中含酪酸梭菌活菌数为107个，婴儿型双歧杆菌活菌数为10个，将活菌数计数后得到的菌粉重量称重后再按每克片剂的余量加入淀粉和蔗糖即可得到成品。
所述的疱肉培养基的制备方法是以重量份计将牛肉水500份、酪素水解液500份混合过滤后，煮沸10分钟，并调节其PH值为7.8，然后再加入明胶5份、琼脂份1.1份、葡萄糖6份，溶解、调节PH值为8，并灭菌即可制成。
所述的Bf液体培养基的制备方法是按重量份计在1000份西红柿汁中加入0.5份淀粉、14份蛋白胨、5份酵母粉、25份葡萄糖、5份氯化钠、0.8份吐温-80，依次加热溶解，并调节PH值为6，灭菌即制成。
所述的LDS培养基的制备方法是按重量份在1000份蒸镏水中加入17份胨、4份酵母粉、4份淀粉、12份磷酸氢二钠、12份硫代乙醇酸钠，依次加热溶解后，调节其PH值为8，灭菌即可制成。
实施例二：
一种微生物活菌组合物的制备方法与例一同；但存在下述不同：将酪酸梭菌活菌和青春型双歧杆菌活菌数均确定为每克制剂含1010个而得到菌粉的重量，然后再加入硬脂酸镁和抗坏血酸钠至1克制剂，硬脂酸镁与抗坏血酸钠的重量比按常规制剂比例，将制剂制成胶囊。
实施例三：
一种微生物活菌组合物的制备方法与例一同；但存在下述不同：将酪酸梭菌活菌和双歧双歧杆菌活菌数均确定为每克制剂含9×105个而得到菌粉的重量，然后再加入淀粉和维生素B、D至1克制剂，淀粉和维生素B、D的重量比按常规制剂比例，将制剂制成微胶囊。
实施例四：
一种微生物活菌组合物的制备方法与例一同；但存在下述不同：将酪酸棱菌活菌和长双歧杆菌活菌数均确定为每克制剂含6×106个而得到菌粉的重量，然后再加入乳糖、乳酸钙和酪蛋白酸钠至1克制剂，乳糖、乳酸钙和酪蛋白酸钠的重量比按常规制剂比例，将制剂制成粉剂。