利用长叶紫菜生产高吸光度藻红素的用途及其方法 【技术领域】
本发明是有关于用长叶紫菜(Porphyra dentata)生产具有高吸光度(OD)比值藻红素的用途及其方法。利用长叶紫菜生活史中具有的有性生殖、无性生殖与营养繁殖三个世代交替及果孢子丝状体阶段不含各种胶类的特征下，在控制的光线、温度及营养条件下，延续其丝状体阶段，并进一步以其为材料，萃取高吸光度比值藻红素。
背景技术
不论就藻红素、藻蓝素或其它天然蛋白质色素而言，通常具有实用安全性，对热、酸碱度等亦具相当程度的稳定性，可应用于食品与化妆品上，同时亦可作为免疫学上抗体标志用的荧光色素而应用于临床诊断及细胞生化学研究上。
目前市场已开发并应用的有藻蓝素(phycocyanin)与藻红素(phycoerythrin)，其中，藻蓝素生产的原料来源多为可予大量繁殖培养的蓝绿藻，如螺旋藻(Spirulina)与铜锈微囊藻(Microcystis)，且其培养与生产方法多享有专利。
而藻红素则因原料的缺乏，或因原物料不利于色素生产，而存在产量少及价格昂贵的缺陷，对全球每年数万磅食用红色色素的需求，必须开发一种天然、安全、稳定又具特殊荧光释出的红色色素，预估大量生产后，将使价格下降，更会扩大其应用范围与市场供给。
目前藻红色素蛋白大部分是分离自红藻的大型叶状体，如紫菜(Porphyra)或仙菜藻(Ceramium)等，少部分则萃取自可大量控制培养的紫球藻(Porphyridium)。其主要问题在于：
1、目前虽有野生大量红藻资源及栽培的紫菜作为藻红素原料，但因多数红藻含丰富胶质物(洋菜胶、鹿角菜胶、红藻胶)，导致色素地萃出不易，尤其是干燥后的藻类原料更是如此，再加上野生藻种的原料在品和产量上均有季节性差异，为人力所不易掌握。
2、目前紫球藻的培养于收集细胞时，亦有显著的困难，因为单细胞藻体的收集一向是耗能而耗时的操作，影响生产成本甚大，而藻细胞于培养时所分泌的可溶性多醣类，除了阻碍细胞的收集外，亦影响到色素的抽取。
为了解决上述的问题，美国专利5,358,858提出了一种由头发菜(Bangiaatropurpurea)及狭叶紫菜(Porphyraangusta)丝状体生产藻红素的方法，利用头发菜及狭叶紫菜生活史中的丝状孢子体阶段不含各种胶类的特征下，利用控制的光线、温度及营养条件下，延续其丝状体阶段，并进一步以其为原料，萃取藻红素，其步骤如下：
1、丝状体的培养与繁殖，从野外采集成熟的头发菜或狭叶紫菜配子体，以灭菌海水及毛笔清洗藻体干净，稍阴干后投入含改良过的SWM-III(如表一所示)培养皿中，培养皿内底部铺有盖玻片，待孢子释放并附着于盖玻片后，在室温下、1000-4000lux的照度及每日10-16小时照光的培养箱中发芽成长，最后发育呈分歧多枝的丝状孢子体。
表一SWM-III的组成
NaNO3 8.5g/100ml 取2ml
Na2HPO4 0.595g/100ml 取2ml
Na2EDTA 0.5g/100ml 取2ml
0.01625g/100ml 取2ml
FeCl3(或FeCl3·7H2O)0.02885g/100ml 取2ml
*1PI-metal 取2ml
*2S-3Vitamins 取2ml
Soil extract 取50ml
Tris(10cc/l) 取500mg
Livere xtract 取10mg
海水pH＝7、5 1升
(调pH时：先以浓HCl调至pH≤7，再以适当浓度的NaOH调至pH7、5，如此可免于消毒时产生白色沉淀)
其中*1PI-metal为：
H3BO3 12.368g
MnCl2 1.385g
ZnCl2 0.109g
蒸馏水 2升
CoCl2·6H2O 4.479mg
CuCl2·2H2O 0.034mg
其中*2S-3Vitamins为：
ThiaminHCl 0.5g
Capantothenate 0.1g
Nicotinicacid 0.1g
P-aminobenzoicacid 10mg
Biotin 1mg
蒸馏水 2升
Inositol 5g
Folic acid 2mg
Thymine 3mg
B12 1mg
(所有的Stock溶液均存于褐色瓶中，冷藏保存)
2、丝状体刮下后移至含培养液的三角瓶，在上述生长环境条件下培养，育成丝状体的聚集团。打碎丝状体的聚集团，移至更大生长的量瓶继续发育成更多的聚集团，并因此渐次扩大培养的体积，在较大体积的照光培养槽中，应予打气(每分钟300毫升干净空气)大量繁殖培养。通过100-400网目的网布过滤，滤除的培养液可回收再使用，对后续的培养并无妨碍。
3、藻体收获后，因丝状体结构可经真空或温风迅速干燥，再研磨成粉后，以水或磷酸盐溶液予以充分搅拌萃取、离心，可得澄清的深红藻蛋白溶液；藻色素的浓缩与纯化，可通过20％硫酸铵溶液去除部分杂质蛋白沉淀，再于溶液中经60-65％硫酸铵溶液沉淀出色素蛋白，为OD565/OD280＝1.4-1.6的粗红色色素，为食品级、化妆品可用的色素。
4、将沉淀的蛋白进一步通过胶滤层析纯化(gelfiltration)，使用Sephadex G200树酯分离，第一道程序可得OD比为3.3-3.7的藻红素产品，再次重复即可得OD比为5.1-5.2的藻红素，再经胶体电泳法(SDS)电泳所得的结果显示纯度约99％，可作为免疫检验用试剂。
上述的方法虽然可以避免传统紫菜、仙菜藻萃取色素法需以加热及分离胶值的复杂手续，或是紫球藻等单细胞植物萃取法，由于其体积小，导致收集的困难与其分泌的多醣类影响色素的抽取的问题，其主要缺陷在于：
但是头发菜及狭叶紫菜丝状体直接形成的深红藻蛋白溶液，其OD565/OD280只有1.4-1.6，仍需进行藻色素的浓缩与纯化，来获取高OD值的藻红素，造成制程复杂及成本较高。因此我们需要开发其它藻种的丝状体，使其初次形成的深红藻蛋白溶液就具有高OD值的藻红素。
鉴于上述的背景技术中，传统利用头发菜及狭叶紫菜丝状体直接形成的深红藻蛋白溶液，其吸光度比值偏低的问题。本发明人创造出本发明的技术方案。
【发明内容】
本发明的主要目的是提供一种利用长叶紫菜生产高吸光度藻红素的用途及其方法，通过其单位重量含有藻红素的高重量比值，达到降低单位成本的目的。
本发明的又一个目的是提供一种利用长叶紫菜生产高吸光度藻红素的用途及其方法，通过其可萃取具有高吸光度比值藻红素，达到减少藻红素纯化步骤的目的。
本发明的目的是这样实现的：利用长叶紫菜生产高吸光度藻红素的用途，其生活史具有的有性生殖、无性生殖与营养繁殖三个世代交替，利用其孢子丝状体生产高吸光度比值的藻红素。
该孢子丝状体为果孢子(carpospore)丝状体。
该藻种为长叶紫菜(Porphyra dentata)，从其果孢子丝状体中萃取的藻红素，经高效能液相层析仪所得出的565nm的层析光谱图。
该长叶紫菜果孢子丝状体生产高吸光度比值的藻红素，包含下列步骤：以培养液培养长叶紫菜含成熟果孢子囊的配子体并得到果孢子；将该果孢子置于15-30℃下，500-6000lux的照度与明暗比为10∶14以上的环境下培养，使其长成为丝状体；收集该丝状体；加入酸碱缓冲液，加以搅拌、离心，以得到深色色素蛋白溶液；及以盐析法去除该深色的色素蛋白溶液中杂质，并沉淀出色素蛋白。
该培养液为SWM-III培养液。该SWM-III培养液为去有机物的SWM-III培养液。培养该果孢子丝状体的方法为旋浮培养法。培养的环境为20℃，2000lux的照度与明暗比为12∶12。
收集该丝状体的步骤更包含：以网布收集法收集该丝状体；干燥该丝状体；及研磨该丝状体，使其成为粉末。网布收集法使用20-400网目网布。干燥该丝状体的方法为真空法。干燥该丝状体的条件为温风法。离心的条件为转速6000rpm、时间10min及温度4℃。该酸碱缓冲液为磷酸钾溶液，以维持溶液pH值在5-10之间。盐析法去除杂质为加入20％硫酸铵溶液。盐析法沉淀色素蛋白为加入60-65％硫酸铵溶液。更包含以超过滤法(ultrafiltration)纯化分离出藻红素。更包含以胶滤层析法纯化分离出藻红素。胶滤层析法为使用SephadexG200的胶滤层析法。
下面结合较佳实施例和附图详细说明。
【附图说明】
图1是利用高效能液相层析仪(HPLC)得出的藻红素UV吸收及荧光发散层析光谱图；
图2是头发菜生活史的示意图；
图3是狭叶紫菜生活史的示意图；
图4是海面生活史的示意图；
图5-图7是传统的头发菜萃取出的纯质藻红素经高效能液相层析仪所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。
图8-图10是传统的狭叶紫菜萃取出的纯质藻红素经高效能液相层析仪所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。
图11-图13是本发明的长叶紫菜萃取出的纯质藻红素经高效能液相层析仪所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。
【具体实施方式】
下面的较佳实施例仅为说明本发明，还可以广泛地在其它藻种的实施例施行，且本发明的范围不受下面较佳实施例的限定。
众所周知，藻胆蛋白是来自藻类体内的一种水溶性荧光蛋白色素。因其具有特殊的荧光性质，目前主要被广泛的运用于流动细胞仪的荧光试剂上。各种藻胆蛋白中，藻红素是其中的一种，亦是天然物中荧光强度最高的一种，因此有许多荧光检测方法采用此类色素。
图1为藻红素利用高效能液相层析仪(HPLC)得出的UV吸收及荧光发散层析光谱图，其层析条件如下所述：
HPLC column：HYDROCELL DEAE NP10
Column size：50*4.6mm
Buffer A：10mMK-PBS pH6.0
Buffer B：10mMk-PBS，0.5M NaCl pH6.0
Gradient：0％ Buffer B→12min→50％Buffer B
Detection：565nm
Flow rate：1ml/min
而高效能液相层析仪主要由高精密度高压泵体、分离管、侦测仪和记录器所组成。
参阅图2所示，观察头发菜生活史，有性生殖为产生造果器6(即雌性配偶体5)与精子囊2(即雄性配偶体1)释放的精子3受精4之后，在果孢子囊7会发育成果孢子8，里面的果孢子8成熟后，即会散出，变成丝状孢子体9，在侧腰状色素体b作用下，成长为胞子体10和壳胞子囊11，其放出壳胞子12在单胞子形成部位15进一步成长为幼体13、单列藻体14，在星状色素体a作用下，形成单胞子16，单胞子16进一步形成直立体(配偶体)18、多列藻体17成长为雄性配偶体1。
无性生殖则是由单孢子16直接发育成萌发成幼体13、单列藻体14及小型藻体，等到一定时候又可产生单孢子16，单孢子16又萌发成单列藻体14及小型藻体，如此循环一直到适当的环境条件下，单列藻体14及小型藻体所产生的单孢子16就可萌发成大型藻体17。同时，单列藻体14及小型藻体也能转变成大型藻体17，再进入有性生殖世代。
参阅图3所示，观察狭叶紫菜生活史中，由于其与图2的头发菜生活史大体相同，故不详述。我们可以得知上述两种藻类的生活史一般是有性生殖及无性生殖两个世代交替，传统技术就是利用丝状孢子体阶段不含各种胶类的特征，在控制的光线、温度及营养条件下，延续其丝状体阶段，并进一步以其为原料，萃取藻红素。
参阅图4所示，观察海面(Nemalion)生活史，由于其与图2的头发菜生活史大体相同，故不详述。藻类的生活史除了是以有性生殖及无性生殖两个世代交替外，另外部分藻类还多出一个营养繁殖世代，即产生四分孢子的孢子体(即四分孢子体)，其过程为造果器受精后形成果孢子体(carposporephyte)、果孢子(carpospore)、四分孢子体(tetrasporophyte)、四分孢子囊(tetrasporangium)、最后是四分孢子(tetraspore)，其中果孢子与四分孢子都会萌发成丝状体，但此两种丝状体的特性不同。
本发明就是利用具有营养繁殖世代的长叶紫菜，其果孢子丝状体阶段不含各种胶类的特征，在控制的光线、温度及营养条件下，延续其丝状体阶段，并进一步以其为原料，萃取出具有高OD值藻红素，其步骤如下：
1、丝状体的培养与繁殖，将成熟的长叶紫菜含成熟果孢子囊的配子体，以灭菌海水及毛笔清洗藻体干净，稍阴干后投入不含有机物的SWM-III培养液的培养器中，培养器内底部铺有玻璃片，待果孢子(carpospore)释放并附着于玻璃片后，在温度15-30℃下，500-6000lux的照度，明暗比为10∶14以上及每日10小时以上照光的培养器中发芽成长，最后发育呈分歧多枝的丝状体。
2、丝状体刮下后移至含培养液的大型培养槽，在上述生长环境条件下培养，可育成丝状体的疏松小聚集团，并因此渐次扩大培养的体积，在较大体积的照光培养槽中，应予打气使该小聚集团悬浮于培养液中(称为旋浮培养)大量繁殖培养。通过20-400网目的网布过滤，滤除的培养液可回收再使用，对后续的培养并无妨碍。
3、藻体收获后，因丝状体结构可经真空或温风迅速干燥，再经自动磨粉机研磨成粉后，取2.4公克重的粉末，加入70毫升、10mM的磷酸钾溶液或其它酸碱缓冲液予以充分搅拌，以维持溶液pH值在5-10之间予以充分搅拌、再以6000rpm、10min及4℃的状态下离心，可得澄清的深红藻蛋白溶液。藻色素的浓缩与纯化，可通过20％硫酸铵溶液去除部分杂质蛋白沉淀，再于溶液中经60-65％硫酸铵溶液沉淀出色素蛋白，其为OD565/OD280＝2.66的粗红色色素，为食品级、化妆品可用的色素。
上述澄清的深红藻蛋白溶液也可以用直接收获的湿藻体磨碎加磷酸钾溶液后再离心取得，而藻色素的浓缩与纯化可通过超过滤法(ultrafiltration)来进行。
4、将沉淀的蛋白进一步通过胶滤层析纯化(gelfiltration)，使用120公分长的Sephadex G200树酯分离，第一道程序可得OD比为4.5以上的藻红素产品，再次重复即可得OD比为5.3以上藻红素，再经胶体电泳法(SDS)电泳所得的结果显示纯度约99％，可作为免疫检验用试剂。
参阅图5-图7所示，为传统从头发菜萃取出的纯质藻红素经高效能液相层析仪(HPLC)所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图，
参阅图8-图10所示，为传统从狭叶紫菜萃取出的纯质藻红素经高效能液相层析仪所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。实际上，从不同的藻种中所萃取出的藻红素，其经高效能液相层析仪所得出层析光谱图亦有所差异，就像人类的手指指纹一般。因此，我们可以通过此一特性来分辨出藻红素是由何种藻种所生产。
参阅图11-图13所示，是本发明从长叶紫菜取出的纯质藻红素经高效能液相层析仪所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。
表二为传统的头发菜、狭叶紫菜与本发明的长叶紫菜萃取藻红素的比较表。
第一列为单位藻类重量(克)含藻红素重量(毫克)的比值，代表在相同的藻类重量下可以产出的藻红素，我们可以清楚得知：本发明的长叶紫菜，其含藻红素的比值为最高。
第二、三列为从藻种中萃取出藻红素的吸光度比值(OD565/OD280)及(OD615/OD565)，前者表示藻红素和其它蛋白质纯度的比例，后者表示藻蓝素和藻红素的纯度比，(OD565/OD280)比值越高表示藻红素纯度越高，其附加价值越高，越具有食品或化妆品色素利用价值，也越有利后端制成纯化，因可应用于医疗的免疫检验用试剂上；而因为藻蓝素会吸收藻红素所发出的荧光，造成作为在食品或化妆品色素用途时荧光颜色不佳，因此(OD615/OD565)越低表示藻蓝素含量越少，在荧光颜色效果上更佳。同样地，我们可以明显看出：本发明的长叶紫菜，其萃取出藻红素具有最高的吸光度比值。因此，利用本发明的长叶紫菜丝状体来萃取藻红素，其较传统头发菜和狭叶紫菜的丝状体，具有高藻红素含量与高吸光度比值的优点。
表二 各藻种藻粉色素成份分析 藻种 Ba Pa Pd RPE mg/g藻粉 53.5 38.89 44.98 吸光比值A565/A280 1.40 1.54 1.96 吸光比值A615/A565 0.19 0.53 0.21
其中
RPE：一种藻红蛋白，具有亲水性并在水与形成稳定性水溶液，其最大UV吸收波长及荧光发散波长各为566nm及575nm。
Ba：传统头发菜(Bangia atropurpurea)
Pa：传统狭叶紫菜(Porphyra angusta)
Pd：本发明的长叶紫菜(Porphyra dentata)
本发明是通过举出一个较佳实施例来描述，但是本发明并不限定于所举出的实施例，显而易见地，其它未脱离本发明所揭示的精神下，所完成的等效改变或修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。
综上所述，本发明的实施例能达到所预期的功效，又其所揭露的具体构造，不仅未曾见诸于同类产品中，亦未曾公开于申请前，具有新颖性、创造性和实用性。