一种止血药 技术领域
本发明涉及一种蛇毒激凝酶止血药，该药物含有凝血因子十激活剂(RVV-X)和协同剂--蛇毒类凝酶(Thrombin-like Enzyme)。更优选的是，该止血药还含有血清白蛋白、例如人血清白蛋白。
背景技术
1934年Macfarlane等发现蝰蛇毒具有十分显著的凝固作用，当它稀释1000倍时能在17秒钟使血友病人的血液凝固(参见The Lancet，“DRS.MACFARLANE & BARNETT：HAEMOSTATICPOSSIBILITIES OF SNAKE-VONOM”，Nov.3，1934，第985-987页)。国外早期一些地区将其用作外用的局部止血，例如拨牙的止血(参见The Lancet，“CLINICAL AND LABORATORY NOTES”，Feb.22，1936，第428页)，并且使用的是全毒，即未经分离和提纯的初毒，代表制品是Stypven(Wellcome UK)，该制品多用作诊断试剂(参见BloodReviews(1993)7.176-189)。
国内临床上也有蝰蛇毒试剂合用作诊断试剂，诊断血浆中凝血因子X是否缺乏。2000年4月5日公开的中国专利申请CN1249338A，“一种高效提取凝血因子十活化酶的方法”中介绍本品用于研究肿瘤迁移机理等科研领域，而将提取纯化后的RVV-X用于止血目的未见报导。
基于上述情况，发明人开发出含有RVV-X的止血药，并筛选了协同剂，蛇毒类凝酶及稳定剂、例如人血清白蛋白等，另外筛选辅料制备了注射用蛇毒激凝酶。
国外进口的立止血(参见Hand b Exp.Pharm.52 Snake Venom andBlood Coagulation 1991，Reprinted by Sigma Chemical Company)是从巴西矛头腹蛇(Bothrops atrox)中提取的类凝酶和凝血因子十激活剂的混合物，而在我国同时含有这两种酶的蛇种缺乏，到现在还未发现哪种蛇毒中同时含有类凝酶及RVV-X。
国内有立止血的仿制品—巴曲亭，但需要进口原料—巴西矛头腹蛇(Bothrops atrox)毒。
发明目的
本发明的一个目的是提供具有协同作用的止血药。
本发明的另一目的是提供具有稳定作用的止血药。
本发明再一个目地是提供高纯度RVV-X的提取方法。
本发明再一个目的是提供RVV-X的止血用途，以及RVV-X在制备治疗止血药物中的应用。
发明概述
本发明提供了一种具有协同作用的止血药物，该药物含有RVV-X和类凝酶，在该药物中RVV-X与类凝酶的单位比为100～1∶20～0.01，优选为50～8∶5～0.5。
本发明还提供了一种具有稳定作用的止血药物，该药物除含有RVV-X和类凝酶之外，还含有血清白蛋白、例如人血清白蛋白。在该药物中RVV-X：类凝酶∶血清白蛋白的单位比例为100～1∶20～0.01∶20～0.02，优选为50～1∶6～0.2∶10～0.01(单位∶单位∶毫克)。
本发明还提供了一种RVV-X的分离纯化方法，该方法是用Sephacryl系列分子筛柱粗分和Q-Sepharose系列离子交换柱精分两个步骤实现的。
本发明还提供了RVV-X的止血用途，以及RVV-X在制备治疗出血药物中的应用。
附图说明
图1：RVV-X分子量测定质谱图(MALDI-TOF-MS) 1、初毒
2、3、4半提纯的RVV--X
图2A：RVV-X SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 5、RVV--X对照品
6、本工艺提纯的RVV-X
图2B：RVV-X SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量图谱
1、2、还原型的RVV--X
图3：RVV-X HPLC高效液相色谱图 3、标准蛋白
4、～6、不同点样量的RVV-X(非还原型)
图4：RVV-X HPLC高效毛细管电泳图谱
发明详述
本发明提供了一种RVV-X的分离纯化方法，该方法是用Sephacryl分子筛柱粗分和Q-Sepharose离子交换柱精分两个步骤实现的。
将购买的蛇毒，直接上柱分离提取。
具体方法如下。
柱子：2.6×100(cm)。
平衡缓冲液：0.05M pH 9～6.2 tris-H3PO4缓冲液。
洗脱液：(A)：0.05M pH9～6.2 tris-H3PO4缓冲液。
(B)：0.05M pH8～5.0 tris-H3PO4缓冲液。
上样：取蛇毒500mg用8ml平衡缓冲液溶解，以3500rpm的转速离心5分钟，取上清液上样。
洗脱速度：2～0.1ml/min(30ml/小时)，洗脱液0.05M pH9～6.2 tris-H3PO4缓冲液。
鉴定：使用LKB核酸蛋白检测器于280mm处检测蛋白洗脱峰。合并活性管。可收集38.0～30.0ml(含90～80mg蛋白质)。
将部分纯化的酶液泵入离子交换柱。所用柱子和平衡液同上。洗脱：先用0.05M pH9～6.2 Tris-H3PO4缓冲液60～30ml淋洗，除去吸附的杂蛋白，然后改用0.05M pH8～5.0 Tris-H3PO4缓冲液100～60ml淋洗，当OD280＜0.005时，改用0.05M pH6.0 Tris-H3PO4缓冲液150～90ml和0.5M NaCl的同一Tris-H3PO4缓冲液进行线性梯度洗脱(5～0.1ml/min，24ml、h)，每管8～2ml进行收集，检测同上。
将已纯化的酶对蒸馏水透析两次(脱盐)，除菌过滤、冻干即得。
本发明方法提供了高纯度的RVV-X，其纯度鉴定由以下测试证实(参见The Journal of Biololcal Chemistry.269，No 14，10644-10650，1994)。用MALDI-TOF-MS质谱仪测定分子量(见图1)，测得分子量为92827D，与文献一致。用ABI Procise 491序列测定仪测定N末端氨基酸序列(见下表1)。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带(见图2A)，分子量测定为92967D(见图2B)。HPLC高效液相色谱：Progel TSK G3000SW柱上呈现一个峰(见图3)。高效毛细管电泳仪测得一个峰(见图4)。
氨基酸序列分析鉴定结果如下表1所示：
No. 残基
1 Val
2 Leu
3 Asp
4 Cys
5 Pro
6 Ser
7 Gly
8 Trp
9 Leu
10 Ser
11 Tyr
12 Glu
13 Gln
14 His
15 Cys
上样程序：PVDF
测序仪：ABI Procise 491
从上述分析结果表明本发明方法制备的RVV-X为色谱纯品。
本发明还提供了RVV-X的止血用途。所述RVV-X的止血作用可以通过以下试验得以证实。
采用同类产品活性测定方法进行RVV-X体外凝血试验，具体方法按下表，用50mMol/LCaCl2溶液制备RVV-X不同浓度的供试品溶液，取小试管(12×75mm)7支。预先加入人-枸橼酸血浆(采用三人份以上的混合血浆)0.2ml，置37℃±0.5℃水浴中保温2分钟，加入37℃预热的RVV-X的供试品溶液，立即混匀，计时，到血浆凝固，停止计时。结果见表2。
表2 RVV-X体外凝血试验结果： 实验次数 RVV-X剂量(ng) 凝固时间(秒) 1 5 62.3(n＝5) 2 10 54.6(n＝5) 3 20 46.0(n＝5) 4 50 48.0(n＝2) 5 100 35.5(n＝2) 6 200 33.0(n＝2) 7 300 34.0(n＝2)
上表表明：由于血浆中因子X的浓度是固定的5μg/ml血浆，当底物反应完成后，再增加酶浓度，作用则不明显。当蛇毒激凝酶剂量大于50ng后(稀释2.0×107)，凝固时间不再明显缩短。
按照临床前研究指导原则规定的方法：小鼠断尾法进行RVV-X体内凝血试验
RVV-X和类凝酶单独以及协同止血试验。具体方法如下
1.RVV-X分别配制0.05U/ml及0.1U/ml的供试品溶液
2.类凝酶分别配置2.5×10-3U/ml，0.5×10-2U/ml及
2.类凝酶分别配置2.5×10-3U/ml，0.5×10-2U/ml及1.25×10-2U/ml的供试品溶液。
用断尾法测定小鼠出血时间。
取健康小鼠，随机分为7组，每组5只，按表中剂量小鼠尾静脉注射0.1ml分别于注射后0.5、1、3小时，用剪刀在距小鼠尾尖0.5cm处剪断，血液自行流出后立即计时，到血液凝固停止计时。以出血时间缩短作为判断止血效果的指标。同时给予立止血0.1U/kg作为阳性对照，给予生理盐水作为阴性对照。
结果见下表3～7
注：“-“为缩短出血时间，”+“为延长出血时间
表3类凝酶(A)和RVV-X(B)单独止血试验结果：组成 剂量U/kg小鼠编号 注射前 后0.5h 后1.0h 后3.0h A 0.00025 1 1’35”1’1’45”3’15” 2 2’50”49”2’30” 3 50”56”57”4’ 4 1’10”1’15”1’1’10” 5 1’20”1’45”55”3’ 平均 83”69.2”65.2”167” 缩短出血时间-13.8”-17.8”+84” A 0.0005 1 2’10”1’15”2’2’10” 2 2’1’43”1’05”3’ 3 1’20”47”1’1’50” 4 1’13”1’07”1’2’10” 5 1’04”40”1’05”2’09” 平均 93.4”66.4”74”135.8” 缩短出血时间-27.4”-19.4”+42.4” A 0.00125 1 1’30”2’40”1’30”1’48” 2 3’03”1’25”1’05”1’ 3 2’45”1’08”1’30”4’ 4 3’15”3’40”1’45”2’40” 5 3’18”3’05”1’06”4’34” 平均 166.2”143.6”83.2”168.4” 缩短出血时间-22.6”-83.0”+2.2” B 0.005 1 70”55”40”120” 2 80”1’12”55”1’25” 3 105”3’30”1’18”1’24” 4 70”1’46”2’2’01” 5 75”1’50”1’25”4’ 平均 80”110.6”83”122” 缩短出血时间+30.6”+3.0+42” B 0.01 1 118”79”125”120” 2 11693”50”194” 3 68”56”47”180” 4 72”85”80”101” 5 90”106”80”115” 平均 92.8”83.8”76.4”142” 缩短出血时间-9.0”-16.4”+49.2”
表4阳性对照及阴性对照止血试验结果 阳性对照 小鼠 编号 注射前 后0.5h 后1.0h 后3.0h 立止血0.1U/Kg 1 1’30” 50” 1’12” 2’10” 2 1’10” 2’10” 60” 1’12” 3 1’58” 2’34” 1’23” 3’ 4 1’11” 40” 60” 3’38” 5 1’50” 1’37” 1’45” 1’55” 平均 91.8” 94.2” 76.0” 1’23” 缩短出血时间 +2.4” -15.8” +51.2” 阴性对照 盐水 1 1’10” 55” 1’ 1’10” 2 1’19” 58” 1’40” 1’48” 3 1’10” 1’49” 3’ 3’ 4 1’11” 1’25” 2’ 3’40” 5 1’04” 58” 1’30” 1’10” 平均 70.8” 73” 110” 129.6” 缩短出血时间 +2.2” +39.2” +58.8”
表5小鼠断尾法测定止血时间(秒) 蛇毒激凝酶 对照：进口立止血 小鼠 编号 剂量 U/kg 注射 前 注射后 小鼠 编号 剂量 U/kg 注射 前 注射后 0.5h 1h 3h 0.5h 1h 3h 1 0.01 118 79 125 120 1 0.1 90 50 72 130 2 116 93 50 194 2 70 130 60 72 3 68 56 47 180 3 118 154 83 180 4 72 85 80 101 4 71 40 60 218 5 90 106 80 115 5 110 97 105 115 平均 92.8 83.8 76.4 142 平均 91.8 94.2 70.6 143 缩短 出血 时间 -9.0 -16.4 +49.2 +2.4 -15.8 +51.2
表6小鼠断尾法测定止血时间(秒) 蛇毒激凝酶 对照：进口立止血 小鼠 编号 剂量 U/kg 注 射 前 注射后小鼠编号 剂量 U/kg 注射前 注射后 0.5h 1h 3h 0.5h 1h 3h 1 0.015 115 100 81 197 1 0.1 117 100 102 115 2 125 120 105 230 2 150 130 103 175 3 100 90 80 120 3 110 100 160 170 4 135 100 103 150 4 100 110 72 190 5 120 95 65 144 5 174 120 115 142 平均 119 101 86.8 155.8 平 均 130.2 112 110.4 158.4 缩短 出血 时间 -18 -32.2 +36.8 -18.2 -19.8 +28.2
结果表明：随着RVV-X剂量由0.01U/kg增加到0.015U/kg，小鼠出血时间缩短，由16.4秒增加至32.2秒，；两者相比出血时间又缩短了15.8秒。明显优于立止血。证明RVV-X具有很好的止血作用。注：“-”代表缩短出血时间；“+”代表延长出血时间
蛇毒激凝酶在剂量明显小于立止血的情况下(相差10倍)，其止血作用(缩短出血时间)相当，效力基本一致。
表7 RVV-X与类凝酶的协同止血试验结果： A2∶B2(0.00025∶0.005)单位 A3∶B2(0.0005∶0.005)单位 小鼠 编号 注射 前 注射后 小鼠 编号 注射 前 注射后 0.5h 1h 3h 0.5h 1h 3h 1 1′20″ 50″ 1′00″ 2′00″ 1 58″ 3′10″ 1′ 1′47″ 2 1′30″ 1′00″ 50″ 1′45″ 2 1′08″ 39″ 1′10″ 2′15″ 3 2′00″ 1′20″ 40″ 1′46′ 3 1′28″ 45″ 1′20″ 1′30″ 4 1′00″ 55″ 55″ 2′00″ 4 1′10″ 1′45″ 40″ 2′13″ 5 1′10″ 44″ 52″ 2′09 5 54″ 1′22″ 36″ 1′30″ 平均 84″ 57.8″ 51.4″ 116″ 平均 67.6′ 92.2″ 57.2″ 110″ 缩短 出血 时间 -26.2″ -32.6″ +32″ +24.6″ -10.4″ +42.4″
注：“-“为缩短出血时间，”+“为延长出血时间
本发明提供了具有协同作用的止血药物。该药物含有RVV-X和类凝酶。当RVV-X与类凝酶配制成组合给药制剂时，RVV-X的止血作用得到协同，作用得到提高。通过以下的对比试验可以说明其协同止血作用。
从表7看出：本发明提供了具有协同作用的止血药物。该药物含有RVV-X和类凝酶。当RVV-X与类凝酶配制成组合给药制剂时，RVV-X的止血作用得到协同提高。通过以下试验可以说明其协同止血作用。
从表“3”和“7”得到的结论：为：0.00025U/kgA+0.005U/kgB具有协同作用。如下表8所示。
表8 0.00025U/kgA+0.005U/kgB＞0.0005U/kgA＞0.01U/kgB 0.5h-26.2≈-27.4＞-9.0 1h-32.6-19.4-16.4 3h+32.0+42.4+49.2 0.0005U/kgA+0.005U/kgB＜0.00125U/kgA＜0.01U/kgB 0.5h+24.6-22.6-9 1h-10.4-83.0-16.4 3h+42.4 2.2+49.2
本发明还提供了具有稳定作用的止血药物。该药物含有RVV-X、类凝酶和血清白蛋白、例如人血清白蛋白。当在含有RVV-X和类凝酶的药物中加入血清白蛋白时，RVV-X的稳定作用得到加强。通过以下的对比试验可以说明血清白蛋白对于本发明协同止血药物的稳定作用。
表9注射用蛇毒激凝酶稳定剂筛选 处方组成 浓度/ml 处方 1 处方 2 处方 3 处方 4 处方 5 处方 6 处方7 类凝酶 0.02u √ √ √ √ √ √ √ RVV-X 2.0U √ √ √ √ √ √ √ 人血清白 蛋白 6mg 8mg √ - - √ - - - - - - - - - - 甘露醇 30mg √ √ √ √ √ √ √ 甘氨酸 10mg 20mg 40mg - - - - - - √ - - - √ - √ - - - √ - - - √ 冻干之前测定凝固时间 (秒) 41.4 49.4 47.0 42.0 49.8 45.5 42.2 冻干后的第32天测定凝固 时间(秒) 53.9 56.2 107. 2 105. 6 106. 8 128. 0 111.5 增加的凝固时间(秒) 12.5 6.8 60.2 63.6 57.0 83.4 69.3
从表中数据看出处方2最稳定，凝固时间变化最小，从而确定以人血清白蛋白作为稳定剂，并且其含量优选为8mg/ml。
实施例1
按照上表中处方2的组成制备蛇毒激凝酶止血药：按照常规方法取类凝酶1U/ml、RVV-X 5U/ml、人血清白蛋白20mg、甘露醇30mg，将其制成冻干粉针，规格为1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血药。
实施例2
按照上表中处方2的组成制备蛇毒激凝酶止血药：按照常规方法取类凝酶0.8U/ml、RVV-X 1U/ml、人血清白蛋白10mg、甘露醇30mg，将其制成冻干粉针，规格为1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血药。
实施例3
按照上表中处方2的组成制备蛇毒激凝酶止血药：按照常规方法取类凝酶0.01U/ml、RVV-X 0.1U/ml、人血清白蛋白1mg、甘露醇30mg，将其制成冻干粉针，规格为1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血药。
实施例4
按照上表中处方2的组成制备蛇毒激凝酶止血药：按照常规方法取类凝酶1U/ml、RVV-X 0.1U/ml、人血清白蛋白10mg、甘露醇30mg，将其制成冻干粉针，规格为1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血药。