生产疫苗的方法 本发明涉及生产疫苗的方法。
高等生物以免疫系统为特征，免疫系统能够保护高等生物免受具有潜在危害的物质或微生物的侵害。如果物质(抗原)侵入身体，该物质被识别为“外源的”并在免疫系统的帮助下被清除。此外“退化的”内源性细胞通常也由免疫系统识别并从运转中清除。
人的适应性免疫系统由两个基本的成分组成，即体液和细胞免疫。适应性免疫应答基于B和T淋巴细胞的克隆选择，并原则上允许任何一种抗原的识别以及免疫记忆的建立。这些适应性免疫系统的特征一般在接种中有益地呈现出来。
每个B细胞产生一种具有确定的结合特异性地抗体。这些抗体作为特异性受体也存在于产生它的B细胞的膜中。对抗被识别为外源的抗原的体液免疫应答基于那些产生抗体的B细胞的选择性活化，这样的抗体能够与各自抗原的表位结合。对于抗体的多样性，在B细胞分化期间的DNA重排起着决定性的作用。
在人的血清中，大量地存在着具有极大不同特异性、同型和亚类的抗体。血清中所有免疫球蛋白的总浓度为15-20mg/ml；这就是说，大约100g具有极大不同特异性的免疫球蛋白在血液中持续循环。不可能指出具有不同特异性的所有抗体的准确数量，一个人中不同B细胞克隆的全部存量为大约109。一般地，尽管具有不同的亲和性和亲和力，某个确定的抗体能够结合多种彼此类似的抗原。
在内源性调节机制的帮助下，免疫系统必须保持这些不同的特异性的分布和比重的动态平衡。对此一种基本的机制为“独特型网络”(Ann.Immunol.125C：373-89(1974))。针对每个决定其结合特异性的抗体独特型，存在有抗独特型抗体，这些抗体因此与第一个抗体的独特型如同识别抗原般地结合。根据该解释模型，淋巴细胞上独特型-特异性受体之间的相互作用是免疫系统调节的原因。事实上显然发生了这些相互作用，因为显示出在免疫应答的过程中也出现了对抗由免疫应答最初诱导的抗体的抗独特型抗体。由于存在对抗每个抗体的抗独特型抗体，淋巴细胞对于抗体的独特型基本上是不耐受的。
存在有多种干预免疫系统的可能途径。
1.被动抗体疗法：
用于治疗目的，可以向生物体提供抗体，该抗体对于在该生物体中满足某种功能是必需的。这种类型的应用被称为被动免疫疗法，其能够用于多种医学适应症，例如癌症的免疫疗法(Immunol.Today(2000)，21：403)、中毒(Toxicon(1998)，36：823；Therapie(1994)，49：41)和感染(Clin.Infect.Dis.(1995)，21：150)。在这些情况下，可以使用抗体，这些抗体或者来源于经适当免疫的动物，或者可以采用多种生物学或分子生物学技术(例如杂交瘤技术，噬菌体展示技术等等)通过免疫球蛋白基因的无限增殖化从细胞中获得。
被动抗体施用有着不能长期持续作用的缺点，因为其效用会随着受体生物体内所施用的抗体的自然降解而减弱。
2.主动免疫：
为了调节免疫系统，可以使用抗原进行免疫。抗原为抗体能够结合的分子、分子复合物或整个生物体。
不是所有的抗原都可以诱导免疫应答，即不是所有的抗原都是免疫原。某些小分子不被免疫系统注意(半抗原)，这种较小的分子能够以合适的形式呈递给免疫系统从而将其制成了免疫原。一种这样的方法为将半抗原与免疫原性分子即所谓的载体分子偶联在一起。
其他非免疫原抗原为所谓的自身抗原，即被免疫系统识别为内源性物质的结构。用这种抗原进行免疫一般不会导致特异的免疫反应。在肿瘤相关抗原的情况下，这些抗原其实是自身抗原的事实成为开发有效的疫苗中最大的困难之一。
采用完整的抗原进行针对病原体如病毒或细菌的主动免疫的唯一的可能是将病原体经过减毒或杀死。对于减毒的病原体，存在发生复活的风险，即减毒的病原体再次变成有毒力的形式。这一问题的解决办法可以是使用抗独特型抗体作为替代抗原用于免疫(Int.Arch.Allergy Immunol.(1994)，105：211)。
也提出了将使用抗独特型抗体的主动免疫用于过敏反应的治疗(Int.Arch.Allergy Immunol.(1999)，118：119)。
可是，对抗内源性抗原的抗体存在于每个人的血清中，其被称为“天然自身抗体”。
这种天然自身抗体的抗独特型抗体参与了这些自身抗体的调节(Immunol.Reviews(1989)，110：135；Eur.J.Immunol.(1993)，23：783)。
不足的独特型调节似乎在许多自身免疫疾病中起着作用：
-全身性红斑狼疮(Autoimmunity(1994)，17：149)；
-自身免疫甲状腺炎(Eur.J.Immunol.(1993)，23：2945)；
-全身性血管炎(J.Autoimmunity(1993)，6：221)；
-吉兰-巴雷(Guillain-Barre)综合症(Clin.Immunol.Immunopathol.(1993)，67：192)；
-抗凝血因子VII：C自身免疫疾病(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA(1987)，84：828)。
用模拟自身抗原的独特型抗体进行免疫已施用于自身免疫疾病(J.Rheumatol.(1999)，26：2602)。此外，也已描述了用于诱导抗独特型抗体的肽(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA(1993)，90：8747；Immunology(1999)，96：333)。
同样地也已经提出了基于T细胞受体的自身免疫疾病中的免疫(J.Immunol.(1990)，144：2167；US-PS 6,090,387；US-PS 6,007,815)。
主动免疫也可用于抗毒性物质(例如细菌毒素)的保护。如果在毒素将用作疫苗的情况下，它们必须事先减毒或者失活。可是这样的失活也可能影响免疫应答的效能。已经有作为模拟毒素的疫苗的抗独特型抗体的建议(Int.J.Clin.Lab.Res.(1992)22：28；Clin.Exp.Immunol.(1992)89：378；Immunopharmacology(1993)26：225)。
也已经提出对于第一次免疫使用抗独特型抗体，以便随后可用单独使用则效能太弱的疫苗获得较高的特异性免疫效能(Virology(1984)136：247)。
3.从血液中抽取抗体和免疫复合物：
从血液中去除抗体的一种可能途径为使用灌注系统(US-PS5,122,112)，其主要应用于自身免疫疾病(The Lancet(20.10.1979)，824)。可是，这种体外免疫吸附对于患者造成巨大负担和高治疗风险，所以这种方法不适合于广泛的临床治疗。
目前可以用某些抗原进行用于调节的主动免疫，这些抗原可能具有太强的毒性或者潜在的传染性或者是非免疫原。这一问题的部分解决办法为使用抗独特型抗体用于免疫。然而必需的是在细胞培养物中或体外制备这种抗体，或者也可以在某些生物体中诱导出它们，然后将它们施用于另一个生物体。
因此，本发明的一个目的为克服现有技术的缺点，并利用患者的免疫系统来提供用于多种疾病的治疗材料和方法以供使用。尤其是形成用于自身免疫疾病、过敏反应和相似疾病的有效治疗策略。
因此，本发明的目的为生产含有自体性抗体的疫苗的方法，其特征在于下列步骤：
-由含有自体性抗体的体液或者由自体性细胞或组织制备物制备含有抗体的液体；
-用固体载体处理含有抗体的液体，在固体载体上固定有与特定的抗体群结合的配体，其具有这样的规格，即作为配体不使用具有相同独特型的定向对抗肿瘤相关抗原的抗体或其片段；
-获得与配体结合的抗体；和
-加工获得的抗体以形成自身性疫苗，该疫苗含有大于1微克的免疫原性数量的抗体。
现在可以合适的方式将如此获得的疫苗施用于患者。根据本发明建立的方法解决了文端所描述的问题，该方法在生物体中诱导对抗“目标”抗体的抗体，而所应用的生物体恰恰是产生这种“目标”抗体的相同生物体。因此，不管是细胞体外培养还是在外源供体生物体中制备抗体都不是必需的。“目标”抗体为例如对于可选择地诱导抗独特型抗体的抗原具有特异性的ab1抗体；或者ab2抗体即抗独特型抗体，其可产生免疫应答并可选择地定向对抗抗独特型，也就是说其同样地对抗抗原。
同样地，不再需要从库或血浆库中获得根据本发明所获的抗体(参看Zouali等人，J.Immunol.135(2)(1985)，第1091-1096页)。从库中制备抗体时要从各种不同的个体中收集抗体，与此相反，使用根据本发明的抗体制备方法可以生产出含有100％自体性抗体的疫苗，这些疫苗的作用在待治疗的个体的独特型网络中是完全特异的，因此会更有效。
由此将免疫系统的个体特异性调节指向各自所希望的目的就会成为可能。通过施用含有根据本发明生产出的疫苗的自身性疫苗来推动免疫平衡，以确保选择性刺激那些产生某种特异性抗体的B细胞。这种特异性可以通过从个体中分离出抗体(通过配体的选择)的方式来测定。
含有抗体的体液优选为血液、血清、淋巴液、脑脊液、初乳、粘膜体液如阴道分泌液或鼻分泌液、恶性渗出液、粪便或者尿液，而同样好的是将可由活组织检查获得的自体性细胞或组织制备物通过大量本身已知的方法加工成根据本发明含有所使用抗体的液体。根据本发明，主要将那些具有非常高的抗体含量的体液用作起始材料，对于此，人血清或血浆当然是特别优选的。
对于根据本发明获得的疫苗在影响独特型网络中的特异性起决定作用的当然是每次在当前的免疫亲和纯化中配体的选择。为了获得特异性抗体成份，可以使用特异的单克隆或多克隆抗体或者抗原。单克隆抗体或其衍生物可以根据本身已知的方法来生产，如杂交瘤技术、噬菌体展示技术或重组(Immunology Today，2000，21：全部期号8)。但也可以使用能够与免疫球蛋白的某些特异的亚类或亚型(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种或多种，或者IgA、IgG、IgM、IgE或IgD)结合的不依赖独特型的配体。此外，可以挑选出识别某一群抗体片段或抗体链(例如至少部分的λ或κ链，Fc或Fab片段)的配体。同样地，合适的配体不仅可以选择性地与抗体结合，而且可以选择性地与相应的同型或副球蛋白结合。
根据本发明的方法可以进一步与相似的用于生产自身性疫苗的方法联合，其中相同独特型的抗体或者它们的片段也可以用作配体，它们定向对抗肿瘤相关抗原和/或抗体。在此对于简单的方法来说，将相应的配体以混和物来使用是优选的。更复杂的方法包括连续地或平行地用不同的配体处理体液。因此，例如可以从血清中获得特定的抗体成份，其具有对于细胞粘着蛋白和/或Lewis Y糖结构的特异性，或者具有对于B细胞淋巴瘤的特异性，然后立即将其作为自身性疫苗配剂提供利用。
根据本发明制备的自身性疫苗含有与B细胞淋巴结瘤相关出现的抗体，其包含尤其只含有特定亚类或级分的含IgG血清成分，从而确保产生定向的免疫应答。
对于根据本发明的分离可以使用例如抗体或抗体片段(如Fc或Fab片段)。可是配体也可以为免疫球蛋白能够结合的其他物质，例如用于层析纯化免疫球蛋白的配体、亲和肽、亲和多肽、蛋白质(如A蛋白或G蛋白)或者例如也可用于离子交换层析的离子结构。
在挑选合适的固定化配体时，通常要注意避免配体或配体-抗体复合物渗漏进分离获得的抗体成份中。在一些情况下，进行一系列的抗体纯化也是适宜的，这是为了分离由于固定化的配体而可能存在的污染物。可是，如果希望制备物中含有某些配体-抗体复合物，那么材料的渗漏也可能是有利的。
特别高质量的疫苗的生产可以包括用已知的方法进一步纯化所获抗体，例如层析、凝胶渗透、沉淀、在液体或固体相(特别是铁磁性颗粒)上的分离或者超/渗滤。
在加工的过程中可能需要将配剂制备成稳定的溶液，例如通过添加保存剂或配位物质或者佐剂。如果患者应当以一定的时间间隔用同样的制剂分几次进行免疫，那么首先希望根据本发明生产的自身性疫苗的实施方案是贮藏稳定的。
另一方面，施用每次新制备的疫苗具有以下优点，即每次将免疫系统的改变纳入考虑之中，以及在很大程度上防止逃逸突变体(Escape-Mutanten)(例如产生抗体的细胞或传染性病原体)的出现。对此，将获得的抗体简单加工成疫苗是合适的，这在最好的情况下是可以就地进行的。因此，例如根据本发明生产出的疫苗可以在抽血之后一个工作日内立即施用，或者甚至在患者进行治疗的时候进行施用。
根据本发明的方法的进一步实施方案涉及疫苗中不希望存在的体液成分的排除。因此，可以挑选出选择性地不结合特定的抗体但结合伴随物质的配体，从而随后从未结合的成份获得特定的抗体。
根据本发明，应当将具有含有抗体的体液或组织的单个人或动物生物体理解为个体。当然，根据本发明的制剂优选地用于脊椎动物，特别优选地用于哺乳动物，尤其是人。
按照本领域技术人员已知的方法可以通过免疫亲和纯化从含有抗体的动物体液(例如人血清)中分离抗体(Clin.Chem.(1999)，45：593；J.Chem.Technol. Biotechnol.48(1990)，105)。特别优选的为固相免疫亲和纯化。在此方法中，特异性配体或不同配体的混和物固定在固体相上。固体相可以为膜、凝胶、层析材料或相似的材料，配体能够与这些材料偶联而不造成这些配体的特异性结合特性的实质性损失(Mol.Biotechnol.(1994)1：59)。
对于根据本发明直接制备疫苗也可以提供现成的试剂盒来使用。该试剂盒含有下列组成：
a)含有配体的装置，用于结合特定的抗体群，这些抗体来自个体中含有抗体的体液，
b)用于获得与配体结合的抗体的试剂，和
c)用于将获得的抗体加工成自身性疫苗的试剂。
装置a)尤其为用于手动或自动操作的容器、器具或自动装置。装置a)含有装载的配体，该配体可选择地固定在固体载体上。同样地，可以含有缓冲液，该缓冲液使得在将体液于控制的条件下吸收进装置之后能够进行抗体的吸附。
试剂b)含有用于洗涤或纯化或者解吸抗体的物质或物质的溶液。其中就有洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液。此外，在本发明的试剂盒中也提供了包含可能的佐剂的配制试剂，只要其不是已经像b)一样包含在用于获得抗体的试剂中。
例如已经显示出，抗体可以吸附在难以溶解的铝化合物上，于是可以在单独的装置中以简单的方式进行洗涤、再缓冲附于其上的抗体并批量生产得到完成的已经含有铝化合物作为佐剂的疫苗。那就是说，只需要单一的试剂来替代根据本发明的试剂盒中分开的组分b)和c)以用于抗体的获得和疫苗的加工。可选择地，在试剂盒中还可以提供附加的辅助试剂，如洗涤和缓冲物质。
合适的配体也可以与磁性小珠结合，这些磁性小珠可以简单的方式用磁体进行局部化或者说定向或定位。例如某种配体结合到铁磁性颗粒上，并以置于用来接收体液的无菌容器中的方式来提供。如果磁性转运膜或杆也置于容器中，通过磁体的开和关(例如用电脉冲控制螺线管)可以在转运膜上收集到结合了体液中的抗体的颗粒。随后可以将颗粒分离，优选地同时保持磁场。在洗涤程序或抗体解吸期间可以重新除去磁场。随后为了分离洗涤溶液和获得解吸的抗体，在磁体上固定化颗粒是合适的。
用于生产自身性疫苗的试剂盒的特殊实施方案包括无菌的且无内毒素的容器，优选地为只提供一次使用的一次性容器，如可选地互相连接并装备有隔膜的注射器(参见本文中的图4)。
例如，第一个容器含有对于抗体的吸附所需要的配体，这些配体结合在铁磁性颗粒(“小珠”)上。商购可得的“小珠”为例如活化的多孔玻璃珠，如Prosep(Millipore，Durham，UK)、Dynabeads(Deutsche Dynal GmbH，Hamburg，德国)以及来自Miltenyi的同样的材料(Bergisch Gladbach，德国)。此外，可以在该容器中提供吸附缓冲液，或者也可以分别提供。通过隔膜导入人血清。此外，在该容器的里面或上面具有合适的磁体，以便在吸附、可能的洗涤和解吸附之后固定“小珠”。通过隔膜导入确定量的洗涤缓冲液。通过玻璃料再次排出洗涤溶液。抗体的洗脱可以在分离的洗脱容器中用洗脱缓冲液来进行，在洗脱容器导入了负载的“小珠”。在抗体的洗脱之后，“小珠”通过在转运膜上固定化并将膜从溶液中去除来分离。随后，通过隔膜加入配制试剂。将配制好的溶液导入注射器中并准备施用于患者。每个容器各装备有一个或多个用于溶液或悬浮液转移的隔膜，以及用于相分离的玻璃料。
根据特殊的实施方案，试剂盒以含有配体以及试剂b)和c)的容器的形式提供。在用单一的试剂替代两种不同的试剂b)和c)的情况下，在配剂中与配体一起使用该试剂也是有利的。因此，例如可以挑选配体的载体，该载体也可用于获得抗体并具有佐剂的作用。这样的载体例如为难以溶解的铝化合物，如铝凝胶(AluGel)或氢氧化铝。虽然这些配体与获得的抗体一起包含在药物制剂中，但是在抗体-配体本身作为接种抗原起作用的情况下这一点是非常希望的。
来自个体的体液中的抗体与配体的结合可以分批的方式或者采用流通式的程序来进行。免疫亲和纯化可以在层析仪器上自动进行，或者采用人工程序来进行；但是也可以想到，该方法通过含有固定化配体的简单装置以手动的、自动的或半自动的方式进行。
最后，对于根据本发明的从个体中抗体的分离所必需的是将想要的抗体基本上与不想要的来自身体的其他物质分离开。可以想到的是，该目的可以通过不同于上述的免疫亲和纯化的其他分离方法来达到，例如将配体与抗体反应，随后将特异的免疫复合物与没有和配体复合的物质分离开。抗体也可以通过在液相、胶体溶液、乳状液中或者通过所谓的“免疫亲和分配”分别与抗体结合和进行收获。
因此，本发明也涉及生产含有自体性抗体的疫苗的方法，其特征在于下列步骤：
-由个体制备含有抗体的液体；
-用与特定的抗体群结合的配体处理该液体，其具有这样的规格，即作为配体不使用具有相同独特型的定向对抗肿瘤相关抗原的抗体或其片段；
-分离所有不与配体结合的物质；
-用洗脱试剂处理与配体结合的抗体，以便洗脱下与配体结合的抗体；
-在洗脱液中获得与配体结合的抗体；和
-加工获得的洗脱液以形成自身性疫苗，该疫苗含有大于1微克的免疫原性数量的抗体。
不希望的抗体活性基本上通过根据本发明的疫苗来下调。例如以抑制性抗体为“目标”，可以根据本发明将它们分离出来并配制成疫苗以对抗这些不希望的抑制性抗体。
根据本发明生产出的疫苗基本上用于和肿瘤疾病、自身免疫疾病、过敏反应或传染病有关的病症中的预防和/或治疗应用。在移植过程中可能出现的不希望的免疫反应是另外的适应症领域。
因此，例如能够进行治疗对于精子产生抗体从而显示出遗传性不育症的患者。如果将这些自体性抗体从体液如阴道分泌液中取出，并根据本发明将其用于生产疫苗，该疫苗能够立即用于治疗女性患者以抑制不希望的抗体。获得的疫苗制剂尤其含有能够首先通过粘膜再次吸收的IgA抗体。因此优选的施用方式是通过鼻或者阴道来进行的。
在根据本发明生产出的抗体疫苗的帮助下，也可以治疗女性患者的Rh因子不相容性反应。Rh阴性并与Rh阳性的人的血液或组织接触的女性会形成对抗这种Rh因子的抗体。因此，例如怀有Rh阳性胎儿的Rh阴性女性患者可能形成对抗Rh因子的抗体。必须要抑制这种抗体以避免在第二次怀有Rh阳性胎儿时的不相容性反应。因此，根据本发明例如从血清中获得抗Rh因子的抗体，然后将其配制成免疫原性疫苗。优选地于计划怀孕之前进行主动免疫作为预防。
异源材料(如骨髓或干细胞)的移植同样可以用根据本发明生产出的疫苗来辅助。由HLA抗原结构引起的可能的排斥反应可以通过施用含有抗外源HLA的自体性抗体的疫苗来抑制。
异体移植的准备是另外的应用领域，以便防止由于移植造成的可能的不相容性反应。在人血清中发现的高滴度的对抗已知α-Gal-表位的天然抗体对于抗异体移植物或异源移植物的急性排斥反应负有共同的责任。将这些天然的抗α-Gal的抗体在根据本发明的方法的帮助下配制进疫苗中，并施用于准备进行组织、骨髓或干细胞移植的患者。抗α-Gal活性的下调有助于避免排斥反应。通过用自体性抗α-Gal抗体的免疫来降低循环的抗α-Gal抗体的滴度应该能够显著地增加异体移植物的存活时间。
挑选用于根据本发明的分离抗体的配体取决于相应的用途。在下面通过举例提到了几个应用：
●自身免疫疾病中的应用：
作为配体的自身抗原可以例如用于从个体中分离自身免疫特异性抗体。在经过根据本发明的应用之后，如此获得的抗体能够在个体中引起免疫应答，该免疫应答尤其下调了通过独特型相互作用的特异性自身抗体的产生。
在许多自身免疫疾病中，并不知道自身反应性抗体的准确特异性。可是，并不是完全必需用自身抗原作为配体来根据本发明分离自身免疫特异性抗体。在自身免疫疾病的情况下，抗体特异性可以极端的过比例存在，所以通过下列程序之后首先引起对抗过比例呈现的抗体特异性的抗独特型抗体，即从个体中纯化出完整的免疫球蛋白成分(根据已知的生物化学方法)，和随后将其配制成疫苗，并接着将其应用于供体个体。
例如，患有与抗凝固因子的抑制性抗体、胰岛素或类风湿因子有关的疾病的患者可用根据本发明生产出的疫苗进行治疗。为此使用的疫苗含有抗抑制性抗体或类风湿因子的抗体。
●过敏反应中的应用：
为了制备抗过敏反应的患者特异性抗体疫苗，可以想到的是将例如抗IgE抗体或者具有同样特异性的这种抗体的部分用作配体。可是也可以想到将过敏原或过敏原的部分作为配体。
●对于毒性物质的应用：
为了从个体中纯化出能够引发毒素特异性免疫应答的抗体，可以将毒素特异性抗体用作配体。在许多情况下，这种抗体可以单克隆抗体进行使用。可是，也可以想到的是，不是将抗体而是将其他能够相当特异地与某些毒素(例如细菌毒素或低分子量的毒物)结合的分子用作配体以用于纯化目的。
当然，代替仅有一种配体种类，也可以通过本方法将两种或更多种具有不同特异性的配体固定在固体载体上，采用这种方式可于特异性在关于几个结合特性上变得富集或贫乏的制备物中获得抗体(具有不同特异性的抗体)。类似地，几个各具有不同特异性的免疫吸附步骤的序列排列在根据本发明的多重特异性疫苗的制备中是优选的。
也有可能提供具有几个不同配体的固体载体，这些配体都定向于相同或相似的目标物质(在最简单的情况下为对抗某一抗体类别的多克隆抗体混和物)。可是，仍然也可以在固体载体上提供例如对抗一个同样的目标结构的不同的单克隆抗体。
根据本发明特另优选的配体为自身抗原，例如双链DNA，用于处理来自全身性红斑狼疮(SLE)患者的抗ds-DNA的患者特异性抗体。为了很好地从个体中分离凝血因子VIII结合抗体和用由此配制出的疫苗下调患者中病原性的抗凝血因子VIII的反应性，可以将凝血因子VIII或其部分用作配体(Semin.Thromb.Hemost.(2000)26：151)。个体的抗体可以通过使用乙酰胆碱受体或其部分的免疫亲和纯化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：8747)从重症肌无力患者中纯化出来，这些抗体可以根据本发明配制成自身性疫苗并再次接种回同样的患者中。
胰岛素作为配体可用于抗自身免疫糖尿病(I型胰岛素依赖型糖尿病)的自身性疫苗的制备中(Diabetes Metab.Res.Rev.(2000)16：338)。
髓鞘碱性蛋白(MBP)或其部分可以在用于下列患者的自身性疫苗的制备中用作配体，即多发性硬化患者或其他免疫引起的神经紊乱患者(J.Neuroimmunol.(2001)113：163)。
多种神经节苷脂可对于吉兰-巴雷综合症和其他神经病患者作为配体(Intern.Med.(1997)36：599)。
这种自体类型的免疫的优点存在于内在的患者特异性独特型的考虑之中。
根据本发明进一步优选的配体为抗人IgE抗体，使用该抗体可以纯化高度特异的IgE部分，该抗体可以重新以合适的免疫原的形式施用于患者以便抑制患者中产生特异性IgE的细胞。当然，如果特异的抗IgE抗体的部分仍然具有所希望的特异性，那么它们也同样可以用作配体。
在过敏反应领域中，可以想到的是用高度特异的过敏原或其部分或者抗独特型抗体或者其他模拟过敏原的分子作为配体。
因此，通过用自体性抗体的接种诱导的免疫应答由这些抗体的结合区域即它们的独特型来决定，原则上也可以使用这些抗体的片段或衍生物来替代完整的抗体成份以用于免疫目的，只要它们含有各自起始抗体的独特型。因此，术语“抗体”也包括具有相同结合特异性的这种抗体的片段或衍生物。作为例子应当提及下列几项，但是并不局限于此：F(ab)2′片段和F(ab)′片段，它们可以根据本身已知的生物化学方法(例如酶裂解)来生产。术语“衍生物”在此处包括例如可以根据本身已知的化学或生物化学方法生产的抗体衍生物，这些方法例如有在游离的氨基官能团上用脂肪酸酰胺化抗体以便增加用于结合入脂质体的亲脂性。特别地，该术语也包括可以通过将抗体或抗体片段与能够增强免疫应答的分子(例如破伤风类毒素、假单胞菌外毒素、脂A的衍生物、GM-CSF、IL-2、IL-12、C3d)化学偶联产生的产物。
由第一次接种所引起的免疫平衡的移动可以进一步通过重复这一程序来增强，例如在通过免疫亲和纯化获得第一次的自身性疫苗之后几个星期，可以再次获取体液如血液和再次生产自身性疫苗并进行施用。以这种方式也可以确保免疫平衡的各自状态总是置于个体疫苗的考虑之中。该程序可以适当的间隔(例如开始每4-8个星期，稍后每6个月)重复进行，这是根据通过相应的特异测试所进行的各个患者免疫状态的过程控制来确定的。此处描述的用于使用自体性抗体进行接种的新组合物和方法基本上既适合于治疗目的又适合于预防目的。
此处描述的个体自体性接种这种策略的一个普遍的优点为这样的事实，即将关于独特型网络的各个个体的免疫状态置于考虑之中，因此相应的疫苗在各个情况下从个体体液如血清中制备出来。此外，经免疫的个体不会与任何外源抗原接触，而只是以合适的形式用内源成分进行了治疗，这引起免疫平衡的调节。
一个特殊的应用为治疗由于免疫而形成了特异性抗体的患者。然后使用所谓的超免疫血清来产生自身性疫苗以便适时地激发抗自体性抗体的免疫应答。
在优选的实施方案中，将通过免疫亲和纯化获得的抗体根据本发明用合适的疫苗佐剂进行配制。
自体性抗体成份或者其片段和衍生物可以与疫苗佐剂一起配制，这在疫苗中是常见的。免疫应答通过这种佐剂可以得到增强。作为佐剂的例子应当提及下列几项，但是并不局限于此：含有铝的佐剂，尤其是氢氧化铝(例如Alu-Gel)；脂多糖的衍生物；卡介苗(BCG)；皂苷和其衍生物(例如QS-21)；脂质体制剂；具有附加的抗原的配剂，对于这些抗原免疫系统产生强烈的免疫应答，这些抗原例如为破伤风类毒素或者流感病毒的成分，它们可选择地位于脂质体制剂中。
为了增强免疫应答，疫苗制剂也可以与相应的(优选地为人的)细胞因子一起施用，这些细胞因子能够帮助免疫应答的形成。此处尤其要提及的是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，但并不排除其他细胞因子。这种细胞因子通过激活抗原加工细胞(例如树突细胞)来刺激有效的免疫应答。
可选择地，自体性抗体成份也可以根据本身已知和发表的方法用自体性的来自体外培养的树突细胞来培育。随后将经如此脉动调节的树突细胞再次施用给各个个体。以这种方式能够获得特别有效的免疫应答。
因此，在根据本发明的优选的方法中，抗体洗脱液的加工包括选自下列的物质的添加：佐剂，尤其是含有铝的佐剂、脂多糖衍生物、卡介苗、脂质体或QS-21(其他优选的佐剂另外描述于以下文献中，即Singh等人，Nat.Biotechnol.17(1999)，第1075-1081页)；免疫刺激细胞，尤其是树突细胞或其他抗原呈递细胞；活性试剂，优选的为细胞因子，尤其是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；配制辅助物，尤其是缓冲物质、稳定剂或增溶剂；或者这些物质的混和物。
在根据本发明的方法的优选实施方案中，将组合物中含有的抗体与佐剂混和，随后经历加热处理，优选地在高于80℃的温度进行加热，尤其是在90℃-130℃。所使用的佐剂优选地为含有铝的佐剂。可能的是，这样的加热处理虽然使蛋白质抗原变性，但是蛋白质的免疫原性部分通过与佐剂结合而能够以正确的形式呈递给免疫系统。但是并不是必需将蛋白质变性来获得加热处理的优点。已知蛋白质的热变性不仅依赖于温度，而且依赖于蛋白质经历该温度的时间。此外，其他的物理化学参数如离子强度、离子组成、pH值、混和物中活性表面的类型和数量也对于蛋白质的变性具有影响。在一定的条件下，抗体会不变性或不完全变性和/或可以利用其他效果，例如从佐剂表面上的较轻微的解吸附作用，这种条件是已知的并对于本领域的技术人员来说是能够容易地对任何洗脱液进行最佳化的。
用佐剂生产疫苗配剂并随后加热处理的这种模式的进一步的优点为传染病原体能够在完整的制剂中进行减毒或者灭活。该优点不仅在生产中而且在疫苗配剂的贮藏和分配中起着作用。以此可以给出与已知和未知的传染性疾病的病原体相关的更高的安全性。此外，以合适的包装但无保存剂而装入容器中是可能的，因为防止微生物的疫苗保存已经通过加热进行了。
这种配剂的进一步的优点为抗体可能增强的免疫原性，因为加热可以引起抗体至少部分的变性。这种增强的抗原性能够增强尤其是在可能被免疫系统识另为内源蛋白质的蛋白质中的免疫原性。
进一步的优点为通过热灭活造成的抗体-佐剂复合物的附加的稳定性，即蛋白质-抗原的解吸不再和未经热处理的抗原-佐剂配剂中一样快速。该优点也使得在单次免疫之间能够有更长时间的间隔。
因此，根据本发明的方法的特殊实施方案涉及这样的方法，即在该方法中进行了蛋白质变性步骤，尤其是加热处理，在变性步骤中洗脱液中含有的蛋白质至少部分地改变了它们的三维结构，由此它们的免疫原特性优选地得到了增强。
根据本发明产生出的组合物可以常规的方法进行施用，例如作为疫苗通过皮下、肌肉或皮内注射进行施用。另外的施用模式为通过粘膜途径，例如通过鼻或口服施用的接种。
本发明同样也涉及含有抗体的药物组合物，该抗体是通过免疫亲和纯化从含有抗体的动物体液中获得的，这种药物组合物用作自身性疫苗。
此外，本发明涉及用于治疗或预防接种的方法，这种接种是抗自身免疫疾病、传染病以及多种中毒和过敏反应的。
因此，本发明也涉及能够根据本发明的方法获得的自身性疫苗。
本发明的目的也为治疗个体的方法，其中将根据本发明生产出的制剂以有效剂量(优选的为几个微克至10克)施用于从中获取体液的个体。效能必须首先用免疫原性进行评价。已经证明，可在一剂疫苗中使用至少1微克的抗体，疫苗制剂可以准备好的0.01-1ml的剂量单位进行施用，优选地为0.1-0.5ml。优选的剂量首先依赖于佐剂的促进效能，其为3微克至1克，特别优选地为10微克至750微克，最优选地为250微克至500微克。
该处理方法首先在自身免疫疾病(例如全身性红斑狼疮、自身免疫甲状腺炎、全身性血管炎、吉兰-巴雷综合症和抗凝血因子VII：C-自身免疫疾病)、过敏反应、肿瘤疾病和移植范围内的不相容反应的预防以及中毒(例如细菌毒素中毒)中特别有效。
根据另外的方面，本发明也涉及自体性抗体制剂在生产用于免疫调节的试剂中的用途。
本发明将通过下列的实施例和附图进行更详细的解释，但是不应局限于此。
其中：
图1显示了获得疫苗的示意图；
图2显示了特异性抗体反应性在用自身性疫苗免疫之后的改变，该自身性疫苗是分别经过作为配体的抗牛血清清蛋白和琼脂糖而制备的；
图3显示了特异性抗体反应性在用自身性疫苗免疫之后的改变，该自身性疫苗是经过作为配体的小鼠IgG2a而制备的；
图4显示了用于使用磁性颗粒生产自身性疫苗的容器系统。
实施例：
实施例1：
该实施例想要举例说明，特异地调节免疫系统抗任何一种蛋白质(在此处为牛血清清蛋白，BSA)是可能的。
将2组兔(每组3只)分别用根据本发明生产出的疫苗配剂进行免疫。
用于第一组的自身性疫苗采用经过亲和层析柱(固定在琼脂糖上的兔抗BSA)从兔血清中纯化免疫球蛋白的方法而生产出来。用于第二组的自身性疫苗采用经过其他亲和层析柱(无特异性配体的琼脂糖)从兔血清中纯化免疫球蛋白的方法而生产出来。
将如此获得的疫球蛋白通过吸附在氢氧化铝凝胶上配制成疫苗，并经皮下施用于每只兔。
抽血和接种规程：
21日：获得血清
14日：获得血清
7日：获得血清
从21、14和7日的血清库中纯化出疫苗。
0日：获得血清
0日：免疫，皮下
14日：获得血清
21日：获得血清
亲和基质的制备：
在第一步骤中，纯化出兔抗BSA血清：
为此目的，将多克隆兔抗BSA抗体(于0.1M甘氨酸/HCl缓冲液中，pH2.9；体积＝4ml)逆透析缓冲液(0.1M NaHCO3+0.5M NaClpH＝8.0)进行透析(Slide-A-LyzerO 10K；Pierce/USA)。
方法：
·在置于磁力搅拌器上并具有磁力搅拌棒的800ml烧杯中于4℃进行透析，同时更新透析缓冲液4次。
·然后将样品通过离心浓缩(用Centricon 10K(Amicon))，最终体积为0.4-0.6ml。
在经活化的CH-琼脂糖上的固定：
材料：
·经活化的CH-琼脂糖4B；Pharmacia Biotech(地区代码17-0490-01)
·配体：多克隆抗BSA抗体(6.6mg/ml，偶联缓冲液中)
·偶联缓冲液：0.1M NaHCO3+0.5M NaCl，pH＝8.0
·1mM HCl
·1M乙醇胺溶液
·0.1M Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷)缓冲液，pH＝8.0
·0.1M Tris-HCl缓冲液+0.5M NaCl，pH＝8.0
·0.1M乙酸盐缓冲液+0.5M NaCl，pH＝4.0
偶联方法：
将0.25g冻干的CH-琼脂糖4B悬浮在大约20ml的1mM HCl中，并用50ml的1mM HCl洗涤，随后用50ml的偶联缓冲液洗涤。将琼脂糖转移至50ml Falcon管中，然后加入抗体溶液。凝胶：缓冲液＝1∶2的比例导致形成用于偶联的合适的悬浮液。将悬浮液摇动大约1小时。通过用3×10ml的偶联缓冲液洗涤除去过量的抗体。剩下的活性结合位点通过用1M乙醇胺在摇动器上进行1小时的温育来封闭。然后用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)在摇动器上进行1小时的琼脂糖的温育，并进行下列的洗涤循环：首先用0.1M乙酸盐缓冲液(pH＝4.0)+0.5M NaCl洗涤，然后用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)+0.5MNaCl洗涤。洗涤循环进行3次。
用于第二组兔的亲和基质的制备：
用于第二组(对照组)的亲和基质按照与上述同样的程序来制备。只使用缓冲液来代替抗体溶液。因此，活化的琼脂糖只用乙醇胺进行封闭。
自身性疫苗的生产：
每次将相应的兔的10ml血清(21、14和7日的库)用相应的亲和基质(0.5ml柱体积)进行纯化。
材料：
加料缓冲液：PBS+0.2M NaCl，pH＝7.2
洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸/HCl缓冲液，pH＝2.9
方法：
向柱上的加料于4℃以30分钟的温育时间来进行。洗涤用加料缓冲液(1次洗涤步骤＝5ml；5次洗涤步骤)来进行。洗脱用1ml洗脱缓冲液来进行。
洗脱液用碳酸盐溶液(0.5M NaHCO3)中和，如此纯化得到的蛋白质通过大小排阻层析进行分析。
尺寸排阻层析：
该层析法用ZORBAX GF-250柱在DIONEX-HPLC系统上进行。下面的免疫球蛋白用作定量的标准：
-人IgG标准(20mg/ml，Sandoglobulin，3.590.009.0)
-人IgM标准(1.1mg/ml，SIGMA，目录I-8260)
柱：ZORBAX GF 250(PN：884973.901)
走样缓冲液：220mMol Na3PO4缓冲液，pH＝7.0+10％乙腈
流速： 1,000ml/分钟
波长： 214nm
带宽： 5nm
注射体积： 50μl
用氢氧化铝的配制：
根据下列程序进行将经过纯化和中和的免疫球蛋白配制成疫苗：
对于每一个疫苗使用一个Centricon超滤单位(Centricon 10K，来自Amicon，USA)。首先，洗涤超滤单位(通过1mM磷酸钠缓冲液，0.86％NaCl，pH6(NBK)的离心)。随后装入400μl缓冲液和铝胶(27μl(对于400μl)，Superfos，丹麦)，然后加入中和的洗脱液，并进行离心和洗涤(用5ml的缓冲液)，因此最终体积为大约300μl。然后重悬浮疫苗并用缓冲液补充至396μl，再加入4μl乙基汞硫代水杨酸钠原溶液(10mg/ml，Sigma)，取其中的350μl无菌地加入到容器中。单个疫苗的蛋白质浓度各为40-50μg。
BSA-ELISA：
将下列样品在ELISA中进行分析：0日以及14日和21日的库。ELISA平板(NUNC，Maxisorp(F＝96)；丹麦)用100μl BSA溶液(每孔)进行包被。(BSA溶液：BSA(SIGMA目录号A-7638)；以10μg/ml于包被缓冲液中)。将其于37℃温育1小时。在洗涤之后用5％奶粉的PBS溶液(200μl/孔)进行封闭。温育：于37℃进行30分钟。
洗涤规程：
-在包被、封闭和样品温育之后：用洗涤缓冲液洗涤6次，在第4次后温育1分钟。
-在交联之后：用洗涤缓冲液洗涤4次，用染色缓冲液洗涤2次。
将血清样品进行系列稀释(在2％奶粉/PBS中)。将样品稀释液(100μl/孔)于37℃温育1小时。使用多克隆兔抗BSA血清的稀释系列作为正对照和作为用于ELISA定量评测的标准，这些血清已用于亲和纯化。洗涤之后以适当的稀释度(1∶1000稀释缓冲液)应用酶交联物(抗兔Ig HRP(Nordic Immunology，#4694))(100μl/孔)。在于37℃温育30分钟之后再次进行洗涤，并加入底物(每孔：100μl TMBMicrowell1(BioFX，目录号：TMBW-01 00-01，#0034302))，在经过适当的染色之后终止反应(用30％H2SO4，50μl/孔)，然后在光度计中测量着色度(450nm)。在每个稀释系列的半最大吸收处测定滴度。对于单个兔来说，相对于零血清(0日；＝免疫的时间)的相对变化在图2中进行了图解说明。可以看出，接受了通过抗BSA亲和层析制备得到的自身性疫苗的兔在BSA-ELISA中显示出明显的滴度移动。
实施例2：
该实施例将证明，可能特异地降低个体中已经存在的免疫应答。为此目的使用猕猴，其用单克隆抗体(HE2，小鼠IgG2a)进行免疫并形成强烈的对抗小鼠IgG2a的IgG免疫应答。将这种猴的血清在免疫亲和柱上进行纯化，小鼠IgG2a(HE2)固定在该柱上作为配体。将以这种方式纯化出的免疫球蛋白在氢氧化铝上配制成疫苗，并皮下接种给供体猴。在免疫的时候(接种之前)以及2星期之后，抽取血液以测定特异的对抗小鼠IgG2a的免疫应答。
材料和方法：
用于ELISA的微量滴定板：Immuno Plate F96 MaxiSorp(Nunc)
偶联缓冲液： 0.1M NaHCO3
0.5M NaCl
pH 8.0
纯化缓冲液A：PBS+0.2M NaCl
纯化缓冲液B：0.1M甘氨酸/HCl
0.2M NaCl
pH 2.9
结合缓冲液： 15mM Na2CO3
35mM NaHCO3
3mM NaN3
pH 9.6
PBS： 138mM NaCl
1.5mM KH2PO4
2.7mM KCl
6.5mM Na2HPO4
pH 7.2
洗涤缓冲液A：2％NaCl
0.2％Triton X-100
PBS中
洗涤缓冲液B：0.05％Tween 20于PBS中
封闭缓冲液A：5％胎牛血清(加热失活)于PBS中
封闭缓冲液B：1％牛血清清蛋白
0.1％NaN3
PBS中
稀释缓冲液A：2％胎牛血清(加热失活)
PBS中
稀释缓冲液B：PBS
染色缓冲液： 24.3mM柠檬酸
51.4mM Na2HPO4
pH 5.0
底物： 40mg二氢氯化邻苯二胺
100ml染色缓冲液
20μlH2O2(30％)
终止溶液： 4N H2SO4
配制缓冲液： 10％PBS，pH＝5.5
90％生理NaCl溶液
实施：
此处描述的用于自体性接种的方法在猕猴上进行了测试，它们给出了强烈的对抗小鼠IgG2a的免疫应答(0.5mg小鼠IgG2a(HE2)，在0.5ml 1mM磷酸盐缓冲液、pH 6.0/155mM NaCl中吸附在1.67mg氢氧化铝上，将其分别于1、15、29和57日经皮下接种于猕猴)。通过ELISA测试不同时间点的血清对于小鼠IgG2a特异的抗体(见下)。在接种规程末端的抗体主要属于IgG类型。从这些猕猴中获取10ml外周血并从中获得血清。为了从这些猕猴的血清中免疫亲和纯化出抗体成份，首先按照下面的方案制备免疫亲和基质。
整个程序在无菌条件下进行：将7.5g CH-琼脂糖4B(Pharmacia)悬浮于20ml的1mM HCl中15分钟。然后在烧结玻璃滤器AG3上用1升的1mM HCl洗涤凝胶，随后用200ml偶联缓冲液洗涤。将100mg鼠抗体HE2(小鼠IgG2a)逆5升偶联缓冲液进行透析，并用偶联缓冲液调整至5mg/ml。将该溶液与凝胶悬浮液在密闭的容器中混和。1∶2的凝胶：缓冲液比例给出了适合于偶联的悬浮液。将该悬浮液于4℃旋转24小时。随后过量的配体用3×30ml的偶联缓冲液洗掉。剩下的反应基团通过于4℃用1M乙醇胺温育1小时来封闭。然后将凝胶用0.1MTris-HCl缓冲液于室温旋转1小时。最后，凝胶用3个循环的具有交替改变的pH的缓冲液进行洗涤。每个循环由以下部分组成：0.1M乙酸钠缓冲液，pH4，含有0.5M NaCl；随后为0.1M Tris-HCl缓冲液，pH8，含有0.5M NaCl。凝胶于4℃贮藏。从猕猴血清中免疫亲和纯化出抗体成份按照下面的方案在无菌条件下进行：免疫亲和纯化在FPLC系统(Pharmacia)上进行。将1ml按照上述方案获得的凝胶装入Pharmacia HR5/5柱中。5ml血清用纯化缓冲液A以1∶10稀释。将该溶液以1ml/分钟抽吸过柱，并随后用纯化缓冲液A洗涤，直至再次达到检测器的UV基线(280nm)。然后用纯化缓冲液B洗脱结合的免疫球蛋白，并在解吸之后立即用1M Na2HPO4中和该部分。将50μl经如此纯化的抗体成份在大小排阻柱上(SEC，Zorbax 250 GF)进行分析。使用220mM磷酸盐缓冲液，pH 7+10％乙腈作为走样试剂。抗体成份的全部数量为大约40μg(通过与标准对照的SEC来测定)。将如此获得的抗体成份在ELISA就其与抗体HE2(用作用于亲和纯化的配体)的结合进行测定：将用于亲和纯化的小鼠IgG2a抗体的100μl等分试样(抗体HE2；以10μg/ml位于结合缓冲液中的溶液)于37℃在微量滴定板的孔中温育1小时。在用洗涤缓冲液A洗涤平板6次之后，各加入200μl的封闭缓冲液A并于37℃温育30分钟。在按照上述方法洗涤平板之后，将各100μl待测试的亲和纯化出的抗体成份以及正常的人免疫球蛋白以相同的浓度作为负对照在稀释缓冲液A中作1∶4-1∶65000的稀释，并于37℃温育1小时。在按照上述方法洗涤平板之后，各加入100μl在稀释缓冲液A中作1∶1000稀释的交联过氧化物酶的山羊抗人Ig抗体(Zymed)，并于37℃温育30分钟。平板用洗涤缓冲液A洗涤4次，再用染色缓冲液洗涤2次。抗体结合通过各加入100μl特异的底物来检验，显色反应在各加入50μl终止溶液大约3分钟之后终止。通过于490nm(参考测量波长为620nm)测量光密度(OD)来进行评测。亲和纯化出的抗体成份显示了明显的与小鼠IgG2a抗体的结合，然而正常的人免疫球蛋白实际上几乎没有结合。
将通过亲和纯化获得的抗体成份按照下面的方案用氢氧化铝作为佐剂进行配制：
在3ml亲和层析之后获得的抗体溶液(含有大约40μg抗体)中混入1mg氢氧化铝(水悬浮液；铝胶，Superfos)，并将该悬浮液在“FILTRON”离心管(Microsep TM，截止点为10kD)中于4000g离心30分钟。随后分2次各用1 ml配制缓冲液进行悬浮，并于4000g离心30分钟。悬浮液用配制缓冲液补充至0.5ml，然后将如此获得的悬浮液无菌地装入容器中。从其血清中获得上述自身性疫苗的猕猴用该疫苗在背部进行皮下接种。在该第一次接种之前，抽取5ml血液以获得血清(为了测定用于表征免疫应答的起始值)。2星期之后，再次抽取10ml血液以获得血清。
这些经免疫的猴的血清免疫球蛋白与小鼠IgG2a的结合按照上述方法在ELISA中测定。正如在图3中所见，在用自身性疫苗免疫之后小鼠IgG2a反应性降低了。