食用菌远缘原生质体融合育种新方法 技术领域：
本发明涉及细胞工程范畴，具体地说，它是一种利用细胞融合技术进行食用菌远缘原生质体融合，选育食用菌优良品种的新方法。
背景技术：
近三年来，细胞融合技术作为一种新的育种技术，受到了国内外广大食用菌育种工作者的重视，尤以我国、日本和韩国研究进展较快，先后在种内、种间、属间都得到过融合子，但所得到的融合子以细胞质融合而细胞核融合的异核体为主，稳定性差是这类融合子的最大缺陷。科技工作者们研究发现远缘融合除非核融合否则将会分离，但在融合中发生的核融合的频率太低而且难度大。至今尚未发现有关核融合技术的研究报道。即使在偶然情况下得到核融合子也因其难以出菇而被淘汰。[1]赵永昌.食用菌原生质体研究的发展史.中国食用菌，1994，(3)P5--8。[2]戴秉丽.原生质体技术在食用菌育种中的应用[J].中国食用菌，1995，(6)：17～19.[3]杨新美.原生质体融合技术在食用菌良种选育中的应用[J].中国食用菌，1987，(2)：3～5.[4]Eguchi-F(Japan).Production of new speciesof edible mushrooms by protoplasts fusion inethol.Journal of the Japan woodResearch Society.1993，39(7)：98～102.核融合技术和核融合菌株不出菇成为食用菌细胞融合技术育种中亟待解决的一大难题。
发明内容：
本发明的目的是为解决当前食用菌原生质体融合中，核融合频率低，核融合子难以形成子实体等世界性难题，为达此目的，发明人经过长期不懈地研究，终于攻克下这一世界性难题，提供一种能得到稳定的远缘融合子并能出菇的后代地食用菌远缘原生质体融合育种新方法。
本发明的技术方案主要包括：
1、亲本选择：选择异原亲本次生双核菌丝作为材料，亲本亲缘关系可远可近，亲本之一菌丝具有锁状联合，以此作为筛选标记。
2、细胞核融合：采用浅层液体静培法培养亲本菌丝，切取边缘幼嫩菌丝制备原生质体；在高钙、CaCl2 0.1mol/L～0.2mol/L高pH8-9条件下，进行原生质体融合并创造原生质体核融合的条件，具体为：
(1)降低PEG的浓度：一般为20％～35％，优选20％，目的在于降低高浓度PEG对原生质体的毒害，有利于提高原生质体的再生能力。
(2)低速离心：其转速一般2500～3000rpm，优选3000rpm，低速离心过程，能协助原生质体间的融合。
(3)高温刺激：一般采用28～35℃，优选30℃，在此温度范围内，提高核融合的频率。
3、稳定的核融合子的检出：上述细胞核融合中获得的再生菌株一般包括核融合单核菌株，双核原生质体再生菌株和少量的单核原生质体再生菌株。以锁状联合和细胞核个数作为标记进行再生菌株的筛选。挑取单个再生菌落，并分别进行培养，挑取再生菌株的菌丝，染色镜检，保留无锁状联合的单核再生菌株。让它们与亲本单孢菌株和单核原生质体再生菌株杂交，保留不亲和的单核再生菌株。
4、融合核分裂及融合核分裂菌株的筛选：选择使核融合菌株发生核分裂的融合核分裂剂的配方：
融合核分裂剂的组份及重量份数比为：
纤维素 800～900
木质素 50～150
果胶 20～30
矿物元素 5～10
多元酚 1
融合核分裂剂组份及重量份数比优选：
纤维素 900
木质素 150
果胶 30
矿物元素 10
多元酚 1
上述各组份中棉酚为起作用的成份，其余物质作为棉酚的载体和生长的必需物质，在融合核分裂中起辅助作用。
5、栽培出菇：
对经融合核分裂处理后产生有锁状联合的双核的菌株进行常规栽培出菇，观察其生长情况和出菇情况。
6、初筛、复筛：
对出菇的融合核分裂菌株进行常规初筛复筛，观察其生长情况和出菇情况，选择出农艺性状优良的菌株。
7、新品种获得：
将农艺性状优良的菌株经过法定技术审定而成为食用菌新品种。
本发明的技术优点在于：
(1)在世界上首先实现了降低PEG、低速离心和高温刺激的方法进行核融合，使科间细胞核融合频率达到0.42％。
(2)核融合-融合核分裂技术结合发展成为一套完整实用的育种方法。
(3)本发明方法获得的产品农艺性状优良，以金凤2-1为代表，经实验和区试等结果表明：它具有以下特性①广温型，出菇温度范围在5-35℃；②优质，氨基酸总量，人体必需氨基酸，增智氨基酸的含量均高于双亲；③高产，其产量比侧五，凤尾菇，姬菇，义平冻菌等增产60-90％；④抗杂菌能力较强，遇毛霉，根霉，曲霉以及青霉能与其竞争生长，并盖过杂菌；⑤适应性广，在高温南京地区和高寒的青海地区均可以栽培并获得高产；⑥易栽培，各种草料，作物下脚料，蔗渣，酒糟杂木屑，废菌渣等均可以配方栽培；⑦商品性好，耐运输，菇型好，食味鲜香可口，具有较强的市场竞争能力。
附图说明：
图1为本发明食用菌远缘原生质体融合育种新方法的工艺流程图。
具体实施方式：
以下介绍的是作为本发明前述内容的具体实施例，并通过实施例对本发明的前述内容作进一步的阐述。当然，这不应将此理解为本发明的前述主题范围仅限于以下实例。
实施例1：
金针菇(Flammulina velutipes)与凤尾菇(Pleurotus pulmonarius)科间原生质体融合育成“金凤2-1”新品种的方法。
本例是采用口蘑科的金针菇与侧耳科的凤尾菇进行不同科间原生质相互融合，具体方法如下：
1、亲本选择：
口磨科的金针菇双核菌株，具锁状联合，口感嫩滑，品质好，是著名的智力菇，为低温型菌种，其抗杂菌能力强，但产量较低。侧耳科的凤尾菇双核菌株，具锁状联合，味鲜美可口，柄短，朵大肉厚产量高，为典型的中温型种，但抗杂菌能力较弱。二亲本的优缺点互补，是科间远缘配对融合的理想材料。
2、细胞核融合：
将亲本之一热灭活，使其失去再生能力，再与另一亲本原生质体融合，在CaCl20.2mol/L，PH9，20％浓度的PEG，3000rpm的低速离心和30℃的高温刺激条件下，并依据物理力学原理，进行细胞融合。
3、选择核融合单核菌株：
将再生菌株分别染色镜检，选择出无锁状联合的单核再生菌株，这些单核再生菌株一般包括核融合单核菌株和亲本单核原生质体再生菌株。将其与亲本单核原生质体再生菌株杂交，选择出不亲和的菌株。
4、融合核分裂：
将前述的融合核分裂剂，对在核融合中所得到的核融合单核再生菌株与融合核分裂剂进行混合培养，将培养前后的菌丝体分别染色镜检，观察细胞核数和锁状联合的产生情况，保留经培养后产生的双核具锁状联合的菌株。
5、初筛、复筛：
用棉籽壳配方栽培经融合核分裂剂处理后产生的具锁状联合的双核菌株。观察其生长情况和出菇情况，选育出产量较生产上主栽品种侧五、冻菌和凤尾菇等增产60～90％，氨基酸总量高于亲本，综合性状优良的“金凤2-1”新品种。
实施例2：
用鬼伞科的鸡腿菇(Corprinus comatus)和侧耳科的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)作为亲本，取代实施例1中的口蘑的金针菇和侧耳科的凤尾菇亲本，其余操作步骤、方法、使用融合核分裂剂与实施例相同，最后同样获得的融合菌株的子实体性状不同于亲本。
实施例3：
用更远缘的非褐菌目的茯苓(Poria cocos)和伞菌目的凤尾菇为亲本取代实施例1中的口蘑科的金针菇和侧耳科的凤尾菇亲本，其余操作步骤、方法、作用的融合核分裂剂与实施例1相同，最且获得的融合菌株的子实体性状不同于亲本。