针对SARS冠状病毒基因的反义核酸序列及其药物用途 技术领域
本发明涉及一种针对SARS冠状病毒基因的反义核酸序列及含有该反义核酸序列的药物及其用途。
背景技术
严重急性呼吸系统综合症(以下简称SARS)，又称非典型性肺炎，是由一种新的冠状病毒引起的一种传染病，最先爆发于中国广东，随后向周边国家和地区蔓延，截止到2003年5月17日，已经扩散到32个国家和地区，共报道了超出7000例的SARS病例。其发病特征为高烧、全身不适、头疼、干咳、呼吸困难、血氧过少、肺部出现空洞，能够发现全身性间隙浸润液，严重的需要采用插管法或呼吸机帮助病人进行呼吸，死亡率高达15％左右(Kanchan Anand，JohnZiebuhr，Parvesh Wadhwani and et al.，Science，2003，Science 300：1763-1767；)。SARS临床诊断表现为淋巴细胞减少、白细胞减少、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶水平升高。
世界卫生组织负责传染病的执行干事戴维·海曼于2003年4月16日宣布，经过全球科研人员的通力合作，正式确认冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎的病原体，科学家将其命名为“SARS病毒”。SARS冠状病毒是一种正义、单链RNA病毒，是RNA病毒中基因组最大的病毒，它本身没有细胞结构，不能自主复制，但一旦进入人体细胞，就能利用细胞中的各种资源在宿主细胞中不断进行复制(QIN E’de，ZHU Qingyu，YU Man and et al.，A complete sequenceand comparative analysis of a SARS-associated virus(Isolate BT01)，Chinese Science Bulletin，2003，48(10)：941-948；Marco A.Marra，StevenJ.M.Jones，Carol ine R.Astell and et al.，The Genome Sequence of theSARS-Associated Coronavirus，2003，Science 300：1399-1404；ChristianDrosten，Stephan Gunther，Wolfgang Preiser and et al.，Identificationof a novel coronaviral in patients with severe acute respiratory syndrome，the New England Journal of Medicine，April 10，2003)。SARS冠状病毒主要通过呼吸道传播，由于病毒的寄生特性，很难找到合适的药物，因为药物在杀死病毒的同时，往往也会误伤健康细胞(Paul A.Rota，M.Steven Oberste，Stephan S.Monroe and et al.，Characterization of a Novel CoronavirusAssociated with Severe Acute Respiratory Syndrome，2003，Science 300：1394-1399；)。
反义核酸是在原核细胞和真核细胞内天然存在的一种基因表达的抑制物(Mizuno，T.Chou，M-Y.and Inouye M.，1984，PNAS，81，1966-1970；HeywoodS.M.，1986，Nucleic Acids Research，14，6771-6772)，这些核酸片段的功能是结合到互补的mRNA序列上，阻止mRNA翻译蛋白质分子的过程(PatersonB.M.，Roberts B.E.and Kuff E.L.，1977，PNAS，74，4370-4374)。反义寡聚核苷酸是一小段人工合成地核苷酸片段，它的碱基顺序与人们选择作为阻断目标基因的某一段，依照碱基配对法则可以与存在于细胞质中的特定基因的mRNA结合，阻断其复制或翻译成蛋白质分子。
在细胞内部，一个拷贝的基因会产生200-300条mRNA，翻译出10万个具有生物学功能的蛋白质分子。传统药物一般是作用于具有生物学功能的蛋白质分子空间构型上的一两个位点，由于蛋白质立体结构非常复杂，药物可作用的靶位点又很少，因而特异性不会非常高。而反义核酸是通过碱基配对的原理来识别所作用的靶基因，从理论上说，一条长度为17个碱基的反义核酸分子，其碱基排列顺序在人体全部基因中是唯一的。所以，长度超过17个碱基的反义核酸分子在人体全部基因中的结合位点即是唯一的，这就使反义核酸具有高度的特异性。毒理学研究也证明，反义核酸在体内具有很低的毒性。所以与传统药物相比，反义核酸药物具有高选择性、高效性以及低副作用等优点，特别是在抑制肿瘤生长和抗病毒繁殖等方面，已经有一个药物进入美国和欧洲市场(1998年)，还有30多个反义核酸药物在完成临床前期的研究和开发后分别进入了临床I、II、III期实验(Stein C.A.and et al.，1994，Curr.Opin.Onco.，6，587-594；Crook S.T.，1995，Hematologic Pathology，9(2)，59-72，NewsRelease，ISIS pharmaceutical Co.2000.)。
发明内容
本发明的目的之一是提供一些反义核酸序列，该序列为一段人工合成的核苷酸序列，它与导致SARS的冠状病毒基因的特定位点的序列是互补的。因此，给有效剂量药后，该药物与冠状病毒基因的特定位点相结合，从而抑制该病毒在人体内的复制，以达到有效治疗SARS的目的。
本发明的目的之二是提供一些治疗SARS的反义核酸药物，该药物是由上面提到的反义核酸序列及可药用载体或赋形剂组成的。
本发明的目的之三是提供上述的反义核酸序列用于制备抗严重急性呼吸系统综合症(SARS)药物的用途。
本发明的目的之四是提供该反义核酸序列在制备治疗其它由于要SARS冠状病毒引起的疾病的药物方面的用途。
以严重急性呼吸系统综合症(SARS)病毒基因的全部序列为攻击位点，设计了一系列反义核酸序列，其特征在于可特异性地与导致SARS的冠状病毒基因的不同区域相结合，所述的核酸序列选自：
SA1：5’AGGTTCATAGTTGTACTTCA 3’
SA2：5’TTTGCCTGACGGGAATGCCA 3’
SA3：5’TGCGAATGAGCAGATCTTCA 3’
SA4：5’ATAGTTGTACTTCATTGCCA 3’
SA5：5’GGTTCATAGTTGTACTTCAT 3’
SA6：5’TTCCTGTTTGAGCAGAAAGA 3’
SA7：5’CGGATGATGTTCCACCTGGT 3’
SA8：5’AAGTGTTATGTTTGCGAGCA 3’
SA9：5’ACCGGATGATGTTCCACCTG 3’
SA10：5’GCATAAGCAGTTGTAGCATC 3’
SA11：5’GAAGTGCATTTACATTGGCT 3’
SA12：5’GCCTGTGTTGTAGATTGCGG 3’
SA13：5’AGTTTACATCCTGATTATGTACGACTCCTA 3’
SA14：5’GTCCTTTAGTAAGGTCAGTCTCAGTCCAAC 3’
SA15：5’CTAATATTCTTGATGGATCTGGGTAAGGCA 3’
SA16：5’CTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGGT 3’
SA17：5’CCTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGG 3’
SA18：5’AGCATCAATAGCCAGTGACACGAACCTTTC 3’
SA19：5’TCCTGATTATGTACGACTCC 3’
SA20：5’ATCCCAACCCATAAGGTGTG 3’
SA21：5’GGTAAGCATCAATAGCCAGT 3’
采用亚磷酰胺固相合成法合成了相应的核酸分子，其长度均为20个或30个核苷酸残基。将合成后经纯化的寡核苷酸用碘处理，将磷酸硫酯键转化为磷酸二酯键，然后用常规的DNA测序方法对所有反义核酸序列进行序列测定，与设计序列一致，以毛细管电泳法测定所有反义核酸序列的分子量，发现与理论分子量近似相等。
将上述SA系列反义核酸序列样品用PBS(500ml溶液中含有9.566克十二水Na2HPO4，0.977克二水NaH2PO4和2.2克NaCl)溶解，Beckman DU640分光光度计定量，根据实验所需样品量分别取样。
对上述药物组合物送P3实验室，进行验证。采用经SARS冠状病毒BJ-01感染的非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)细胞株作为靶受体。另外采用正常Vero-E6细胞设定脂质体-组、脂质体+组作为阴性对照实验组，脂质体-组只加转染培养基、不加脂质体及SA系列反义核酸序列；脂质体+组加入一定量的脂质体、不加SA系列反义核酸序列。对合成的反义核酸进行筛选，结果显示，其中21个反义核苷酸序列或其组合均具有不同程度的抑制SARS冠状病毒损伤(大于25％)的特性，将它们分别定名为SA(1+3+5)组合、SA(2+4+6)组合、SA2、SA(7+8+12)组合、SA8、SA12、SA(9+10+11)组合、SA(13+14+16)组合、SA(15+17+18)组合、SA15、SA(19+20+21)组合，其中SA15、SA(2+4+6)组合、SA(15+17+18)组合和SA(7+8+12)组合具有较高的抑制SARS冠状病毒生长(大于50％)的活性。
SARS系列反义寡聚核苷酸均是长为20个或30个核苷酸残基并经过硫代修饰的寡聚核苷酸，攻击目标为整个SARS冠状病毒基因，它们可以在细胞质中与SARS冠状病毒基因发生特异性的结合，阻断SARS冠状病毒基因的复制和蛋白的产生，从而抑制了SARS冠状病毒的增殖。从核酸杂交的特性看，RNA与mRNA杂交的亲和力比DNA与mRNA杂交的亲和力要高，从而在药用方面具有更大的价值，但是由于目前合成RNA的成本远远高于合成DNA的成本，考虑到临床应用的成本要求，目前作为临床应用试验的反义核酸药物均为硫代寡聚脱氧核糖(DNA)，但是将来合成RNA成本有可能降低，可能会在临床上采用反义寡聚核糖(RNA)取代反义寡聚脱氧核糖(DNA)作为药用。
反义核酸的生物学活性是序列特异性的，互补于某一基因特定位点的反义核酸，互补的长度不同，生物学活性高低也不同。一般说来，反义核酸与目标基因互补长一些，生物学活性会高，但是较长的反义核酸其合成的成本会高很多，所以作为药用目的的反义核酸，研究者均会同时考虑成本核药用活性选取一个合适的长度。本发明中反义核酸长度均为20个或30个碱基。当然，延长或缩短一至数个碱基而互补于同一基因位点的反义核酸也会具有程度不同的相同生物学活性。同时，互补于相同基因位点附近的反义核酸若结合部位有不同程度的重叠，被认为具有程度不同的序列同源性，也会具有不同程度的相同生物学活性。
在人体内存在大量的核酸外切酶，反义寡核苷酸若不经过化学修饰，会很快被降解，从而失去活性。反义寡核苷酸的化学修饰有很多种方法，常见的有硫代修饰反义核酸和2‘-甲氧基修饰反义核酸等。但是目前硫代反义核酸的药理学、药代动力学和毒理学等临床前研究是各种化学修饰中研究得最为全面的，硫代反义核酸在体内可以有效地抵御核酸酶的降解，并且可以激发核糖核酸酶eH的活性，降解与之杂交的mRNA链，所以目前临床实验应用的反义核酸均为硫代反义核酸。同时人们也在进行其他化学修饰的反义核酸临床前药物研究，以便进行临床应用。其他的修饰方式主要为磷酸骨架修饰和糖环修饰，磷酸骨架修饰包括巯基代磷酸、二巯基代磷酸、甲基化磷酸等；糖环修饰包括2’位甲基化、甲氧基化等DNA与RNA修饰，此外还包括肽核酸等核酸类似物。所以某一特定序列的反义核酸可以通过不同的化学修饰作为化学组份不同的化合物，在临床上都具有药物活性。
毋庸讳言，本发明提供的SA系列反义核酸序列可与药用载体或赋形剂的组成药物组合物。通过对感染SARS冠状病毒的动物或人体进行各种方式的给药，以达到治疗SARS或其他由SARS冠状病毒导致的疾病。
综上所述，本发明所述的互补于SARS冠状病毒基因不同部位的反义核酸具有抑制SARS冠状病毒增殖的特性，在SARS的治疗方面显示出诱人的前景。可以通过不同的化学修饰，采用不同的长度和不同程度同源性的序列发展为具有临床应用价值的抗SARS冠状病毒的药物。
附图说明
图1 加入SA系列反义核酸序列后，感染了SARS冠状病毒的非洲绿猴肾细胞的存活率
具体实施方式
在下面的具体实施方式将进一步说明本发明，但并不限制本发明范围。
实施例1：SA系列反义核酸序列攻击靶位目标的确定及反义核酸序列的合成。
在整个SARS冠状病毒基因图谱(约30Kb)的各个基因区段上选定反义核酸攻击的位点。
使用美国PE公司应用生物系统部(APPLIEDBIOSYSTEMS)制造的392型DNA-RNA合成仪及其配套试剂，以亚磷酰胺固相合成法合成所设计的反义核酸，并对其进行硫代修饰。合成原料均由合成仪生产厂商提供，主要原料有：四种二异丙基β-氰乙基亚磷酰胺单体：腺苷(A)、鸟苷(G)、胸腺嘧啶苷(T)、胞嘧啶苷(C)；四种控制孔径玻璃粉(Control Pore Glass)固相合成载体(A，G，C，T)；活化试剂：四唑/乙腈盖帽物试剂：乙酸酐/二甲基嘧啶/四氢呋喃，1-甲基嘧啶/四氢呋喃；硫代反应试剂：H-1，2-苯二硫醇-3-酮1，1二氧化物(Beaucage)/乙腈；脱三苯甲基试剂：三氯乙酸/二氯甲烷；液体试剂：乙腈/三氯甲烷；
合成规模为0.2μM，固相载体量为50μM，碱基载体溶于无水乙晴中，浓度为100μM，其他试剂浓度及用量均按照仪器手册进行。合成过程完全由电脑自动控制。
合成产物由浓氨水(28％)切割收集在密封耐压的玻璃瓶中，于55℃、18小时进行脱保护处理。脱保护结束后用旋转蒸发仪在40℃、0.1Mpa负压下脱去粗产品中的氨，用Pharmacia的MonoQHP5/5进行纯化脱盐，去除短片段。纯化产物冻干后得到白色粉末状物质，储存于-20℃，进行产品分析。
1.用质谱(MALDI-TOF-MS)测定分子量；
2.用毛细管凝胶电泳测定其纯度；
3.DNA测序法测定序列；
4.P31 NMR(核磁共振)确定硫代程度。
MALDI-TOF-MS测定的分子量与寡核苷酸的理论分子量相符。
毛细管凝胶电泳纯度分析结果显示本发明中的SARS系列反义核酸纯品的纯度大于95％。
序列测定证明本发明中的SARS系列反义核酸序列与设计序列相同。
P31 NMR分析显示SARS系列反义核酸的硫代率大于98.5％。
实施例2：SA系列反义核酸序列的化学组成结构
将合成后经纯化的寡核苷酸用碘处理，将磷酸硫酯键转化为磷酸二酯键，然后用常规的DNA测序方法对所有反义核酸序列进行序列测定，结果显示得到的反义核酸序列与设计序列一致；以毛细管电泳法测定所有反义核酸序列的分子量，发现与理论分子量近似相等。
实施例3：SA系列反义核酸序列对于感染了SARS的非洲绿猴肾细胞的抑制：
1.将实施例3中所述在培养的非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)上用SARS病毒-BJ-01株进行验证。在P3实验室操作。
2.SARS冠状病毒剂量为10-3(病毒半数感染剂量TCID50＝10-7，本实验所使用的病毒剂量高于病毒半数感染剂量四个数量级)，通常是2-3天病变。
3.药物的剂量为1μM
4.评判指标(用CPE法测定药效)
细胞无病变： -
细胞病变在25％以下： +
细胞病变在26-50％： ++
细胞病变在51-75％： +++
细胞病变在76-100％： ++++
细胞存活率的计算按上述的观察等级估算。细胞病变在+至+++之间则按细胞病变等级范围的中位数计算。例如当计数在-时，细胞病变等级为0。当计数为25％以下时，病变按12.5％计算。当计数在25-50％时，病变按38％计算。当计数在50-75％时，病变按63％计算。细胞病变在76-100％时，病变按100％计算。
5.实验程序
第一天
铺板：消化和收集VERO-E6细胞，用完全培养液配成2.5×105/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。37℃，5％CO2条件下培养18-24小时。
第二天
镜检观察细胞布满孔底面积80-90％成片，状态良好即可开始正式实验，将原来的细胞培养液全部吸弃，每孔加入100μl待筛选的药物于96孔细胞培养板中(含一定量的脂质体)，每个待检样品做3个复孔。1hr后，加入100μl/孔SARS BJ-01病毒(10-3)，2-3小时后吸弃100μl/孔，加入完全培养基100μl/孔，放入37℃，5％CO2培养箱继续培养。另外设定脂质体-、脂质体+组，脂质体组只加转染培养基，不加脂质体及寡核苷酸；脂质体+组加入一定量的脂质体，不加脂质体。
第三天-第四天
当病毒对照孔全部病变时，观察药物对细胞的保护效应。
6.实验初步结果
实验设正常细胞对照和病毒对照。
正常细胞对照为不加病毒亦不加药物；在实验全过程应当无病变。
病毒对照为加病毒但不加药物；在实验终点应当全部病变。
药物对照为加药物不加病毒，在实验全过程应当无病变。实验初步结果：
未加药物和未加SARS冠状病毒的正常细胞对照在实验全过程中未见病变。
加入SARS冠状病毒的病毒对照在实验终点全部病变，显示重度损伤或100％死亡。
药物本身对VERO-E6细胞未显示毒性。筛选结果如表2所示：
表2 处理方式Vero-E6细胞存活率(％)脂质体+ 100脂质体- 100SARS病毒 0反义核酸片段 100SA(1+3+5)+脂质体+SARS病毒 37SA(2+4+6)+脂质体+SARS病毒 50SA2+脂质体+SARS病毒 25SA(13+14+16)+脂质体+SARS病毒 37SA(15+17+18)+脂质体+SARS病毒 54SA15+脂质体+SARS病毒 54SA17+脂质体+SARS病毒 25SA(7+8+12)+脂质体+SARS病毒 74SA8+脂质体+SARS病毒 25SA12+脂质体+SARS病毒 37SA(9+10+11)+脂质体+SARS病毒 45SA(19+20+21)+脂质体+SARS病毒 37
与未加药物但加入SARS冠状病毒的严重损伤或100％死亡的细胞相比，药物序列SA15、SA(2+4+6)组合、SA(15+17+18)组合和SA(7+8+12)组合对感染SARS冠状病毒的VERO-E6细胞均显示具有明显的保护作用(＞50％)；药物序列SA(1+3+5)组合、SA2、SA8、SA12、SA(9+10+11)组合、SA(13+14+16)组合、SA(19+20+21)组合显示有一定程度的保护作用(25～50％)。
勿需赘言，本发明的SARS反义序列具有很大的可能通过不同的化学修饰、采用不同的长度和不同程度同源性的序列发展为具有临床应用价值的抗SARS冠状病毒的药物。单独使用或与其他药物联合使用进行SARS的治疗，这对在本领域的普通技术人员看来是显而易见的。
序列表
<110>北京金赛狮反义核酸技术开发有限责任公司
<120>针对SARS冠状病毒基因的反义核酸序列及其药物用途
<160>21
<170>PatentIn Version 2.1
<210>SA1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(20)
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<400>SA1
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ACCGGATGAT GTTCCACCTG 20
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