含磷脂酰胆碱二元醇及其用途 一、技术领域
本发明涉及一种含磷脂酰胆碱二元醇及其用途，具体地说，本发明涉及一种侧链上含有长链烷基或全氟长链烷基和磷脂酰胆碱的二元醇，以及这种含磷脂酰胆碱二元醇用于聚合物的合成、靶向药物载体和药物缓释材料的用途。
二、背景技术
现有的含磷脂酰胆碱二元醇主要有甘油磷脂酰胆碱、2-[双(2-羟乙基)-甲基铵]-乙基-R1基-磷酸酯和双[2-(2-羟乙基-二甲基铵)-乙基]-R2基-二磷酸酯，它们的结构如下所示：
结构式1.甘油磷脂酰胆碱(以下简称GPC)的结构
R1＝(CH2)nCH3(n＝19，17，15.11，7，3)Cholesteryl(CH2)8CH＝CH(CH2)7CH3C6H4(CH2)8CH3
结构式2.2-[双(2-羟乙基)-甲基铵]-乙基-R1基-磷酸酯
(以下简称DIOL-1)的结构
用这些二元醇可以制备具有较好血液相容性的高分子材料。如S.L.Cooper[L.-L.Yung，S.L.Cooper.Biomaterials，19，31-40，1998]采用GPC作扩链剂合成聚氨酯。Nakaya在其综述中详尽报道了由DIOL-1和DIOL-2合成的其它聚合物[T.Nakaya，Y.J.Li，Phospholipid polymers.Prog.Polym.Sci.，24，143-181，1999]。这些二元醇所制备的聚合物材料虽都具有较好的血液相容性，但吸水性强，在体内湿强度低，故而限制了这类聚合物作为体内承力器件上的应用。如制备小直径人工血管的材料，既要求其有良好的血液相容性，又要求有良好地力学强度，而由现有的含磷脂酰胆碱二醇制作的材料就不能同时满足需要。又如作为心脏起搏器绝缘导线，材料吸水性强还将导致电源短路，造成严重的后果。
DIOL-2
CH2CH2CH2CH2CH2
(n＝17，15，11)
结构式3.双[2-(2-羟乙基-二甲基铵)-乙基]-R2基-二磷酸酯
(以下简称DIOL-2)的结构
理想的体内植入材料要求材料表面生物相容性，包括血液相容性好，且本体的力学性能优良。现有的上述二元醇，因都含有磷脂酰胆碱的结构，与组成细胞膜的磷脂分子的极性头部类似，当这样的极性头部在材料表面富集时，所得材料的血液相容性就会很优良。但由GPC合成的聚氨酯材料，由于磷脂酰胆碱基团与主链之间只相隔了一个亚甲基，其运动性大受限制，很难富集于材料表面。为了使表面的磷脂酰胆碱基团的浓度提高到满足血液相容性的要求，常规的做法是加大GPC的用量，但GPC的用量提高以后，由于GPC所含的磷脂酰胆碱基团具有高亲水性，必然导致材料的高吸水性，从而使材料的湿强度进一步下降。因此用现有的GPC合成的聚氨酯材料，血液相容性与力学性能的要求就很难同时兼顾。同样的，在DIOL-1中磷脂酰胆碱的N元素直接构成分子主链，DIOL-2中N和P元素均直接构成主链的一部分，磷脂酰胆碱基团的运动性均受限制，同样存在血液相容性和力学性能之间的矛盾。因此需要合成新型的含磷脂酰胆碱的二元醇来同时满足植入材料对血液相容性和力学性能的要求。
三、发明内容
本发明的任务是克服已有技术的不足，提供一类使聚合物既具有优良的血液相容性，又能保持良好的力学性能的高分子材料中间体产品——含磷脂酰胆碱二元醇。本发明的另一任务是提供含磷脂酰胆碱二元醇的用途。
本发明人经过大量研究后，提供的可完成本发明任务的含磷脂酰胆碱二元醇，其磷脂酰胆碱基团位于侧链上，其特征在于主链为含碳原子3～7的二醇，侧链上的磷脂酰胆碱基团与主链之间还含有碳原子数为2以上的长链烷基或含氟长链烷基。
当其侧链上的磷脂酰胆碱基团与主链之间为长链烷基时，其结构通式如下：
其中x，y为1、2、3，R代表氢或碳原子1～4的烷基，Z代表酰胺基、氨基甲酸酯基、氧或硫原子，n为2～30的整数，优选6～20的整数。
当其侧链上的磷脂酰胆碱基团与主链之间为含氟长链烷基时，其结构通式如下：
其中x，y为1、2、3，R代表氢或碳原子1～4的烷基，Z代表酰胺基、氨基甲酸酯基、氧或硫原子，m，n为1～10的整数，Q代表一个化学键、氧或硫原子，Rf为含碳原子2-20的全氟亚烷基。
在以上两个结构通式中，当R代表烷基时，优选甲基或乙基。
本发明提供的含磷脂酰胆碱的二元醇是以现有的化工原料为基础，通过已有的化学制备方法制备的。采用的主要化工原料有：
N(CH3)3(VI) HOCH2(CF2)nCH2OH(VII)
其中n为2～30的整数，优选6～20的整数，R代表氢或烷基。
如果制备侧链含长链烷基的含磷脂酰胆碱的二醇I(其中Z为酰胺基)时，即采用二羟基被乙酰基(Ac)保护的III和羟烷基酸V作原料，在N，N-二甲基甲酰氨和四氢呋喃溶剂中，采用常规的DCC(N，N-二环己基碳二亚胺)缩合法使III的氨基和V的羧基反应生成以Ac为保护基的含酰胺化合物VIII。再以获得的含酰胺化合物VIII与亚乙基磷酰氯Ⅳ、三甲氨VI为原料，根据文献[T.Umeda，T.Nakaya，M.Imoto.Markromol.Chem.，Rapid Commun.，1982(3)，457-459.]报道的方法即可将VIII的羟基转换成磷脂酰胆碱基团，最后脱除保护基团即可得目标产物。
如果制备侧链含氟碳链的含磷脂酰胆碱二醇II(其中Z代表酰胺键，Q代表氧原子)时，首先将含氟二醇VII的两端引入一定的脂肪链间隔基，因为氟碳链为强吸电子基团，不引入间隔基将使后面的反应速率很慢。而引入间隔基的方法很多，可采用Williamson醚合成法，以含氟二醇VII和溴乙酸为原料，得到两端为羧基的含氟二元酸，再采用还原反应将含氟二元酸转变成含氟碳链的羟烷基酸。这种羟烷基酸即可与二羟基被乙酰基(Ac)保护的原料III进行缩合反应生成侧链带羟基的含酰胺的化合物。最后根据文献[T.Umeda，T.Nakaya，M.Imoto.Markromol.Chem.，Rapid Commun.，1982(3)，457-459.]报道的方法即可将该化合物的羟基转换成磷脂酰胆碱基团，最后脱除保护基团即可得目标产物。
本发明的含磷脂酰胆碱的二醇I和II的侧链Z为其他连接键，如氨基甲酸酯、醚或硫醚时，不会根本改变本发明的思想，因此仍属于本发明的范围。
上述任一方法制备的含磷脂酰胆碱二元醇的用途是可用于聚合物的合成、靶向药物载体和药物缓释材料。
用本发明提供的含磷脂酰胆碱二元醇特别是含氟的磷脂酰胆碱二元醇来制备聚合物时，将使聚合物表面形成类似生物膜的结构，大大提高血液相容性，同时又不影响材料的力学性能。
四、具体实施方式
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，但值得指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
下面实施例所用的代号分别为：
AMP：1，1-二羟甲基乙胺 BOC：二叔丁氧碳酸酐
BOCAMP：1，1-二羟甲基乙氨基甲酸叔丁酯
BDAPA：1，1-二乙酰氧甲基乙氨基甲酸叔丁酯
DAPA：2-甲基-2-氨基丙二醇二乙酸酯
DCC：N，N-二环己基碳二亚胺 COP：亚乙基环磷酰氯
HDADEA：羟壬基-N-(1，1-二乙酰氧甲基乙基)酰胺
HDEAPC：1，1-二羟甲基乙酰胺-壬基磷脂酰胆碱
HDFDOL：1，1，10，10-四氢-全氟癸二醇
HFDDA：二羧甲基-1，1，10，10-四氢-全氟癸二醚
HDAOL：羧甲基-羟乙基-1，1，10，10-四氢-全氟癸二醚
HFDEA：N-(1，1-乙酰氧甲基-乙基)-(羟乙基-1，1，10，10-四氢-全氟癸二醚)-甲酰胺
HFDEAPC：N-(1，1-乙酰氧甲基-乙基)-(乙基-1，1，10，10-四氢-全氟癸二醚)-甲酰胺磷脂酰胆碱
HOBt：1-羟基苯并三唑 DMSO：二甲亚砜
实施例1
本实施例是1，1-二羟甲基乙酰胺-壬基磷脂酰胆碱(HDEAPC)的合成。
第一步：BDAPA的合成
将10.5克AMP(0.1mol)溶于50ml水中，再加入50ml 1，4-二氧噁烷和25.92克BOC(0.12mol)，室温反应24h。减压蒸馏除去水和1，4-二氧噁烷，剩余的油状物，用适量的乙醚溶解。再加入石油醚(沸程30～60℃)沉淀，并减压蒸馏到析出晶体，抽滤，烘干得18.8克BOCAMP(收率：91.7％)。将所得到的18.8克BOCAMP(0.092mol)溶解于200ml无水四氢呋喃中，并加入25.4ml三乙胺(0.184mol)，冰浴冷却到0℃左右，将14.5ml乙酰氯，缓慢滴加到上述溶液中，可见有大量白色沉淀三乙胺盐酸盐生成，滴加完毕后，让温度缓慢升至室温保持2h左右，抽滤除去三乙胺盐酸盐，减压浓缩滤液得油状物，硅胶柱层析得到21.5克BDAPA(0.075mol)(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3)。
IR：1513，1371，1240，1167，1078，1046，3373，2979，2860，1748，1735，
MS(+)：理论值：289，测定值：312(289+Na+)。
1H-NMR(CDCl3，TMS，200HZ)δppm：1.35(3H，s，-C-CH3)，1.42(9H，s，-C(CH3)3)，4.18(4H，dd，J1＝11.1，J2＝22.5，-C-CH2-)，4.72(1H，s，-NH-)，2.07(3H，s，CH3-COO-)。
第二步：HDADEA的合成
将9.4克BDAPA(32.9mmol)用40ml饱和氯化氢乙酸乙酯溶液酸解2h后，减压浓缩得油状物DAPA。将此油状物用50ml N，N-二甲基甲酰胺和200ml四氢呋喃溶解后，加入4.6ml三乙胺、5.3克10-羟基癸酸(28.0mmol)和5.7克HOBt，然后，冰浴冷却至0℃左右，加入6.4克DCC(29.7mmol)，反应24h，抽滤除去沉淀，浓缩得油状物，硅胶柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝4∶3)，得纯品HDADEA 5.0克(收率50％)。
IR：3312，2929，2856，1746，1656，1544，1463，1376，1238，1046。
MS(+)：理论值：359，测定值：382(359+Na+)。
1HNMR(DMSO，TMS，200HZ)δppm：1.23(13H，brs，(CH2)5，CH3-C-)，1.35～1.39(4H，m，-CH2CH2OH，-CH2CH2COOH)，2.00(6H，s，CH3COO)，2.00～2.07(2H，m，-CH2CONH)，4.16(4H，s，-CH2-OCO)。
第三步：HDEAPC的合成
将4.5克HDADEA(0.0125mol)溶于100ml无水乙醚和30ml无水乙腈的混合溶液中，氮气保护下，温度降至-20℃左右，加入1.73ml三乙胺(0.0125mol)，然后缓慢滴加1.78克COP(0.0125mol)于溶液中，保持-20℃半小时，让温度自然升至室温，反应1小时，抽滤除去三乙胺盐酸盐。滤液用氮气流吹干，再用无水乙醚溶解，抽滤除去剩余的三乙胺盐酸盐。滤液用氮气流吹干，加入60ml无水乙腈并转移至压力瓶中，冰浴冷却至-18℃左右，加过量的三甲胺，密封，油浴升温至55℃，反应16h后，将乙腈减压蒸去，油状物用甲醇溶解，氨水水解，用C18反相硅胶水-甲醇柱层析得5.2gHDEAPC(收率94.5％)。
IR：3292，2928，2855，1651，1555，1462，1368，1235，968。
MS(+)：理论值：440，测定值：317(20％)，400(15％)，441(100％)，881(20％)
1H-NMR(DMSO，TMS)δppm：1.11(3H，s，CH3-C)，1.24(10H，brs，-CH2CH2CH2CH2CH2-)，1.46～1.47(4H，m，-CH2CH2O，-CH2CH2CONH)，2.04～2.09(2H，m-CH2CONH)，3.13(9H，s，-C(CH3)3)，3.36～3.52(6H，m，2-CH2OH，-CH2-N)，3.60～3.65(2H，m，CCH2OP)，4.02～4.023(2H，m，POCH2C)，5.15(2H，brs，OH)，7.41(1H，s，NH)
实施例2
本实施例是N-(1，1-乙酰氧甲基-乙基)-(乙基-1，1，10，10-四氢-全氟癸二醚)-甲酰胺磷脂酰胆碱(HFDEAPC)的合成。
第一步：HFDDA的合成
将1.94克HDFDOL(4.2mmol)溶于30ml二甲基亚砜，在氮气保护下，将0.68g氢化钠(16.8mmol)缓慢加入二甲基亚砜溶液中，加完氢化钠后，再反应20min，将1.17g溴乙酸(8.4mmol)溶于10ml无水四氢呋喃中，并缓慢滴加到上述的二甲基亚砜溶液中。滴加完毕后，反应2h，然后缓慢滴加180ml冰水于二甲基亚砜溶液中，再用稀盐酸酸化至pH值3。用100ml乙酸乙酯分三次萃取反应液，合并乙酸乙酯层用饱和氯化钠溶液洗涤至中性，最后用蒸馏水洗涤一次，无水硫酸镁干燥24h后，减压蒸去大部分乙酸乙酯，用石油醚沉淀，过滤沉淀，沉淀用30～60℃的石油醚洗涤，干燥得到2.3克HFDDA(收率94.7％)。
IR：3424(OH)，3023(-CH2-)，1731(-CO-)，1208(CF2)，1146(CF2-O-)
MS(+)：理论值：578，测定值：579
1HNMR(DMSO，TMS)δppm：4.23(4H，s，-CH2-COOH)，4.28(4H，t，J＝19.4HZ，-CH2-CF2)，12.91(2H，Drs，-COOH)。
第二步：HDAOL的合成
将2.3克HFDDA(3.98mmol)溶于40ml无水四氢呋喃中，冰盐浴冷至-15℃左右，加入1.10mol三乙胺(7.96mmol)，然后加入0.74ml氯甲酸异丁酯(5.0mmol)，反应15min，加入过量的硼氢化钠，反应2h后，加入水，分解未反应的硼氢化钠。将反应液浓缩后，加入乙酸乙酯溶液，并用稀盐酸、饱和氯化氢、蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯得粗产品，硅胶柱层析乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱得到0.98克HDAOL(1.74mmol)，收率：43.7％。
IR：3443(OH)，3020，2927(-CH2-)，1754(C＝O)，1206(CF2)，1147(CF2，C-O-C)
MS(+)：理论值：564，测定值：565
1HNMR(DMSO，TMS)δppm：3.53(2H，t，J＝4.8HZ，-CH2-OH)，3.62(2H，m，-CH2-O-)，4.16～4.35(4H，m，-CH2-CF2)，4.19(2H，s，-CH2COOH)，4.74(1H，br，-OH)。
第三步：HFDEA的合成
将1.45克BDAPA(5.0mmol)用10ml饱和氯化氢乙酸乙酯溶液酸解2h后，减压浓缩得油状物DAPA，将此油状物用40ml N、N-二甲基甲酰胺和30ml四氢呋喃溶解后，加入1.1ml三乙胺、2.7克HDAOL(4.8mmol)和0.98克HOBt；然后冰浴冷却至0℃左右，加入1.0克DCC(4.8mmol)，反应24h，抽滤除去沉淀，浓缩得油状物，硅胶柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2)得到1.8克HFDEA(2.45mmol)，收率：51.0％。
IR：3413(NH)，2937(CH2，CH3)，1745(-C＝O)，1685(CONH)。
1219(CF2)，1150(CF2)，1047(C-O-C)。
MS(+)：理论值：718，测定值：719。
1HNMR(DMSO，TMS)δppm：1.29(3H，s，-CH3)，2.01(6H，s，CH3CO)，3.52(2H，m，CH2OH)，3.60(2H，m，-CH2-O-)，4.05(4H，s，-CH2OCO)，4.13(2H，s，CH2-CONH-)，4.12～4.34(4H，m，-CH2-CF2)。
第四步：HFDEAPC的合成
将8.1克HFDEA(11.0mmol)溶于100ml无水乙醚和30ml无水乙腈的混合溶剂中，氮气保护下，温度降至-20℃左右，加入1.6ml三乙胺(11.0mmol)，然后缓慢滴加1.6克亚乙基磷酰氯COP(11.0mmol)于溶液中，保持-20℃半小时，让温度自然升至室温，反应1小时，抽滤除去三乙胺盐酸盐，滤液用氮气流吹干，再用无水乙醚溶解，除尽剩余的三乙胺盐酸盐。氮气吹干无水乙醚后，加入60ml无水乙腈并转移至压力瓶中，冰盐浴冷却至-18℃左右，加入过量的三甲胺，密封，油浴升温至55℃，反应16h后，将乙腈减压蒸去，油状物用甲醇溶解，氨水水解，用C18反相硅胶水-甲醇柱层析得8.6克HFDEAPC(10.6mmol)收率：96％。
IR：3298(OH，NH)，2941(CH2)，1677(C＝O)，1204(CF2，P＝O)，1147(CF2，C-O-C)，1063(P-OCH2)。
MS(+)：理论值：816，测定值：817
1H-NMR(DMSO，TMS)δppm：1.17(3H，s，-CH3)，3.12(9H，s，-N(CH3)3)，3.38～3.53(6H，m，2-CH2OH，-CH2N)，3.6～3.8(CH2，m，CH2OP)，4.01～4.04(4H，m，POCH2，COCH2)，4.16～4.34(4H，m，-CH2CF2)，4.92(2H，m，OH)，7.32(1H，s，NH)。
应用例1
首先在一个装有搅拌器、温度计、回流装置的反应釜中加入体积比1∶5的THF/DMAc混合溶剂，其加入的量与加入的反应物的重量比为4∶1，然后加入分子量为1000的聚碳酸酯二元醇20克进行搅拌，并升温至70℃后，再加入实施例2制备的HFDEAPC 8.16克和1，4-丁二醇0.9克混合物作为扩链剂，充分搅拌使反应物完全溶解，最后再加入4，4′-二苯基甲烷二异氰酸酯10克，升温至90℃，反应5小时，停止搅拌、冷却。即得固含量约20％的侧链含氟磷脂酰胆碱聚氨酯溶液。
应用例2
首先在一个装有搅拌器、温度计、回流装置的反应釜中加入体积比1∶5的THF/DMAc混合溶剂，其加入的量与加入的反应物的重量比为4∶1，然后加入分子量为1000的聚碳酸酯二元醇20克进行搅拌，并升温至70℃后，再加入实施例1制备的HDEAPC 1.65克和1，4-丁二醇1.44克混合物作为扩链剂，充分搅拌使反应物完全溶解，最后再加入4，4′-二苯基甲烷二异氰酸酯10克，升温至90℃，反应5小时，停止搅拌、冷却。即得固含量约20％的侧链含磷脂酰胆碱聚氨酯溶液。
比较例
首先在一个装有搅拌器，温度计，真空装置的反应釜中加入聚碳酸酯二元醇20克，升温至90℃，充分搅拌混和后真空脱气30分钟，降温至50℃，然后加入4，4′-二苯基甲烷二异氰酸酯10克反应40分钟，最后加入1，4-丁二醇1.8克，剧烈搅拌，升温至100℃反应15分钟。将反应混合物转移至100℃预热的聚四氟乙烯盘中，在100℃烘箱中后熟化了4小时即得聚碳酸酯聚氨酯。
为了考察用本发明提供的含磷脂酰胆碱二元醇作为扩链剂，制备的侧链含磷脂酰胆碱聚氨酯材料的力学性能和生物相容性能，对应用例和比较例中获得的材料进行了以下一些测试，并分别说明如下：
1、材料的力学性能测试 将所得的材料均配成10％的溶液后浇铸成膜，膜厚约1mm，采用哑铃形标准样刀制成样片，每种材料各5片，力学性能测试在Instron-4302型拉力试验机上进行，所得数据为五次测试的平均值，数据如下：
材料 拉伸强度Mpa 弹性模量Mpa 断裂伸长率％
应用例1 22.8±4.1 35.5±0.9 387.8±45.1
应用例2 34.8±7.7 27.8±2.6 207.9±30A
比较例 57.9±4.1 22.9±2.2 369.7±31.8
PBDI* 5.5 3.3 233
*PBDI为文献参考值(J.Mater.Chem.，1999，9：647)，PBDI为含磷脂酰胆碱聚氨酯
从上表材料的力学性能比较可以看出，用本发明提供的含磷脂酰胆碱二元醇作为扩链剂制备的侧链含磷脂酰胆碱聚氨酯材料的力学性能，比参考文献的侧链含氟磷脂酰胆碱聚氨酯的力学性能有了较大的提高。
2、材料蛋白吸附的测定 平板膜上的蛋白吸附量通过微量BCA蛋白质定量检测方法测定。将所得材料均配成10％的溶液后浇铸成平板膜，在测试前需用高纯水充分清洗，并将膜片浸泡在高纯水中，80℃下孵化2小时即可用于蛋白吸附的测试。将牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(IgG)和纤维蛋白原(Fbg)分别用pH7.4的PBS缓冲溶液配制成0.5，0.15和0.05mg/ml的浓度。在蛋白吸附前，测试的膜片需再用PBS(pH7.4)溶液浸泡2小时，然后将200μl蛋白液涂覆于准备好的测试膜片上，于37℃孵化2小时。孵化完成后，用PBS缓冲溶液充分清洗4次。然后用1.5ml的1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液(w/w，PBS溶液)超声清洗20分钟，取1.0ml的清洗液于试管中，再加入1.0ml的试剂盒(Micro-BCATM蛋白质检测试剂盒)工作液，充分混合，密封，60℃水浴孵化1小时。然后冷却到室温，于562nm测定吸光度(721型分光光度计，四川分析仪器厂)。每个样品做3个平行样，所得数据如下表所示。
从上表可以看出，用本发明提供的含磷脂酰胆碱二元醇作为扩链剂制备的侧链含磷脂酰胆碱聚氨酯材料的蛋白吸附量明显低于比较例所得的传统聚氨酯材料。