一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及制备方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310038337.7	申请日：	2013.01.31
公开号：	CN103113419A	公开日：	2013.05.22
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07F 17/02申请日:20130131\|\|\|公开
IPC分类号：	C07F17/02; G01N27/30; A61K47/24; A61K9/06; A61P35/00; A61P29/00	主分类号：	C07F17/02
申请人：	中南大学
发明人：	张翼; 孙志方; 李正元; 戴璇; 何庭
地址：	410083 湖南省长沙市岳麓区麓山南路932号
优先权：
专利代理机构：	长沙市融智专利事务所 43114	代理人：	袁靖
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内容摘要

本发明公开了一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及其制备方法。该方法包括以下操作步骤：利用活化的二茂铁化学修饰苯丙氨酸，得到二茂铁-苯丙氨酸水凝胶因子；将凝胶因子的二甲基亚砜溶液用pH为7.4的PBS稀释到0.5%（w/v），即可形成水凝胶。本发明制备的水凝胶简单廉价，具有多重响应性质，且同时保存二茂铁的氧化还原活性和氨基酸或短肽的生物活性，有望在药物缓释、生物传感、响应材料等领域得到广泛应用。

权利要求书

权利要求书一种多响应超分子水凝胶因子，其特征在于，结构式为：
。
一种多响应超分子水凝胶，其特征在于，该水凝胶由权利要求1所述的水凝胶因子在pH为7.4的PBS缓冲溶液中组装而成。
权利要求2所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①将摩尔比为1:1.2:1.2的二茂铁单甲酸、1‑羟基苯并三唑和苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐溶于无水二氯甲烷，冰浴下缓慢滴加三乙胺至反应物pH为8.0到9.0之间；搅拌反应40分钟到1小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次；萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得暗红色化合物（1）；
②将摩尔比为1:1.2的化合物（1）和L‑苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶于无水二氯甲烷，然后逐滴加入三乙胺至反应物pH为8.0到9.0之间，常温下搅拌反应10小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次；萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得黄色化合物（2）；
③将化合物（2）溶于40mL甲醇，逐滴加入1M NaOH20mL，VMeOH:VNaOH=2:1，常温下搅拌反应2小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，用盐酸中和成中性，旋转蒸发除去甲醇；随后加入二氯甲烷100mL，依次用5%HCl和蒸馏水各萃取一次，萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得黄色化合物（3），即二茂铁苯丙氨酸；
④取950微升PBS加入到洗净吹干的螺口瓶内，水浴加热到70℃，向PBS溶液逐滴加入50微升质量比为0.5%的黄色化合物（3）的二甲基亚砜溶液；边加变摇动，直到形成澄清的溶液；放置于室温下自然冷却，10分钟后，即形成澄清水凝胶。
根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
将步骤③得到的二茂铁苯丙氨酸用二甲基亚砜配制成100mg/mL的储备溶液；取50微升储备溶液于干净的螺口瓶，快速加入950微升PBS，超声3秒，水凝胶即可形成。

说明书

说明书一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及制备方法
技术领域
本发明涉及一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及其制备方法。特别地，涉及一种利用二茂铁通过化学修饰连接具有芳香性的苯丙氨酸，通过芳香堆积和氢键自组装制备多响应、多功能超分子水凝胶的方法。
背景技术
水凝胶（Hydrogel）是以水为分散介质的凝胶。传统的水凝胶是由交联的高分子网状结构束缚水分子制备而成。最近十几年，随着小分子有机凝胶的兴起(Chem.Rev.1997,97,3133)，小分子水凝胶(Chem.Rev.2004,104,1201)逐渐进入人们的视野。小分子水凝胶即超分子水凝胶（Supramolecular hydrogel），它是由小分子在水中利用非共价键作用通过自组装形成具有网状的超分子结构，以此束缚水分子形成半固体状的水凝胶。非共价键作用也称弱化学键作用，它们是分子组装的驱动力，包括氢键、离子键、π‑π键、范德华力、疏水作用等作用力。在超分子水凝胶中，组装的小分子称为凝胶因子（Hydrogelator）。
水凝胶因子相比传统的高分子凝胶剂而言具有很多固有的优点。第一，水凝胶因子为研究分子在水溶液中的组装提供十分方便的体系；第二，不同于高分子凝胶剂的是，水凝胶因子一般都具有准确的构型和构象，这样为构建功能可预测的复杂水凝胶体系和得到满意的具有生物功能的规整纳米结构提供优良的平台；第三，由于超分子水凝胶是由水凝胶因子通过弱化学键作用锁合在一起，因此，由水凝胶因子组装而成的网状纳米结构比高分子凝胶剂具有更好的生物相容性和生物可降解性；第四，由于大多临床使用的药物都是小分子，所以，研究者完全有可能通过将药物小分子设计成凝胶因子（J. Am.Chem.Soc.2009,131,13576‑13577），以此形成水凝胶达到“药物自缓释”的功效。这样就可以避免药物的包覆过程，具有疗效的药物，即凝胶因子，直接从水凝胶中缓慢释放出来，从而为药物缓释提供一个自缓释的平台。
鉴于水凝胶因子这些优良的性质，我们决定设计一些具有多种刺激响应性质的超分子水凝胶。
刺激响应超分子凝胶作为新的功能材料近年来在诸多领域拥有广泛的应用前景。这些领域包括传感器、促动器、形状记忆、药物传递、显示器等等。
基于9‑芴甲氧羰基（Fmoc）的氨基酸或短肽水凝胶具备生物相容好、生物易降解、化学可修饰及廉价易制备等诸多优良性质，现已被广泛用于细胞培养、组织工程、药物缓释、生物医药等领域。以Fmoc短肽为凝胶因子的超分子水凝胶形成原理是，Fmoc提供π‑π键，短肽提供氢键或部分π‑π键，在水溶液中组装成网状纤维束缚水分子形成凝胶状物质。Fmoc‑短肽水凝胶一般具有热响应和pH响应双重响应，但是，它们很难具有其它方面的刺激响应，如电化学响应，氧化还原响应，光响应等等。
基于二茂铁（Fc）的有机凝胶因子(Adv.Mater.2008,20,2508–2511)已多次被用来设计具有电化学及氧化还原响应的超分子有机凝胶。但是，由于有机凝胶分散介质是有机溶剂，所以大大限制了其应用。换言之，如果把基于二茂铁的凝胶因子设计成水凝胶，则其由于同时具备超分子水凝胶的特性，又具备多种刺激响应性质，将很大程度改善其在生物医药、药物缓释、细胞培养，生物传感等方面的应用。
由于Fmoc‑短肽和二茂铁衍生物凝胶因子都具有自身的缺陷，结合Fmoc‑短肽组装成超分子的原理，我们考虑将二茂铁‑短肽（氨基酸）设计成水凝胶因子。其设计原理是，二茂铁具有芳香性，在组装过程中可以提供π‑π堆积；短肽具有酰胺键（部分氨基酸具有π‑π键），在组装过程中提供氢键或部分π‑π堆积。协调二茂铁‑短肽分子之间的非共价键，则其可以在水中组装成超分子水凝胶。
利用上述原理，我们成功设计出二茂铁‑苯丙氨酸水凝胶因子。以此形成的水凝胶同时保存二茂铁的氧化还原活性，也具备氨基酸或短肽的生物活性。实验结果表明，该水凝胶有望在药物缓释、生物传感、响应材料等领域有很好的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及制备方法，该超分子水凝胶具有多重响应性质（温度可逆、pH可逆和氧化还原可逆），符合智能和功能性纳米材料的要求。
一种多响应超分子水凝胶因子，结构式为：

一种多响应超分子水凝胶，由所述的水凝胶因子在PBS缓冲溶液中组装而成。
所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
①将摩尔比为1:1.2:1.2的二茂铁单甲酸(Fc‑COOH)、1‑羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)溶于无水二氯甲烷(DCM)，冰浴下缓慢滴加三乙胺(Et3N)至反应物pH为8.0到9.0之间；搅拌反应40分钟到1小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次；萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得暗红色化合物（1）；
②将摩尔比为1:1.2的化合物（1）和L‑苯丙氨酸甲酯盐酸盐（H‑Phe‑OMe·HCl）溶于无水二氯甲烷，然后逐滴加入三乙胺至反应物pH为8.0到9.0之间，常温下搅拌反应10小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次；萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得黄色化合物（2）；
③将化合物（2）溶于40mL甲醇（MeOH），逐滴加入1M NaOH20mL(VMeOH:VNaOH=2:1)，常温下搅拌反应2小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，用盐酸中和成中性，旋转蒸发除去甲醇；随后加入二氯甲烷100mL，依次用5%HCl和蒸馏水各萃取一次，萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得黄色化合物（3），即二茂铁苯丙氨酸（Fc‑Phe‑OH）；
④取950微升PBS加入到洗净吹干的螺口瓶内，水浴加热到70℃，向PBS溶液逐滴加入50微升质量比为0.5%的黄色化合物（3）的二甲基亚砜（DMSO）溶液，边加变摇动，直到形成澄清的Fc‑Phe‑OH溶液；放置于室温下自然冷却，10分钟后，即形成澄清水凝胶。
或者还可以将步骤③得到的Fc‑Phe‑OH用二甲基亚砜配制成100mg/mL的储备溶液；取50微升储备溶液于干净的螺口瓶，快速加入950微升PBS，超声3秒，水凝胶即可形成。
本发明使用的水凝胶因子为二茂铁苯丙氨酸（Fc‑Phe‑OH）。其结构式为如下：

Fc‑Phe‑OH的合成路线如下：

本发明合成的凝胶因子的结构经ESI‑MS和1H‑NMR表征确证。具体数据如下：
EI‑MS(Negative ion mode)calculated for Fc‑Phe‑OH(C20H19FeNO3):377.07;Found:375.89[M‑H]‑.1H NMR(CDCl3),δ=7.325（2H,d,J＝6Hz,CH,Phe）,7.281(3H,m,CH,Phe),6.223(1H,d,J＝6.7Hz,NH,Phe),4.950(1H,d,J＝7.2Hz,α‑CH,Phe),4.613(1H,s,α‑CH,Cp),4.585(1H,s,α‑CH’,Cp),4.310(2H,s,β‑CH,Cp),4.061(5H,s,Cp),3.250(1H,d,J＝7.0Hz,β‑CH,Phe).
本发明的水凝胶在人体生理pH（7.4）环境下具有最好的成凝胶性质。即，在pH大于或小于7.4时，该水凝胶的形成都会受到影响。当pH大于7.4时，凝胶不能形成，把pH调回7.4时，澄清的水凝胶迅速形成；当pH小于7.4时，为浑浊溶液或浑浊水凝胶，把pH调回7.4时，澄清的水凝胶迅速形成。由于二茂铁具有良好的生物活性（如抗肿瘤、抗菌性，跨膜性等等）和电化学活性，因此以二茂铁修饰的氨基酸或短肽在pH为7.4的PBS中形成的水凝胶在药物缓释、生物传感、细胞培养、组织工程、生物医药等领域有广泛的应用前景。
本发明首次发现利用二茂铁修饰苯丙氨酸，通过二茂铁和苯丙氨酸的芳香堆积以及氢键自组装形成超分子水凝胶。至此克服了二茂铁修饰物只能得到超分子有机凝胶的困难。该超分子水凝胶具有多重响应性质（温度可逆、pH可逆和氧化还原可逆），符合智能和功能性纳米材料的要求。
本发明使用的凝胶因子Fc‑Phe‑OH能以较低浓度和pH为7.4的PBS溶液形成半透明的水凝胶（如图1）。该水凝胶具体制备方法如下：
将Fc‑Phe‑OH用二甲基亚砜配制成100mg/mL的储备溶液。取50微升储备溶液于干净的螺口瓶，快速加入950微升PBS，超声数秒，水凝胶即可形成。
需要指出的是，本发明方法形成的水凝胶为半透明状。原因是Fc‑Phe‑OH分子在PBS中自组装的速度过快（只需数秒钟），因此，采用以PBS直接稀释储备溶液的方法时，难免出现加入不均匀的情况。加入不均匀导致自组装不均匀，即有的地方聚集浓度过高，而有的地方聚集浓度过低，聚集浓度高的地方即出现半透明或不透明状。
考虑到该超分子水凝胶具有热可逆性质，即加热到一定温度可使凝胶转变成溶胶，而降低到室温时溶胶随即转变为凝胶。因此，利用其热可逆可以排除PBS加入不均匀的情况，以此可以制成澄清透明的水凝胶。该澄清透明水凝胶的另一种制备方法为：
取950微升PBS加入到洗净吹干的螺口瓶内，水浴加热到70℃，向PBS溶液逐滴加入50微升质量比为0.5%的Fc‑Phe‑OH的二甲基亚砜（DMSO）溶液，边加变摇动，直到形成澄清的Fc‑Phe‑OH溶液；放置于室温下自然冷却，10分钟后，即形成澄清水凝胶。
有益效果
(1)本发明扩大基于有机金属超分子水凝胶的范围，尝试并成功制备基于二茂铁芳香性的氨基酸的多响应超分子水凝胶。即首次提出利用二茂铁和芳香性氨基酸（苯丙氨酸）通过芳香堆积和氢键协同作用，自组装形成三维网状纤维，以此束缚水分子形成超分子水凝胶。
(2)本发明制备的超分子水凝胶具有温度可逆、pH可逆、氧化还原可逆等多种响应性质，符合智能材料的要求。
(3)本发明制备的超分子水凝胶在人体生理pH（7.4）环境下具有最好的成凝胶性质。鉴于苯丙氨酸具备良好的生物相容性，二茂铁具有良好的抗肿瘤抗炎症等特性，该二茂铁‑苯丙氨酸超分子水凝胶有望于在组织工程或生物体内有良好的应用。
(4)本发明制备的超分子水凝胶可以包覆罗丹明、亚甲基蓝等等染料或药物分子，其成凝胶性质不受这些药物分子的影响，因此有望应用于药物缓释领域。
(5)本发明制备的超分子水凝胶的微观显微结构为直径约80‑110nm的纤维，纤维上大量存在二茂铁基团。而二茂铁本身为氧化还原活性探针，并且水凝胶不受外加物的影响。该水凝胶纤维可以和羧基化碳纳米管共组装形成杂化水凝胶纳米材料。该杂化纳米材料可以用于修饰电极制备，从而应用于电化学生物传感器领域。
(6)本发明制备的超分子水凝胶在高浓度氯化钠溶液中依然可以形成，即，离子强度对其成凝胶性质影响不大。因此，该水凝胶为耐盐性水凝胶。
(7)本发明制备的超分子水凝胶制备简单，凝胶因子可大量廉价合成。因此，在以上的应用中，该水凝胶为非常合适的选择。
附图说明
图1为Fc‑Phe‑OH超分子水凝胶的扫描电镜显微图(左列)、原子力显微图（中列）和透射电镜显微图（右列）；
图2为Fc‑Phe‑OH超分子水凝胶的多响应数码照片，即为氧化还原、剪切力、pH、温度的可逆相转变照片；
图3为Fc‑Phe‑OH超分子水凝胶包覆罗丹明、亚甲基蓝的数码照片及其模拟药物缓释释放曲线；
图4为Fc‑Phe‑OH超分子水凝胶与羧基化碳纳米管共组装形成超分子纳米纤维/碳纳米管杂合水凝胶的照片及其SEM图；
图5为自组装Fc‑Phe‑OH超分子水凝胶纳米纤维包覆葡萄糖氧化酶用于生物传感器平台的电化学循环伏安图；
图6Fc‑Phe‑OH在含1mol·L‑1NaCl的PBS溶液中形成稳定水凝胶的照片及其纳米纤维束缚NaCl与Na2HPO4/NaH2PO4结晶的SEM图；
图7为从头计算揭示Fc‑Phe‑OH超分子水凝胶自组装机理的分子模拟图；
图8为自组装Fc‑Phe‑OH超分子水凝胶的紫外(a)、圆二色谱(b)和组装示意图(c)。
具体实施方式
下面列举具体实施例对本发明进行详细描述，但不限于这些实例。
实施例1
称取1.84克Fc‑COOH(8mM)，溶于250ml无水二氯甲烷，冰浴下加入1.20克HOBt和3.36克HBTU(各8.8mM)。缓慢滴加三乙胺约6mL。冰浴下搅拌反应40分钟到1小时。薄层层析（TLC）点板跟踪反应。待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次。萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得暗红色化合物（1）2.60克。
称取化合物（1）1.6克，溶于50mL无水二氯甲烷，加入H‑Phe‑OMe·HCl0.86克。然后逐滴加入三乙胺2mL，常温下反应约10小时。TLC点板跟踪反应。待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次。萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得黄色化合物（2）1.13克。
将得到的1.13克黄色化合物（2）溶于25mL甲醇，逐滴加入12mL1M NaOH，常温下搅拌反应2小时。TLC点板跟踪反应。待反应完毕，用盐酸中和成中性，旋蒸除去甲醇。随后加入二氯甲烷，依次用5%HCl和蒸馏水各萃取一次，萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得黄色化合物（3）0.87克。
将黄色化合物（3）即Fc‑Phe‑OH用二甲基亚砜配制成100mg/mL的储备溶液。取50微升储备溶液于干净的螺口瓶，快速加入950微升PBS，超声3秒，水凝胶即可形成。
实施例2
将摩尔比为1:1.2:1.2的Fc‑COOH、HOBt和HBTU溶于无水二氯甲烷，冰浴下缓慢滴加三乙胺至pH8.0‑9.0。搅拌反应40分钟到1小时。薄层层析（TLC）点板跟踪反应。待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次。萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得暗红色化合物（1）。
将摩尔比为1:1.2的化合物（1）和H‑Phe‑OMe·HCl溶于无水二氯甲烷，然后逐滴加入三乙胺至pH8.0‑9.0，常温下搅拌反应约10小时。TLC点板跟踪反应。待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和水各萃取一次。萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得黄色化合物（2）。
将化合物（2）溶于40ml甲醇，逐滴加入1MNaOH20ml，常温下搅拌反应2小时。TLC点板跟踪反应。待反应完毕，用盐酸中和成中性，旋蒸除去甲醇。随后加入二氯甲烷，依次用5%HCl和蒸馏水各萃取一次，萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得黄色化合物（3）。
取950微升PBS加入到洗净吹干的螺口瓶内，水浴加热到70℃，向PBS溶液逐滴加入50微升质量比为0.5%的Fc‑Phe‑OH的二甲基亚砜（DMSO）溶液，边加变摇动，直到形成澄清的Fc‑Phe‑OH溶液；放置于室温下自然冷却，10分钟后，即形成澄清水凝胶。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 103113419 A(43)申请公布日 2013.05.22CN103113419A*CN103113419A*(21)申请号 201310038337.7(22)申请日 2013.01.31C07F 17/02(2006.01)G01N 27/30(2006.01)A61K 47/24(2006.01)A61K 9/06(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 29/00(2006.01)(71)申请人中南大学地址 410083 湖南省长沙市岳麓区麓山南路932号(72)发明人张翼孙志方李正元戴璇何庭(74)专利代理机构长沙市融智专利。

2、事务所 43114代理人袁靖(54) 发明名称一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及制备方法(57) 摘要本发明公开了一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及其制备方法。该方法包括以下操作步骤：利用活化的二茂铁化学修饰苯丙氨酸，得到二茂铁-苯丙氨酸水凝胶因子；将凝胶因子的二甲基亚砜溶液用pH为7.4的PBS稀释到0.5%（w/v），即可形成水凝胶。本发明制备的水凝胶简单廉价，具有多重响应性质，且同时保存二茂铁的氧化还原活性和氨基酸或短肽的生物活性，有望在药物缓释、生物传感、响应材料等领域得到广泛应用。(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书6页附图4页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12。

3、)发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图4页(10)申请公布号 CN 103113419 ACN 103113419 A1/1页21.一种多响应超分子水凝胶因子，其特征在于，结构式为：。2.一种多响应超分子水凝胶，其特征在于，该水凝胶由权利要求1所述的水凝胶因子在pH为7.4的PBS缓冲溶液中组装而成。 3.权利要求2所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将摩尔比为1:1.2:1.2的二茂铁单甲酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸盐溶于无水二氯甲烷，冰浴下缓慢滴加三乙胺至反应物pH为8.0到9.0之间；搅拌反应40分钟到1小时；薄层层析点板跟。

4、踪反应；待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次；萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得暗红色化合物（1）；将摩尔比为1:1.2的化合物（1）和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶于无水二氯甲烷，然后逐滴加入三乙胺至反应物pH为8.0到9.0之间，常温下搅拌反应10小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次；萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得黄色化合物（2）；将化合物（2）溶于40mL甲醇，逐滴加入1M NaOH20mL，VMeOH:VNaOH=2:1，常温下搅拌反应2小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，用盐酸中和成中性，旋转蒸。

5、发除去甲醇；随后加入二氯甲烷100mL，依次用5%HCl和蒸馏水各萃取一次，萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得黄色化合物（3），即二茂铁苯丙氨酸；取950微升PBS加入到洗净吹干的螺口瓶内，水浴加热到70，向PBS溶液逐滴加入50微升质量比为0.5%的黄色化合物（3）的二甲基亚砜溶液；边加变摇动，直到形成澄清的溶液；放置于室温下自然冷却，10分钟后，即形成澄清水凝胶。 4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将步骤得到的二茂铁苯丙氨酸用二甲基亚砜配制成100mg/mL的储备溶液；取50微升储备溶液于干净的螺口瓶，快速加入950微升PBS，超声3秒，水凝胶即可形成。权利要求。

6、书CN 103113419 A1/6页3一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及制备方法技术领域0001 本发明涉及一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及其制备方法。特别地，涉及一种利用二茂铁通过化学修饰连接具有芳香性的苯丙氨酸，通过芳香堆积和氢键自组装制备多响应、多功能超分子水凝胶的方法。背景技术0002 水凝胶（Hydrogel）是以水为分散介质的凝胶。传统的水凝胶是由交联的高分子网状结构束缚水分子制备而成。最近十几年，随着小分子有机凝胶的兴起(Chem.Rev.1997,97,3133)，小分子水凝胶(Chem.Rev.2004,104,1201)逐渐进入人们的视野。小分子水凝胶即超分子水凝。

7、胶（Supramolecular hydrogel），它是由小分子在水中利用非共价键作用通过自组装形成具有网状的超分子结构，以此束缚水分子形成半固体状的水凝胶。非共价键作用也称弱化学键作用，它们是分子组装的驱动力，包括氢键、离子键、-键、范德华力、疏水作用等作用力。在超分子水凝胶中，组装的小分子称为凝胶因子（Hydrogelator）。0003 水凝胶因子相比传统的高分子凝胶剂而言具有很多固有的优点。第一，水凝胶因子为研究分子在水溶液中的组装提供十分方便的体系；第二，不同于高分子凝胶剂的是，水凝胶因子一般都具有准确的构型和构象，这样为构建功能可预测的复杂水凝胶体系和得到满意的具有生物功能的规整。

8、纳米结构提供优良的平台；第三，由于超分子水凝胶是由水凝胶因子通过弱化学键作用锁合在一起，因此，由水凝胶因子组装而成的网状纳米结构比高分子凝胶剂具有更好的生物相容性和生物可降解性；第四，由于大多临床使用的药物都是小分子，所以，研究者完全有可能通过将药物小分子设计成凝胶因子（J. Am.Chem.Soc.2009,131,13576-13577），以此形成水凝胶达到“药物自缓释”的功效。这样就可以避免药物的包覆过程，具有疗效的药物，即凝胶因子，直接从水凝胶中缓慢释放出来，从而为药物缓释提供一个自缓释的平台。0004 鉴于水凝胶因子这些优良的性质，我们决定设计一些具有多种刺激响应性质的超分子水凝胶。。

9、0005 刺激响应超分子凝胶作为新的功能材料近年来在诸多领域拥有广泛的应用前景。这些领域包括传感器、促动器、形状记忆、药物传递、显示器等等。0006 基于9-芴甲氧羰基（Fmoc）的氨基酸或短肽水凝胶具备生物相容好、生物易降解、化学可修饰及廉价易制备等诸多优良性质，现已被广泛用于细胞培养、组织工程、药物缓释、生物医药等领域。以Fmoc短肽为凝胶因子的超分子水凝胶形成原理是，Fmoc提供-键，短肽提供氢键或部分-键，在水溶液中组装成网状纤维束缚水分子形成凝胶状物质。Fmoc-短肽水凝胶一般具有热响应和pH响应双重响应，但是，它们很难具有其它方面的刺激响应，如电化学响应，氧化还原响应，光响应等等。。

10、0007 基于二茂铁（Fc）的有机凝胶因子(Adv.Mater.2008,20,25082511)已多次被用来设计具有电化学及氧化还原响应的超分子有机凝胶。但是，由于有机凝胶分散介质是有说明书CN 103113419 A2/6页4机溶剂，所以大大限制了其应用。换言之，如果把基于二茂铁的凝胶因子设计成水凝胶，则其由于同时具备超分子水凝胶的特性，又具备多种刺激响应性质，将很大程度改善其在生物医药、药物缓释、细胞培养，生物传感等方面的应用。0008 由于Fmoc-短肽和二茂铁衍生物凝胶因子都具有自身的缺陷，结合Fmoc-短肽组装成超分子的原理，我们考虑将二茂铁-短肽（氨基酸）设计成水凝胶因子。其。

11、设计原理是，二茂铁具有芳香性，在组装过程中可以提供-堆积；短肽具有酰胺键（部分氨基酸具有-键），在组装过程中提供氢键或部分-堆积。协调二茂铁-短肽分子之间的非共价键，则其可以在水中组装成超分子水凝胶。0009 利用上述原理，我们成功设计出二茂铁-苯丙氨酸水凝胶因子。以此形成的水凝胶同时保存二茂铁的氧化还原活性，也具备氨基酸或短肽的生物活性。实验结果表明，该水凝胶有望在药物缓释、生物传感、响应材料等领域有很好的应用。发明内容0010 本发明的目的是提供一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及制备方法，该超分子水凝胶具有多重响应性质（温度可逆、pH可逆和氧化还原可逆），符合智能和功能性纳米材料的要求。。

12、0011 一种多响应超分子水凝胶因子，结构式为：0012 0013 一种多响应超分子水凝胶，由所述的水凝胶因子在PBS缓冲溶液中组装而成。0014 所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：0015 将摩尔比为1:1.2:1.2的二茂铁单甲酸(Fc-COOH)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)溶于无水二氯甲烷(DCM)，冰浴下缓慢滴加三乙胺(Et3N)至反应物pH为8.0到9.0之间；搅拌反应40分钟到1小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次；萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得暗红色化合物。

13、（1）；0016 将摩尔比为1:1.2的化合物（1）和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐（H-Phe-OMeHCl）溶于无水二氯甲烷，然后逐滴加入三乙胺至反应物pH为8.0到9.0之间，常温下搅拌反应10小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次；萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得黄色化合物（2）；0017 将化合物（2）溶于40mL甲醇（MeOH），逐滴加入1M NaOH20mL(VMeOH:VNaOH=2:1)，常温下搅拌反应2小时；薄层层析点板跟踪反应；待反应完毕，用盐酸中和成中性，旋转蒸发除去甲醇；随后加入二氯甲烷100mL，依次用5%HCl和蒸馏。

14、水各萃取一次，萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥；得黄色化合物（3），即二茂铁苯丙氨酸（Fc-Phe-OH）；说明书CN 103113419 A3/6页50018 取950微升PBS加入到洗净吹干的螺口瓶内，水浴加热到70，向PBS溶液逐滴加入50微升质量比为0.5%的黄色化合物（3）的二甲基亚砜（DMSO）溶液，边加变摇动，直到形成澄清的Fc-Phe-OH溶液；放置于室温下自然冷却，10分钟后，即形成澄清水凝胶。0019 或者还可以将步骤得到的Fc-Phe-OH用二甲基亚砜配制成100mg/mL的储备溶液；取50微升储备溶液于干净的螺口瓶，快速加入950微升PBS，超声3秒，水凝胶即可形成。

15、。0020 本发明使用的水凝胶因子为二茂铁苯丙氨酸（Fc-Phe-OH）。其结构式为如下：0021 0022 Fc-Phe-OH的合成路线如下：0023 0024 本发明合成的凝胶因子的结构经ESI-MS和1H-NMR表征确证。具体数据如下：0025 EI-MS(Negative ion mode)calculated for Fc-Phe-OH(C20H19FeNO3):377.07;Found:375.89M-H-.1H NMR(CDCl3),=7.325（2H,d,J6Hz,CH,Phe）,7.281(3H,m,CH,Phe),6.223(1H,d,J6.7Hz,NH,Phe),4.95。

16、0(1H,d,J7.2Hz,-CH,Phe),4.613(1H,s,-CH,Cp),4.585(1H,s,-CH ,Cp),4.310(2H,s,-CH,Cp),4.061(5H,s,Cp),3.250(1H,d,J7.0Hz,-CH,Phe).0026 本发明的水凝胶在人体生理pH（7.4）环境下具有最好的成凝胶性质。即，在pH大于或小于7.4时，该水凝胶的形成都会受到影响。当pH大于7.4时，凝胶不能形成，把pH说明书CN 103113419 A4/6页6调回7.4时，澄清的水凝胶迅速形成；当pH小于7.4时，为浑浊溶液或浑浊水凝胶，把pH调回7.4时，澄清的水凝胶迅速形成。由于二茂铁。

17、具有良好的生物活性（如抗肿瘤、抗菌性，跨膜性等等）和电化学活性，因此以二茂铁修饰的氨基酸或短肽在pH为7.4的PBS中形成的水凝胶在药物缓释、生物传感、细胞培养、组织工程、生物医药等领域有广泛的应用前景。0027 本发明首次发现利用二茂铁修饰苯丙氨酸，通过二茂铁和苯丙氨酸的芳香堆积以及氢键自组装形成超分子水凝胶。至此克服了二茂铁修饰物只能得到超分子有机凝胶的困难。该超分子水凝胶具有多重响应性质（温度可逆、pH可逆和氧化还原可逆），符合智能和功能性纳米材料的要求。0028 本发明使用的凝胶因子Fc-Phe-OH能以较低浓度和pH为7.4的PBS溶液形成半透明的水凝胶（如图1）。该水凝胶具体制备方。

18、法如下：0029 将Fc-Phe-OH用二甲基亚砜配制成100mg/mL的储备溶液。取50微升储备溶液于干净的螺口瓶，快速加入950微升PBS，超声数秒，水凝胶即可形成。0030 需要指出的是，本发明方法形成的水凝胶为半透明状。原因是Fc-Phe-OH分子在PBS中自组装的速度过快（只需数秒钟），因此，采用以PBS直接稀释储备溶液的方法时，难免出现加入不均匀的情况。加入不均匀导致自组装不均匀，即有的地方聚集浓度过高，而有的地方聚集浓度过低，聚集浓度高的地方即出现半透明或不透明状。0031 考虑到该超分子水凝胶具有热可逆性质，即加热到一定温度可使凝胶转变成溶胶，而降低到室温时溶胶随即转变为凝胶。。

19、因此，利用其热可逆可以排除PBS加入不均匀的情况，以此可以制成澄清透明的水凝胶。该澄清透明水凝胶的另一种制备方法为：0032 取950微升PBS加入到洗净吹干的螺口瓶内，水浴加热到70，向PBS溶液逐滴加入50微升质量比为0.5%的Fc-Phe-OH的二甲基亚砜（DMSO）溶液，边加变摇动，直到形成澄清的Fc-Phe-OH溶液；放置于室温下自然冷却，10分钟后，即形成澄清水凝胶。0033 有益效果0034 (1)本发明扩大基于有机金属超分子水凝胶的范围，尝试并成功制备基于二茂铁芳香性的氨基酸的多响应超分子水凝胶。即首次提出利用二茂铁和芳香性氨基酸（苯丙氨酸）通过芳香堆积和氢键协同作用，自组装形。

20、成三维网状纤维，以此束缚水分子形成超分子水凝胶。0035 (2)本发明制备的超分子水凝胶具有温度可逆、pH可逆、氧化还原可逆等多种响应性质，符合智能材料的要求。0036 (3)本发明制备的超分子水凝胶在人体生理pH（7.4）环境下具有最好的成凝胶性质。鉴于苯丙氨酸具备良好的生物相容性，二茂铁具有良好的抗肿瘤抗炎症等特性，该二茂铁-苯丙氨酸超分子水凝胶有望于在组织工程或生物体内有良好的应用。0037 (4)本发明制备的超分子水凝胶可以包覆罗丹明、亚甲基蓝等等染料或药物分子，其成凝胶性质不受这些药物分子的影响，因此有望应用于药物缓释领域。0038 (5)本发明制备的超分子水凝胶的微观显微结构为直径。

21、约80-110nm的纤维，纤维上大量存在二茂铁基团。而二茂铁本身为氧化还原活性探针，并且水凝胶不受外加物的影响。该水凝胶纤维可以和羧基化碳纳米管共组装形成杂化水凝胶纳米材料。该杂化纳米材料可以用于修饰电极制备，从而应用于电化学生物传感器领域。0039 (6)本发明制备的超分子水凝胶在高浓度氯化钠溶液中依然可以形成，即，离子强说明书CN 103113419 A5/6页7度对其成凝胶性质影响不大。因此，该水凝胶为耐盐性水凝胶。0040 (7)本发明制备的超分子水凝胶制备简单，凝胶因子可大量廉价合成。因此，在以上的应用中，该水凝胶为非常合适的选择。附图说明0041 图1为Fc-Phe-OH超分子。

22、水凝胶的扫描电镜显微图(左列)、原子力显微图（中列）和透射电镜显微图（右列）；0042 图2为Fc-Phe-OH超分子水凝胶的多响应数码照片，即为氧化还原、剪切力、pH、温度的可逆相转变照片；0043 图3为Fc-Phe-OH超分子水凝胶包覆罗丹明、亚甲基蓝的数码照片及其模拟药物缓释释放曲线；0044 图4为Fc-Phe-OH超分子水凝胶与羧基化碳纳米管共组装形成超分子纳米纤维/碳纳米管杂合水凝胶的照片及其SEM图；0045 图5为自组装Fc-Phe-OH超分子水凝胶纳米纤维包覆葡萄糖氧化酶用于生物传感器平台的电化学循环伏安图；0046 图6Fc-Phe-OH在含1molL-1NaCl的PBS。

23、溶液中形成稳定水凝胶的照片及其纳米纤维束缚NaCl与Na2HPO4/NaH2PO4结晶的SEM图；0047 图7为从头计算揭示Fc-Phe-OH超分子水凝胶自组装机理的分子模拟图；0048 图8为自组装Fc-Phe-OH超分子水凝胶的紫外(a)、圆二色谱(b)和组装示意图(c)。具体实施方式0049 下面列举具体实施例对本发明进行详细描述，但不限于这些实例。0050 实施例10051 称取1.84克Fc-COOH(8mM)，溶于250ml无水二氯甲烷，冰浴下加入1.20克HOBt和3.36克HBTU(各8.8mM)。缓慢滴加三乙胺约6mL。冰浴下搅拌反应40分钟到1小时。薄层层析（TLC）点板。

24、跟踪反应。待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次。萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得暗红色化合物（1）2.60克。0052 称取化合物（1）1.6克，溶于50mL无水二氯甲烷，加入H-Phe-OMeHCl0.86克。然后逐滴加入三乙胺2mL，常温下反应约10小时。TLC点板跟踪反应。待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次。萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得黄色化合物（2）1.13克。0053 将得到的1.13克黄色化合物（2）溶于25mL甲醇，逐滴加入12mL1M NaOH，常温下搅拌反应2小时。TLC点板跟踪反应。待反应完毕，用盐酸中和成中。

25、性，旋蒸除去甲醇。随后加入二氯甲烷，依次用5%HCl和蒸馏水各萃取一次，萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得黄色化合物（3）0.87克。0054 将黄色化合物（3）即Fc-Phe-OH用二甲基亚砜配制成100mg/mL的储备溶液。取50微升储备溶液于干净的螺口瓶，快速加入950微升PBS，超声3秒，水凝胶即可形成。0055 实施例2说明书CN 103113419 A6/6页80056 将摩尔比为1:1.2:1.2的Fc-COOH、HOBt和HBTU溶于无水二氯甲烷，冰浴下缓慢滴加三乙胺至pH8.0-9.0。搅拌反应40分钟到1小时。薄层层析（TLC）点板跟踪反应。待反应完毕，依次用饱和Na。

26、CO3、5%HCl和蒸馏水各萃取一次。萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得暗红色化合物（1）。0057 将摩尔比为1:1.2的化合物（1）和H-Phe-OMeHCl溶于无水二氯甲烷，然后逐滴加入三乙胺至pH8.0-9.0，常温下搅拌反应约10小时。TLC点板跟踪反应。待反应完毕，依次用饱和NaCO3、5%HCl和水各萃取一次。萃取液浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得黄色化合物（2）。0058 将化合物（2）溶于40ml甲醇，逐滴加入1MNaOH20ml，常温下搅拌反应2小时。TLC点板跟踪反应。待反应完毕，用盐酸中和成中性，旋蒸除去甲醇。随后加入二氯甲烷，依次用5%HCl和蒸馏水各萃取一次，萃取液。

27、浓缩，柱层析纯化，真空干燥。得黄色化合物（3）。0059 取950微升PBS加入到洗净吹干的螺口瓶内，水浴加热到70，向PBS溶液逐滴加入50微升质量比为0.5%的Fc-Phe-OH的二甲基亚砜（DMSO）溶液，边加变摇动，直到形成澄清的Fc-Phe-OH溶液；放置于室温下自然冷却，10分钟后，即形成澄清水凝胶。0060 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。说明书CN 103113419 A1/4页9图1图2说明书附图CN 103113419 A2/4页10图3图4说明书附图CN 103113419 A10。

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