血管内皮生长因子质粒-脂质体复合体及其用途 【技术领域】
本发明属生物医药生物技术领域，具体涉及一种血管内皮生长因子(VEGF)质粒-脂质体复合体及其在制备药物组合物中的用途。
背景技术：
脑中风是人类三大致死性疾病，第一大致残性原因。因此，寻求有效的促进中风后损伤脑的修复的药物是神经科学和药理学家的共同目标。
神经元缺血损伤后的病理机制比较复杂，因此，研究治疗的角度颇具有不同。包括影响神经递质传递，抗氧化损伤，抗细胞凋亡，或采用生长因子的外源性治疗等方面的研究。
血管内皮生长因子(VEGF)来源于血管内皮细胞。近年来研究证明，其也存在于神经元，并具有快速调节神经细胞的钾离子通道，促进蛋白磷酸化，拮抗神经元的缺氧损伤等功能。据报道，整体脑缺血动物实验表明，脑内VEGF诱导表达增加，外源性VEGF蛋白具有抗缺血损伤的作用。用腺相关病毒-VEGF(AAV-VEGF)转染缺血脑内高表达VEGF，也具有抗动物脑的缺血损伤作用。但是由于蛋白质在体内的快速代谢问题，外源性注射VEGF必需采用长时间的灌注，极易造成全身性的或脑内的局部感染。而采用AAV-VEGF转染，虽然解决了长期灌注带来的感染问题，但是，对于病毒所介导地细胞毒性作用或诱导机体对病毒的免疫排异反应仍然是一个不容忽视的问题。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种VEGF质粒-脂质体复合体。
本发明的另一目的是提供VEGF质粒-脂质体复合体在制备药物组合物中的用途，具体涉及VEGF质粒-脂质体复合体在制备缺血损伤脑内的脑保护和促进成年脑神经干细胞的分化和神经元再生药物组合物中的用途。
本发明在前期工作的基础上，应用VEGF与脂质体混合形成复合体，在动物局部脑缺血的模型上研究证实，该质粒脂质体复合体在脑内高表达VEGF，仅需一次注射，在不需要长期灌注，又没有病毒感染情况下，具有脑保护和促进成年脑神经干细胞的分化和神经元再生的生物效应。
本发明通过以下方法和步骤实现，
1 构建质粒-VEGF-DNA；
2 质粒DNA和脂质体复合物的脑内注射和表达；
3 VEGF质粒-脂质体复合体注射对缺血损伤脑的保护效应实验；
4 VEGF质粒-脂质体复合体注射后促进成年损伤脑的皮层、纹状体神经元再生和脑功能修复实验血管内皮生长因子。
【具体实施方式】
实施例1 制备VEGF质粒-脂质体复合体，及其脑内注射实验和表达鉴定
1.制备VEGF质粒-脂质体复合体
按常规方法将VEGF-EGFP-N1质粒与脂质体混合形成复合体，VEGF为人VEGF165 DNA(基因库序号：AB021221)全长序列，插入pEGFP-N1质粒的启动子pCMV和EGFP序列之间。脂质体采用LipofectAMINETM 2000或DOTAP。所述质粒载体和脂质体均来购于德国的罗氏公司。所述脂质体和质粒的混合比率为：质粒DNAlug-10ug，脂质体为2ul-20ul。
2.制备局部脑缺血实验动物模型和脑内VEGF质粒-脂质体复合体注射
清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠，体重220-250克。大鼠随机分为VEGF质粒注射组和对照质粒注射组。局部脑缺血模型采用大鼠大脑中动脉线栓(MCAO)模型。暂时性MCAO模型依据Longa所述方法进行。血流阻断30分钟后再灌注。缺血后不同时间侧脑室内注射质粒-脂质体复合体。参照大鼠脑立体定位图谱(A-0.8，L1.4，H4.0)，脂质体-质粒复合物缓慢注入侧脑室中。注射量为：2ul10ul。
在缺血再灌注3天，1周和2周时，大鼠左心室接受生理盐水和4％多聚甲醛灌注后，取其全脑，进行冰冻冠状切片，厚度为30μm，进行质粒转染脑内目的蛋白表达情况检测。
3.目的蛋白EGFP免疫组织化学染色
缺血再灌注的脑片经常规固定后，用鼠单克隆抗EGFP抗体(1∶200)进行常规免疫组织化学染色，免疫阳性信号用DAB(5mg/10ml)显色。
4.检测转染质粒表达蛋白细胞类型
采用EGFP和MAP-2、GFAP、F-VIII免疫组织化学双标记鉴别转染质粒表达蛋白细胞类型。脑片先与鼠单克隆抗EGFP抗体(1∶200)孵育、Vector Blue显色染色后，再与多克隆兔抗MAP-2(1∶200)、多克隆兔抗GFAP(1∶200)或单克隆鼠抗F VIII(1∶200)孵育、DAB染色，柠檬油透明、柠檬油精封片并观察。
5.鉴定转染质粒表达蛋白免疫组织化学生物活性
缺血再灌注的脑片经常规固定后，用鼠单克隆抗EGFP抗体(1∶200)、鼠单克隆抗F-VIII抗体(1∶200)兔多克隆抗CRMP-4抗体(1∶300)、兔多克隆抗MAP-2抗体(1∶200)进行常规免疫组织化学染色，免疫阳性信号用DAB(5mg/10ml)显色。
结果表明，
(1)、质粒注射后，无论含VEGF与否，在脑内均具有较好的目的蛋白表达。检测报告基因产物EGFP蛋白可见，在缺血脑组织中，VEGF质粒组与对照质粒组均可见报告基因蛋白EGFP的表达，EGFP免疫反应阳性细胞位于侧脑室下区、额顶叶皮层和纹状体等部位。计数缺血再灌3天时同侧纹状体EGFP阳性细胞的数量，两组间无明显差异。VEGF质粒组为76.8±17.34％(n＝4)，对照质粒组为89.6±32.95％(n＝4)，两组差别P＜0.05。
(2)、用免疫组织化学双标记的方法鉴定目的蛋白表达的细胞定位发现，EGFP和成熟神经元的标记蛋白MAP-2、内皮细胞标记蛋白F-VIII共表达在同一细胞上，却不与星型神经胶质细胞的标记物GFAP双标。结果说明该质粒复合体注射后选择性地转染神经元和内皮细胞，并表达目的蛋白质。
(3)、VEGF具有促进血管内皮的增殖和血管增生的作用。实验观察到，VEGF质粒转染组与对照质粒组相比，纹状体内F-VIII标记的细胞明显增多，BrdU和F-VIII免疫组织化学双标记的细胞为新增值的血管内皮细胞。结果显示了对照质粒组双标记细胞为31.75±7.37/单侧纹状体，n＝6；VEGF质粒组为61.83±6.43/单侧纹状体，n＝5；(p＜0.05)。表明VEG质粒注射后可以明显增加缺血脑内血管内皮细胞的生成。同时表明该VEGF蛋白表达质粒应用后具有相应的生物学效应。
实施例2 检测VEGF质粒蛋白表达的脑保护作用
1.脑缺血后大鼠神经学评分、生理指标的检测
在缺血再灌注1-14天内，每天测定大鼠的神经功能。神经功能的评分依照Longa等的方法进行，功能评分指标分为六个等级。
2.制备冰冻组织切片
在缺血再灌注1-4周时，大鼠左心室接受生理盐水和4％多聚甲醛灌注后，取全脑，进行冰冻冠状切片，厚度为30μm，脑片存于-20℃保存。
3.检测脑梗塞体积
每隔240μm取一张脑片，行焦油紫染色以鉴定存活细胞。正常脑组织呈深蓝色，脑梗塞区域浅染。以1.25的CCD获取脑片图像信息，保存至计算机中。使用图像分析和软件处理系统(Q570IW，Leica，German)测量每张脑片的梗塞面积(S)，应用梯形公式V(μm3)＝1/2×(S1+S2+S2Sn-1+Sn-1+Sn)×240计算梗塞体积，通过计算V梗塞灶/V全脑体积以校正大鼠脑的个体差异及脑水肿造成的偏差。
采用功能核磁共振(fMRI)观察注射VEGF质粒对脑缺血后不同时间脑损伤程度的影响，包括脑水肿和脑梗死的体积变化值。
结果表明，
(1)、VEGF过表达能减轻脑中风大鼠神经元的损伤和体重下降，促进神经功能的恢复。实验表明在脑中VEGF蛋白表达呈时间依赖性。VEGF脑保护作用的时间窗研究显示，缺血后2小时内用VEGF质粒均可达到明显的脑保护效应，包括提高神经功能，降低体重的减轻，缩小脑梗塞的体积。用fMRI分析表明VEGF质粒脂质体复合物注射具有改善脑功能的影像学的变化，减轻脑水肿和的梗死体积(20.1±2.5mm3)，对照质粒组梗塞体积为(27.8±1.1mm3)。
(2)、VEGF过表达能减少脑中风后纹状体内神经元的丢失。应用MAP-2(成熟神经元的标志蛋白)免疫组织化学方法研究脑缺血后纹状体内神经元丢失的情况发现，VEGF质粒脂质体复合物可以使同侧纹状体内MAP-2阳性细胞的染色加深和数目增加(110.4±18.4/单侧纹状体)，与对照质粒组(53.3±7.2/单侧纹状体)相比具有显著增加。
实施例3 检测VEGF质粒蛋白表达的神经元再生作用
1.BrdU标记及其检测：
在脑缺血再灌注第0-12天，每天腹腔注射BrdU(30mg/kg体重)以标记脑内新增殖的细胞。用小鼠抗BrdU单克隆抗体结合免疫组织化学染色观察BrdU掺入细胞的情况。
2.BrdU和MAP-2、CRMP-4免疫组织化学双标记检测：
采用BrdU和MAP-2、CRMP-4免疫组织化学双标记检测神经元再生的情况。脑片与小鼠抗BrdU单克隆抗体(1∶100)孵育，Vector Blue显色，在与多克隆兔抗MAP-2(1∶200)、多克隆兔抗CRMP-4(1∶200)孵育，行DAB显色，柠檬油精封片，标记信号在光学显微镜下观察，进行双标记细胞的计数分析。
BrdU和MAP-2/CRMP-4、GAD-67荧光三色标记观察再生神经元的功能。脑片与兔多克隆抗MAP-2/CRMP-4抗体(1∶500)和小鼠抗BrdU单克隆抗体(1∶100)孵育过夜，用抗兔Ig G-Rhodamin(1∶20)和抗鼠IgG-FITC(1∶100)孵育揭示免疫阳性反应信号，脑片再与GAD抗体孵育，抗鼠IgG-Cys5揭示阳性信号。采用机关共聚焦显微镜观察并分析多标记荧光信号。
3.再生神经元的功能分析和观察：
(1)形态学观察：采用多标记的技术标记再生神经元是否能与GAD(GABA能神经元标记物)和ChAT(胆碱能神经元的标记物)。若再生神经元能与上述标记物共标记，提示该再生神经元已分化成为相应的神经递质的成熟神经元。
(2)电生理学观察：采用膜片钳技术纪录再生神经元的电生理特性。动物在缺血脑的脑室内注射Dil以标记神经前体细胞，手术4周和8周后，动物处死取脑片，选择Dil标记细胞进行电生理纪录，并同时用荧光标记电生理纪录过的细胞。为了鉴别该电生理纪录细胞是否为再生神经元，电生理纪录后，脑片再行BrdU标记。
(3)细胞记数及统计学分析
应用图象分析处理系统，计数纹状体内的标记阳性细胞数和背外测SVZ面积。所有数据以均数±标准误表示。应用SPSS 10.0进行统计学分析。研究VEGF质粒注射对脑梗塞体积、脑缺血后神经元和血管的再生情况及体重变化。应用Students t-test法比较两组间的数值是否存在统计学差异。研究VEGF质粒注射对脑缺血后神经功能评分的影响时，应用两样本等级和检验(Mann and Whitney法)比较各组间的数值差异是否存在统计学意义。P＜0.05被认为差别有统计学意义。
结果证实，VEGF质粒脂质体复合物能促进中风脑内神经元的再生。
(1)、VEGF质粒脂质体复合物注射能促进侧脑室下区(SVZ)的神经元再生。
用缺血侧与缺血对侧背外SVZ面积的比值观察SVZ的神经元再生情况，给VEGF质粒脂质体复合物可以明显增加SVZ的细胞增殖，表现为BrdU阳性细胞较对照质粒组明显增加。VEGF质粒脂质体复合物组SVZ区新生的幼稚神经元(BrdU+/CRMP-4+)为16.67±3.15/单侧纹状体和新生的成熟神经元(BrdU+/MAP-2+)为36.16±11.09/单侧纹状体，EGFP质粒组分别为：25.75±12.45/单侧纹状体和9.5±2.43/单侧纹状体，(p＜0.05)。
(2)、VEGF质粒脂质体复合物注射能促进纹状体的神经元再生和成熟。
进一步实验显示，脑缺血后纹状体的BrdU阳性细胞明显增多，缺血后再灌2w、3w和4w时，给VEGF质粒脂质体复合物组BrdU+/CRMP-4+细胞数均明显高于对照组。在再灌3w时，成熟的新生神经细胞(BrdU+/MAP-2+)的细胞数明显增加(55.3+2.2/单侧纹状体)，对照组为(15.3+2.3/单侧纹状体)，两组差异显著。结果证实，VEGF质粒脂质体复合物能促进纹状体新生神经元的成熟。
(3)、VEGF质粒脂质体复合物注射能促进再生成熟神经元分化为具有神经递质功能的纹状体局部神经元。
γ-氨基丁酸(GABA)和乙酰胆碱(Ach)能神经元是脑内纹状体主要的局部神经元，参与运动功能的调节。本发明证实，VEGF质粒复合物注射后，增加纹状体新生的成熟神经元具有GAD(29.3±3.3/单侧纹状体)或ChAT(12.4±1.0/单侧纹状体)阳性表达，而对照质粒注射组分别仅为(10.3±2.9/单侧纹状体)和8.5±0.7/单侧纹状体)。电生理实验表明，新生的GABA和Ach能神经元具有相应的功能性电活动特性，这些新生的GABA和Ach能神经元还具有突触后受体的生物反应。表明VEGF质粒脂质体复合物可以促进纹状体新生的成熟神经元分化成有功能的GABA能和胆碱能神经元。