一种治疗颈椎病的中药组合物及其制备方法和质量控制方法 【发明领域】
本发明涉及一种中药组合物，特别涉及用于治疗颈椎病的中药组合物，同时涉及该组合物的制备方法和质量控制方法。
背景技术
颈椎病是常见病、多发病，且是疑难病。其病理基础椎间盘的退行性变而引发的一系列病理改变(如：椎节失稳、松动、髓核突出或脱出，骨刺形成，韧带肥厚和继发的椎骨狭窄等)刺激或压迫邻近的神经根脊髓以及椎动脉颈部交感神经等组织；再加上一些诱发因素(如：慢性劳损、急性外伤、发育性推理狭窄以及脊柱的先天畸形和生理曲度改变等)而引起脊髓神经根的水肿，瘀血渗出等炎性反应，并逐渐纤维化甚至变性，产生以疼痛、麻木为主的临床症状。如果脊髓受压，则产生一侧或双侧椎体来症状，如果累及椎动脉则引起椎动脉痉挛和血管狭窄，出理颅内供血不足的症状。中医没有统一的病因诊断分型标准。一般认为是外伤、风寒、湿邪侵袭、气血不和、经络不通、肝肾虚损等所致。将其分为：风寒湿痹型、气滞血瘀型、痰湿臃阻型、肝肾不足型等。治疗手段西医以手术、牵引为主，中医多以外用膏药，手法、推拿按摩、针灸为主，虽有效果，但不理想。
【发明内容】
本发明的一个目的在于公开一种新的治疗颈椎病的中药组合物；本发明的另一个目的在于公开制备一种新的治疗颈椎病中药组合物的方法；本发明目的还在于公开一种新的中药组合物的质量控制方法。
本发明药物组合物由下述原料药组成，各原料药组份及配比如下(按重量份)：
黄 芪150-500重量份 葛根250-650重量份 桂枝100-300重量份
威灵仙150-600重量份 白芍50-350重量份 姜黄80-300重量份
川 芎60-300重量份 菊花80-250重量份。
本发明药物组合物各原料药组份及配比优选如下(按重量份)：
黄 芪200-400重量份 葛根300-500重量份 桂枝140-180重量份
威灵仙200-400重量份 白芍100-140重量份 姜黄120-180重量份
川 芎120-180重量份 菊花100-140重量份。
本发明药物还可加入常规地药物赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。
本药物组合物的制备方法：
取处方量桂枝、姜黄、川芎粉碎成粗粉，再加入菊花采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，水溶液过滤，药渣及滤液待用；黄芪、葛根、威灵仙、白芍，与上述药渣合并，加生药4-6倍量水煎煮1-3次，每次1-3小时，水煎液与上述滤液合并，浓缩至40-60℃下相对密度为1.05-1.07，加90-96％乙醇溶液使含醇量达50-70％，冷藏放置20-26小时，过滤，回收乙醇至无醇味，并浓缩至40-60℃下相对密度为1.05-1.06；将挥发油与药液混合，最后经过常规工序直接或加入药学上可接受的赋型剂制成临床可接受的剂型；优选口服液。
按药剂学方法，可以将本发明药物组合物制备成多种临床药物剂型，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。
本组合物制成药剂的质量控制方法包括鉴别和/或含量测定鉴别方法包括下列方法中的一种和/或几种：
1.取本组合物制剂水溶液20ml，相当于生药34g，用正丁醇萃取3次，每次20ml，合并萃取液，回收正丁醇至干，加4-6ml甲醇溶液溶解作为供试品；取葛根素对照品，配制成每毫升含葛根素1mg的甲醇溶液，作为标准品对照液，取葛根对照药材20g，加甲醇回流提取，浓缩至10ml作为药材对照溶液，照薄层色谱法试验，取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以3-5∶0.5-1.0的氯仿-甲醇为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯下检视，供试品与标准品和对照药材在色谱相应位置上显相同颜色荧光斑点；
2.取本组合物制剂水溶液20ml，相当于生药34g，用正丁醇萃取3次，合并萃取液，回收正丁醇至干，加4-6ml甲醇溶液溶解作为供试品；取芍药甙对照品，配制成每毫升含芍药甙1mg的甲醇溶液，作为对照液，取芍药对照药材20g，加甲醇回流提取，提取液浓缩至10ml作为药材对照溶液；照薄层色谱法试验，取供试品溶液、芍药甙对照溶液和药材对照溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以3-5∶0.5-1.0的氯仿一甲醇为展开剂展开，取出，晾干，喷以8-12％硫酸乙醇溶液，95-115℃加热4-7分钟，供试品与标准品和对照药材在色谱相应位，置上，显相同颜色斑点；
3.取本组合物制剂水溶液20ml，相当于生药34g，用乙醚萃取3次，合并萃取液，回收乙醚至干，加5ml氯仿溶液溶解作为供试品；取桂皮醛对照品，配制成每毫升含桂皮醛1mg的甲醇溶液，作为对照液，取桂枝对照药材20g，加乙醚回流提取，提取液浓缩至干，残渣加氯仿8-12ml溶解作为药材对照溶液；照薄层色谱法试验，取供试品溶液、桂皮醛对照溶液和药材对照溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以15-19∶2-5的石油醚一醋酸乙酯为展开剂展开，取出，晾干，喷以0.1-0.3％2，4-二硝基苯肼乙醇溶液，95-115℃加热4-6分钟，供试品与标准品和对照药材在色谱相应位置上，显相同颜色斑点；
4.取本组合物制剂水溶液20ml，相当于生药34g，用乙醚萃取3次，合并萃取液，回收乙醚至干，加5ml氯仿溶液溶解作为供试品；取川芎对照药材20g，加氯仿回流提取，提取液浓缩至10ml作为药材对照溶液；照薄层色谱法试验，取供试品溶液、川芎嗪标准对照液和标准药材对照溶液各2μl，分别，点于同一硅胶G薄层板上，以15-19∶2-5的石油醚-醋酸乙酯为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯下检视，供试品与对照药材在色谱相应位置上，显相同颜色荧光斑点；
5.取本组合物制剂水溶液5ml至10ml容量瓶中，以甲醇稀释刻度、摇匀，作为供试品溶液；另取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；另取川芎对照药材2g，加甲醇回流提取，提取液浓缩至5ml作为对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》1995年版一部符录VIB)试验，取供试品溶液、阿魏酸对照品溶液和对照药材溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5-8∶1-4的正己烷-醋酸乙酯为展开剂展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品色谱在与对照品和对照药材色谱相应位置上，显相同颜色荧光斑点。
含量测定：精密吸取本组合物制剂水溶液20ml，相当于生药34g，加水饱和正丁醇萃取四次，合并正丁醇萃取液，用氨水萃取3次，弃去氨液，回收正丁醇至干，残渣加水10ml溶解，放冷，通过大孔吸附树脂柱，用100ml水洗脱，弃去水液；再用30-50％乙醇洗脱，弃去乙醇洗脱液；继用60-80％乙醇洗脱，收集洗脱液蒸干，加甲醇溶解并移置2ml的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2μl、对照品溶液2μl与4μl，分别交叉，点于同一硅胶G薄层板上，以8-12℃以下放置过夜并以比例为12-15∶5-7∶1-3的氯仿-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开、取出、晾干、喷以8-12％硫酸乙醇溶液，在90-110℃烘约5-7分钟，至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层扫描法进行扫描，测试供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，按外标二点法计算，本品每10ml含黄芪甲式不得少于1mg。
本组合物在治疗颈椎病有很好的效果，可缓解疼痛，改善神经压迫所致肢体麻木、功能障碍的症状，应用本药还可促进受损神经功能的修复，本发明组合物制备方法先进，有效成份能得到充分释放，组合物制剂稳定，质量能得到有效控制。
下面实验例用于进一步说明本发明。下列材料与仪器适用于实验例1-3。
试验材料
1、药品：本组合物制剂(JZS口服液)每ml相当生药1.61g，试验用剂量以生药量计。颈复康冲剂，承德中药厂生产970438批。盐酸肾上腺素注射液，上海东丰制药公司，940801批。高分子右旋糖酐注射液，西安制药厂9510055批。盐酸罂粟碱注射液，沈阳第一制药厂900903批，卡马西平，上海黄河药业公司，951101批：
2、动物：小鼠昆明种，大耳白家兔，由山西省药检所动物室提供；大白鼠Wistar种，中国辐射防护研究院动物室提供。
实验例1 本组合物制剂的活血化瘀作用
1、对正常大鼠血液流变学的影响
大白鼠50只，体重250～300g，雌雄各半，随机分为对照、本药高、中，低剂量和颈复康冲剂等5组，每日灌胃给药1次，连续10日，末次给药后1小时，腹腔注射戊巴妥钠40mg/kg麻醉，腹主动脉取血4ml，加入肝素抗凝的试管中，用血液流变仪检测全血和血浆粘度、红细胞压积和血沉，结果显示本药高剂量可使全血与血浆粘度降低，红细胞压积明显减少(表1)
表1 对正常大鼠血液流变学的影响
组别 剂量 鼠数 全血粘度 血浆粘度 红细胞压积 血沉
(g/kg) 高切 低切 (％) (mm)
对照 10 6.79±0.68 11.48±2.05 1. 86±0.04 43.5±1.84 4.29±1.62
JZS 50 10 5.99±0.41*** 9.94±1.48*** 1.78±0.08** 3.99±2.68*** 3.15±1.54*
JZS 25 10 6.37±0.58* 10.89±1.14* 1.88±0.04* 40.1±4.01* 3.18±1.46*
JZS 12.5 10 6.52±0.60* 10.65±1.46* 1.96±0.03* 41.7±1.64* 3.36±1.51*
颈复康 25 10 6.17±0.68** 10.39±1.83* 1.82±0.05*** 39.6±2.27*** 3.05±1.49*
与对照组比较，***p＜0.01，**p＜0.05，*p＞0.05
2、对急性血瘀模型大鼠血流变的影响
大白鼠60只，250～300g，雌雄各半，随机分为对照，模型、本药高、中、低剂量和颈复康等6组。每日灌胃给药土次，连续10日。除正常对照组外，其余5组于第10日皮下注射盐酸肾上腺素0.08mg/100g体重，共2次，两次间隔4小时，首次注肾上腺素后2小时将大鼠浸入冰水内5分钟。其后与正常对照组都禁食。次晨采血，测血液流变性。从表2结果可见，本药高、中剂量可使血瘀症模型大鼠的全血与血浆粘度显著降低，红细胞压积减少，而且达到正常对照组的水平：
表2 对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响
剂量 全血粘度 红细胞压积 血沉
组别 血浆粘度
(g/kg) 高切 低切 (％) (mm)
对照 1.80±0.17*** 5.26±0.43*** 0.93±0.04*** 43.3±2.63*** 1.60±1.67***
模型 2.03±0.19 5.88±0.74 1.01±0.07 47.5±1.37 3.09±1.51
JZS 50 1.74±0.35*** 5.29±0.97*** 0.89±0.04*** 42.6±2.59*** 1.90±1.37*
JZS 25 1.87±0.13** 5.58±1.27** 0.94±0.03*** 43.2.79*** 2.20±1.48*
JZS 12.5 1.88±0.14* 5.79±0.44* 0.98±0.03* 45.1±32.4** 2.27±1.42*
颈复康 25 1.69±0.17*** 5.19±0.51*** 0.91±0.04*** 42.9±2.81*** 2.18±1.54*
n＝10，与模型组比较，***P＜0.01，**p＜0.05，*p＞0.05
3、对微循环障碍血瘀症模型的影响
小白鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机分为对照，本药高、中、低剂量和颈复康等5组。每日灌胃给药1次，连续10日。于末次给药后1小时，以20％乌拉坦溶液0.05ml/10g麻醉，尾静脉注入高分子右旋糖酐生理盐水液10ml/kg，造成微循环障碍的血瘀症模型、10分钟后观察动静口径和毛细血管开放数。结果可见本荮高、中剂量可使微循环的血管口径明显扩大，单位面积的毛细血管开放数增多(见表3)。
表3对小鼠微循环障碍模型的影响
剂量
微动脉口径 微静脉口径 毛细血管开放数
组别 鼠数
(g/kg) (μm) (μm) (个/mm2)
对照 10 11.25±1.70 17.0±1.26 4.38±0.92
JZS 50 10 13.80±0.89*** 20.57±1.72*** 5.57±1.27**
JZS 25 10 13.60±1.30*** 19.83±1.47*** 5.50±1.04**
JZS 12.5 10 11.87±0.97* 18.50±1.14* 4.80±0.83*
颈复康 25 10 13.67±0.82*** 20.0±1.87*** 6.20±1.09***
4、对麻醉兔颈内动脉血流量的影响
健康兔2～3kg，乌拉坦lg/kg i.v.麻醉后，分离双侧颈总动脉，右侧插管以TP-101T压力换能器连接多导生理记录仪(日本光电RN-6000型)测定收缩压(SAP)、舒张压(DAP)、平均动脉压(MAP)及心率(HR)。左侧颈总动脉及其分枝分离后，保留颈内动脉，结扎其余分枝；将电磁流量计(NPV-1200型)探头(1.5mm)钩干颈总动脉上，其流量即代表颈内动脉流量。腹正中剑突下切口，十二指肠插管以备给药。手术后稳定20分钟，静脉注射或十二指肠给药，记录上述指标。实验结束后剖取大脑称重，计算脑血流量及脑血管阻力指数。
从表4、5结果可见，耳静脉注射大剂量(32g/kg)可明显增加脑血流量，降低脑血管阻力，与用药前相比，差异具有显著性意义。作用高峰在1.V，后1～5分钟内，与罂粟碱(5mg/kg)一致，但不及罂粟碱强。十二指肠给药对颈内动脉血流量与脑血管阻力未见明显影响。
表4静注对麻醉兔颈内动脉血流量及血管阻力的影响 项 目 组别 药前 药后1min 5min 10min 20min 30min 60min脑血流量 对照 118±15 120±48 116±46 115±50 113±47 117±51 114±47 (3.5±13.9) (5.5±12.9) (1.2±8.0) (0.5±4.6) (-1.2±5.7) (2.5±5.4) JZS 115±24 114±26 114±25 115±16 132±23 135±30 130±32 16g/kg (-1.7±10.5) (-1.5±9.0) (-0.2±21.5) (16.7±23.1) (20±23.9) (14.3±21.9) JZS 111±24 113±25 104±25 121±33 120±23 134±27 127±24 332g/kg (2.2±6.9) (-0.5±9.9) (9.8±43.7) (8.8±25.7) (23.2±22.3)** (16±13.6) 194±70 187±32 罂粟碱 122±22 185±71 140±21 1.30±22 117±16 (71.2±77.4) (65±24.7) iv (62.3±53.7)** (13.7±53.2) (7.7±18.7) (-5.5±7.8) *** *** JZS 116±30 120±37 121±32 128±31 126±25 141±33 138±32 25g/kg (3.5±6.8) (4.3±3.2) (12.3±5.2) (10.8±7.8) (20.2±15.8)** (18.6±14.20)
表5对麻醉家兔脑阻力指数影响项目 组别 药前 药后1min 5min 10min 20min 30min 60min脑血管阻力指数 对照 1.04± 0.93±0.11 1.08±0.43 1.01±0.37 1.05±0.44 1.05±0.47 1.06±0.52 0.45 (-0.04±0.13) (-0.02±0.14) (-0.04±0.1) (0.01±0.07) (0.01±0.05) (0.02±0.14) JZS 0.96± 0.74±0.2 0.77±026 0.81±0.29 0.84±0.28 0.93±0.26 0.91±0.24 16g/kg 0.32 (-0.23±0.18) (-0.19±0.22) (-0.16±0.19) (-0.12±0.13) (-0.04±0.14) (-0.05±0.15) JZS 1.0± 0.85±0 18 0.96±0.31 1.04±0.39 0.67±0.09 0.74±0.15 0.79±0.18 332g/kg 0.34 (-0.15±0.18) (-0.04±0.06) (0.03±0.08) (-0.34±0.31)** (-0.25±0.21)** (-0.22±0.19)** 0.50±0.16 0.53±0.1 0.67±0.11 罂粟碱 0.89± 0.77±0.07 0.81±0.09 0.88±0.10 (-0.41± (-0.37± (-0.22± 0.11 (-0.13±0.13) (-0.09±0.12) (-0.02±0.07) 0.26)*** 0.13)*** 0.18)** 0.64±0.38 JZS 0.75± 0.70±0.25 0.75±0.27 0.68±0.54 0.57±0.17 0.61±0.38 (-0.06± 25g/kg 0.60 (-0.06±0.14) (-0.13±0.08) (-0.09±0.13) (-0.24±0.12)** (0.17±0.17)** 0.14)
n＝6括号内为变化％＝[1-(药后值/药前值)]×100％
实验例2本组合物制剂的镇痛作用
1、小鼠热板法
取体重18～22g，雌性小鼠50只，随机分成JZS高、中，低剂量、阿司匹林和对照等5组，每组10只。每日灌胃给药1次，连续7日。于末给药后1和2小时，分别置于55±1℃的金属板上，测其舔后足的痛反应时间。结果可见高、中剂量均可显著延长对热刺激的反应时，提高痛阈值(见表6)。
表6 对小鼠热板法反应时的影响
剂量
痛反应时(秒)
组别 鼠数
(G/kg) 1h 2h
对照 10 19.4±4.0 20.1±4.7
JZS 50 10 27.6±6.6*** 28.2±6.0***
JZS 25 10 23.9±5.2** 24.6±5.3**
JZS 12.5 10 22.1±8.0* 23.0±8.3*
阿司匹林 0.2 10 34.2±9.4*** 30.4±12.7***
与对照组比较，***P＜0.01，**P＜0.05，*P＞0.05
2、小鼠扭体法
小白鼠50只，随机分为以上5组，每日灌胃给药1次，连续7日。末次给药后30分钟，给每鼠腹腔注射0.6％乙酸水溶液0.1ml/10g，立即观察每鼠15分钟内产生扭体反应的次数。从表7结果看出，本药高剂量具有明显减少扭体反应的作用。
表7对小鼠醋酸扭体反应的影响
组别 剂量(g/kg) 鼠数 扭体次数
对照 10 47.8±13.5
JZS 50 10 28.5±12.8***
JZS 25 10 37.4±10.0*
JZS 12.5 10 39.6±12.3*
阿司匹林 0.2 10 9.4±6.0***
与对照组比较，***P＜0.01，*P＞0.05
实验例3 本组合物制剂的神经功能恢复
雄性大白鼠60只，体重250～300g，乙醚麻醉，腹位固定，分离左侧坐骨神经，在胫神经与腓总神经的分叉上约5mm处，用止血钳将坐骨神经长约2mm钳压1分钟(钳压强度：钳子的第2段)。钳压后立即缝合皮肤，每天肌注青霉素G钠3万u/只，连续3日。假损伤组则仅暴露坐骨神经而不钳压。钳压大鼠随机分为模型、本药高、中、低剂量和卡马西平等5组。每日灌胃给药1次，连续14日。第15日观察以下指标：
A、趾间距离：测定两后肢第至趾与第5趾的距离及第2趾与第4趾的距离，连测3次，取平均值。以健侧为100％，计算患侧相应趾间距离的百分比。
B、患肢运动功能：由正常(0级)、轻(-1、-2……)至重(……-8、-9)度损伤，共分10级。
C、肌肉重量：处死大鼠，分离后肢的比目鱼肌、腓肠肌及小腿其他肌群分别称湿重。以健侧为100％，计算患侧相应肌肉的重量百分比。
结果可见，模型组趾间距离明显缩小，给药组则显著增大，但未达正常(假手术组)，给药组患肢运动功能的受损明显较轻(表8)，比目鱼肌的重量亦有增加(表9)。
表8 对坐骨神经损伤大鼠运动功能的影响
组别 剂量
趾间距离(％) 运动功能级数
g/kg 第1～5趾 第2～4趾
假手术 102.1±5.2*** 103.2±8.1*** 0.00±0.00***
模型 66.6±8.3 71.54±7.6 -4.6±0.7
JZS 50 88.6±7.7*** 84.5±9.5*** -2.6±1.0***
JZS 25 85.7±7.6*** 80.4±5.2*** -3.0±0.9***
JZS 12.5 80.1±14.0** 79.7±10.8* -3.2±1.3***
卡马西平 1 92.4±6.8*** 84.9±8.0*** -2.1±1.1**
n＝10
表9对坐骨神经损伤大鼠肌肉重量的影响
剂量
肌肉重量(％)
组别
g/kg 比目鱼肌 腓肠肌 其它肌群
假手术 94.6±12.8*** 96.3±6.5*** 100.3±5.0***
模型 40.2±8.7 58.4±10.7 51.1±10.8
JZS 50 59.1±11.7*** 52.6±7.9 61.8±10.3**
JZS 25 46.0±13.8 53.1±8.7 58.7±9.9
JZS 12.5 58.8±14.8*** 57.4±9.4 55.8±19.6
卡马西平 1 51.4±15.4 64.2±7.9 69.1±16.0***
综上实验例可以说明：本药对正常、尤其是血瘀模型大鼠的全血和血浆粘度均可明显降低，红细胞压积减小，因此使血流阻力下降。对麻醉兔的静注给药亦呈现脑血管阻力降低，脑血流量增加。高分子右旋糖酐所致小鼠微循环障碍的血瘀模型，本品亦使微动静脉扩张，毛细血管开放数增多，这些试验均说明本药有明显的活血化瘀作用。对小鼠热与化学刺激所致疼痛模型本品有显著的提高痛阈和减少扭体反应次数作用，表明可缓解疼痛。通过大鼠坐骨神经损伤试验，可间接说明人体颈椎病时颈部神经压迫所致肢体麻木、功能障碍的症状，应用本药可能促进受损神经功能的修复。
实验例4 本发明组合物口服液制备工艺研究
(1)提油时间考察：桂枝、姜黄、川芎、菊花中所含的挥发油的比重均小于1，可共同蒸馏出来，蒸馏时间对油的收率影响很大，应予筛选。取处方量的生药，除菊花外，均粉碎成粗粉，加10倍生药量的水，浸泡1小时后，提取挥发油，观察不同时间内挥发油的提取量，结果见表10。
表10 挥发油提取时间考察 时间(小时) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 提取量(mL) 0.70 1.00 1.20 1.35 1.55 1.60 1.65 1.65 1.70 1.70 占总量(％) 41 59 71 79 88 94 97 97 100 100
由表中可见，加热1小时内出油最快，6小时已达94％，10小时提出的挥发油量最大，但耗工耗能，因此确定提油时间为6小时。
(2)煎煮条件的考察
将提油后的药渣与黄芪、葛根、威灵仙、白芍合并煎煮，对煎煮条件进行筛选。加水量(A)、提取时间(B)和提取次数(C)是影响煎煮效果的主要因素，因此有必要对这几个因素进行实验考察，每个因素设立3个水平，以确定最佳方案。
(3)乙醇沉淀浓度的考察
由于水煎煮法提取有效成分的同时也提出不少淀粉、粘液质、蛋白质、树脂、鞣质等杂质，这些成分若不除去，一方面影响口服液的澄清度，另一方面影响疗效，故采用乙醇沉淀法除去杂质，醇沉浓度将直接影响除去杂质的效果和有效成分的损失率，因此有必要对醇沉的浓度进行考察。中药水提醇沉浓度一般在含醇量60％～80％，因为60％的浓度淀粉、多糖、蛋白质才能发生沉淀，80％以上极性较大的甙类成分也会发生沉淀，为了不使有效成分损失，又能除去杂质，所以醇沉浓度的三水平定为60、70、80％。
(4)表头设计
从煎煮条件和醇沉浓度4个因素考虑，按4个因素，每个因素3水平，用L(34)正交表进行正交实验，设计表头见表11。本试验采用1/5处方量进行正交实验，以主要有效成分黄芪甲甙的含量和正丁醇萃取物的量为考察指标筛选最佳工艺，结果见下表12。
表11 因素、水平的设计
表12工艺研究正交试验结果(L9(34)) 试号 A B C D 黄芪甲甙含量 (mg/20mL)正丁醇萃取物 (g) 1 1 1 1 1 0.84 15.6 2 1 2 2 2 1.98 21.2 3 1 3 3 3 2.26 22.9 4 2 1 2 3 1.74 19.4 5 2 2 3 1 2.03 22.3 6 2 3 1 2 1.92 20.9 7 3 1 3 2 2.00 21.1 8 3 2 1 3 2.12 22.3 9 3 3 2 1 2.66 25.9 I K1 5.08 4.58 4.82 5.53 K2 5.69 6.12 6.38 5.90 K3 6.78 6.84 6.30 6.12 R×3 1.70 2.26 1.56 0.59 II K1 59.7 56.1 58.8 63.8 K2 62.6 65.8 66.5 63.2 K3 69.3 69.7 66.3 64.6 R×3 9.6 13.6 7.7 1.4
(5)正交试验结果分析
以黄芪甲甙为考察指标的正交试验结果分析：
直观分析：从表12可以看出，提取时间是影响黄芪甲甙含量的最主要因素，其次是加水量和提取次数。为了能有效地提取出黄芪甲甙及其它有效成分，同时又考虑节约能源、时间和人力，我们选择最佳工艺为A3B2C2D0。
方差分析：
CT＝(∑y)2/N＝308.0025/9
Si＝(K1i2+K2i2+K3i2)/n-CT
SA＝4.4502 SB＝7.6467 SC＝2.8779 SD＝0.5334
因SD明显小于SA、SB、SC，因此将SD作为误差项Se
计算得：FA＝8.3431，P＜0.1Δ；FB＝14.3358，P＜0.05*；FC＝5.3954，P＜0.1Δ
因此，因素B起显著作用，因素A和C起一定显著作用。选择B2有95％以上的把握，选择A3和C2有90％以上的把握，而D不起显著作用，选择任何水平，对黄芪甲甙提取率都没有明显的影响。
以正丁醇萃取物为考察指标的正交试验结果分析：
直观分析：从表12可以看出，提取时间是影响正丁醇萃取物量的最主要因素，其次是加水量和提取次数。为了能有效地提取出处方中各药味的有效成分，同时又考虑节约能源、时间和人力，选择最佳工艺为A3B2C2D0。
方差分析：
CT＝(∑y)2/N＝36710.56/9
Si＝(K1i2+K2i2+K3i2)/n-CT
SA＝145.46 SB＝294.26 SC＝115.58 SD＝2.96
因SD明显小于SA、SB、SC，因此将SD作为误差项Se
计算得：FA＝49.1419，P＜0.01**；FB＝99.4122，P＜0.01*；FC＝39.0473，P＜0.01**
因此，因素A、B、C均起非常显著作用。选择A3、B2、C2有99％以上的把握，而D不起显著作用，选择任何水平，对正丁醇萃取物的提取率都没有明显的影响。
综上所述，最佳工艺为A3B2C2D0。结合乙醇用量、回收溶剂等因素，选择最佳工艺为A3B2C2D1。为了进一步确定工艺的稳定性，我们按最佳工艺，进行了补充试验，其黄芪甲甙的含量为3.65mg/20mL，正丁醇萃取物的量达到26.3g，均优于正交设计中的各组，说明该试验是合理的。
(6)增溶剂用量考察
处方中桂枝等四味药提取的挥发油难溶于水，选用吐温-80作为增溶剂，并对其用量进行考察。取吐温-80适量、10％浓缩药液，与挥发油混合制成乳剂后，再加入其余药液，并加水稀释至1000ml。考察结果见下表5。
表13 吐温-80添加量考察吐温-80添加量(％) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 澄明度 混浊 混浊 澄清 澄清 混浊
实验结果表明吐温-80用量在药液量的1.5％～2％为好，考虑降低成本和尽量减少吐温-80的用量，因此吐温-80用量选择1.5％。
(7)工艺稳定性考察
制剂处方(以口服液1000ml计)
挥发油 1.6ml
浓缩药液 680g
吐温-80 15ml
我们用同一批原料(以50倍处方量投料)，按所选工艺，连续生产了三批中试产品，结果黄芪甲甙的平均含量为1.84mg/10ml，说明优化组合的工艺均优于正交试验中的9组结果，且所选工艺基本稳定，见表6。
表6 三批中试产品的生产数据 批号 投料量 kg 挥发油 ml 浓缩液 kg 吐温-80用量 ml 口服液 ml澄明度相对密度 pH黄芪甲甙含量 (mg/10mL) 970205 85 81.6 33.7 750 50000 澄清 1.05 6.5 1.86 970206 85 82.3 34.1 750 50000 澄清 1.04 6.4 1.78 970207 85 81.2 33.9 750 50000 澄清 1.05 6.5 1.89
下列实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1
黄芪300g 葛根400g 桂枝160g 威灵仙300 白芍120g
姜黄150g 川芎150g 菊花120g 吐温-80适量。
本药物组合物的制备口服液的方法：
取处方量桂枝、姜黄、川芎、菊花粉碎成粗粉，过10目筛，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，水溶液过滤，药渣及滤液待用；黄芪、葛根、威灵仙、白芍过10目筛，与上述药渣合并，加生药5倍量水煎煮2次，每次2小时，水煎液与上述滤液合并，浓缩至50℃下相对密度为1.05-1.07，加95％乙醇溶液使含醇量达60％，冷藏放置24，小时，过滤，回收乙醇至无醇味，并浓缩至50℃下相对密度为1.05-1.06；将挥发油与约10％量的药液加1.5％药液量的吐温-80先制成乳剂，再与药液混合，加水至1000毫升，即得。本发明药物组合物制成口服液每10ml，相当于原药材17g。一次二支，一日三次。
实施例2
黄芪290g 葛根390g 桂枝150g 威灵仙290g 白芍130g
姜黄160g 川芎160g 菊花130g
本药物组合物制备制备成软胶囊的方法：取处方量桂枝、姜黄、川芎、菊花粉碎成粗粉，过10目筛，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，水溶液过滤，药渣及滤液待用；黄芪、葛根、威灵仙、白芍过10目筛，与上述药渣合并，加生药5倍量水煎煮2次，每次2小时，水煎液与上述滤液合并，浓缩至50℃下相对密度为1.05-1.07，加95％乙醇溶液使含醇量达60％，冷藏放置24，小时，过滤，回收乙醇至无醇味，并浓缩至50℃下相对密度为1.05-1.06；将挥发油与药液混合，浓缩减压于燥至含水量在5.0％以下，经常规工序制成软胶囊1000粒，即得组合物的软胶囊，每粒装0.25g，相当于原药材1.7g，一日三次，一次2粒。
实施例3 本组合物制成口服液的质量控制方法：
鉴别：a.取本组合物制剂口服液20ml，用正丁醇萃取3次，每次20ml，合并萃取液，回收正丁醇至干，加5ml甲醇溶液溶解作为供试品；取葛根素对照品，配制成每毫升含葛根素1mg的甲醇溶液，作为标准品对照液，取葛根对照药材20g，加甲醇回流提取，浓缩至10ml作为药材对照溶液，照薄层色谱法试验，取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以4∶1的氯仿--甲醇为展开剂展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品与标准品和对照药材在色谱相应位置上显相同颜色荧光斑点；
b.取本组合物制剂口服液20ml，用正丁醇萃取3次，每次20ml，合并萃取液，回收正丁醇至干，加5ml甲醇溶液溶解作为供试品；取芍药甙对照品，配制成每毫升含芍药甙1mg的甲醇溶液，作为对照液，取芍药对照药材20g，加甲醇回流提取，提取液浓缩至10ml作为药材对照溶液；照薄层色谱法试验，取供试品溶液、芍药甙对照溶液和药材对照溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以4∶1的氯仿一甲醇为展开剂展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热5分钟，供试品与标准品和对照药材在色谱相应位，置上，显相同颜色斑点；
c.取本组合物制剂水溶液5ml至10ml容量瓶中，以甲醇稀释刻度、摇匀，作为供试品溶液；另取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；另取川芎对照药材2g，加甲醇回流提取，提取液浓缩至5ml作为对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》1995年版一部符录VIB)试验，取供试品溶液、阿魏酸对照品溶液和对照药材溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7∶3的正己烷-醋酸乙酯为展开剂展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品色谱在与对照品和对照药材色谱相应位置上，显相同颜色荧光斑点；
含量测定：精密吸取样品20ml，加水饱和正丁醇萃取四次，每次60mL，40mL，40mL，40mL，合并正丁醇萃取液，用氨水萃取3次，每次40ml，弃去氨液，回收正丁醇至干，残渣加水10ml溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱，其内径2-3cm，长20cm，用100ml水洗脱，弃去水液；再用40％乙醇150ml洗脱，弃去40％乙醇洗脱液；继用70％乙醇150ml洗脱，收集洗脱液蒸干，加甲醇溶解并移置2ml的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2μl、对照品溶液2μl与4μl，分别交叉，点于同一硅胶G薄层板上，以10℃以下放置过夜并以比例为13∶6∶2的氯仿-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开、取出、晾干、喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃烘约5-7分钟，至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层扫描法进行扫描，波长：λs＝530nm，λR＝700nm，测试供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，按外柝二点法计算，本品每10ml含黄芪甲式不得少于1mg；
实施例4 本组合物制成口服液的质量控制方法：
鉴别：a.取本组合物制剂口服液20ml，用乙醚萃取3次，每次20ml，合并萃取液，回收乙醚至干，加5ml仿溶液溶解作为供试品；取桂皮醛对照品，配制成每毫升含桂皮醛1mg的甲醇溶液，作为对照液，取桂枝对照药材20g，加乙醚回流提取，提取液浓缩至干，残渣加氯仿10ml溶解作为药材对照溶液；照薄层色谱法试验，取供试品溶液、桂皮醛对照溶液和药材对照溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以17∶3的石油醚一醋酸乙酯为展开剂展开，取出，晾干，喷以0.2％2，4-二硝基苯肼乙醇溶液，105℃加热5分钟，供试品与标准品和对照药材在色谱相应位置上，显相同颜色斑点；
b.取川芎对照药材20g，加氯仿回流提取，提取液浓缩至10ml作为药材对照溶液；照薄层色谱法试验，取鉴别3项下的供试品溶液、川芎嗪标准对照液和标准药材对照溶液各2μl，分别，点于同一硅胶G薄层板上，以17∶3的石油醚-醋酸乙酯为展开剂展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品与对照药材在色谱相应位置上，显相同颜色荧光斑点；
含量测定：精密吸取样品20ml，加水饱和正丁醇萃取四次，每次60mL，40mL，40mL，40mL，合并正丁醇萃取液，用氨水萃取3次，每次40ml，弃去氨液，回收正丁醇至干，残渣加水10ml溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱，其内径2-3cm，长20cm，用100ml水洗脱，弃去水液；再用40％乙醇150ml洗脱，弃去40％乙醇洗脱液；继用70％乙醇150ml洗脱，收集洗脱液蒸干，加甲醇溶解并移置2ml的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2μl、对照品溶液2μl与4μl，分别交叉，点于同一硅胶G薄层板上，以10℃以下放置过夜并以比例为13∶6∶2的氯仿-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开、取出、晾干、喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃烘约5-7分钟，至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层扫描法进行扫描，波长：λs＝530nm，λR＝700nm，测试供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，按外柝二点法计算，本品每10ml含黄芪甲式不得少于1mg；
实施例5 本组合物制成口服液的质量控制方法：
鉴别：a.取本组合物制剂口服液20ml，用乙醚萃取3次，每次20ml，合并萃取液，回收乙醚至干，加5ml仿溶液溶解作为供试品；取桂皮醛对照品，配制成每毫升含桂皮醛1mg的甲醇溶液，作为对照液，取桂枝对照药材20g，加乙醚回流提取，提取液浓缩至干，残渣加氯仿10ml溶解作为药材对照溶液；照薄层色谱法试验，取供试品溶液、桂皮醛对照溶液和药材对照溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以17∶3的石油醚—醋酸乙酯为展开剂展开，取出，晾干，喷以0.2％2，4-二硝基苯肼乙醇溶液，105℃加热5分钟，供试品与标准品和对照药材在色谱相应位置上，显相同颜色斑点；
b.取本组合物制剂口服液20ml，用正丁醇萃取3次，每次20ml，合并萃取液，回收正丁醇至干，加5ml甲醇溶液溶解作为供试品；取芍药甙对照品，配制成每毫升含芍药甙1mg的甲醇溶液，作为对照液，取芍药对照药材20g，加甲醇回流提取，提取液浓缩至10ml作为药材对照溶液；照薄层色谱法试验，取供试品溶液、芍药甙对照溶液和药材对照溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以4∶1的滤仿一甲醇为展开剂展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热5分钟，供试品与标准品和对照药材在色谱相应位，置上，显相同颜色斑点；
c.取本组合物制剂口服液5ml至10ml容量瓶中，以甲醇稀释刻度、摇匀，作为供试品溶液。另取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；另取川芎对照药材2g，加甲醇回流提取，提取液浓缩至5ml作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》1995年版一部符录VIB)试验，取供试品溶液、阿魏酸对照品溶液和对照药材溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷—醋酸乙酯(7∶3)为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯下(365nm)检视，供试品色谱在与对照品和对照药材色谱相应位置上，显相同颜色荧光斑点。
含量测定：精密吸取样品20ml，加水饱和正丁醇萃取四次，每次60mL，40mL，40mL，40mL，合并正丁醇萃取液，用氨水萃取3次，每次40ml，弃去氨液，回收正丁醇至干，残渣加水10ml溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱，其内径2-3cm，长20cm，用100ml水洗脱，弃去水液；再用40％乙醇150ml洗脱，弃去40％7醇洗脱液；继用70％乙醇150ml洗脱，收集洗脱液蒸干，加甲醇溶解并移置2ml的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2μl、对照品溶液2μl与4μl，分别交叉，点于同一硅胶G薄层板上，以10℃以下放置过夜并以比例为13∶6∶2的氯仿-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开、取出、晾干、喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃烘约5-7分钟，至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层扫描法进行扫描，波长：λs＝530nm，λR＝700nm，测试供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，按外柝二点法计算，本品每10ml含黄芪甲式不得少于1mg。
实施例6
黄芪300g 葛根400g 桂枝160g 威灵仙300g
白芍120g 姜黄150g 川芎150g 菊 花120g
取处方量桂枝、姜黄、川芎粉碎成粗粉(过10目筛)，置提取罐中，加入菊花，再加10倍生药量水，水蒸气蒸馏提取挥发油6小时，收集挥发油和水提液备用。取处方量黄芪、葛根、威灵仙、白芍粉碎成粗粉(过10目筛)，与提油后的药渣合并，加5倍生药量的水煎煮提取2次，每次2小时，水煎液与提油后的药液合并，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，放置至室温后，加95％乙醇使含醇量达60％，冷藏静置24小时，倾出上清液，沉淀离心滤过，合并上清液与滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(50℃)。将挥发油、约10％量的浓缩药液及1.5％药液量的吐温-80先搅拌制成乳剂，再与其余浓缩药液混合，加水至1000毫升，灌装，每瓶10ml，灭菌，即得。
实施例7
黄芪430g 葛根530g 桂枝260g 威灵仙400g
白芍300g 姜黄200g 川芎250g 菊花220g
取处方量桂枝、姜黄、川芎粉碎成粗粉(过10目筛)，置提取罐中，加入菊花，再加10倍生药量水，水蒸气蒸馏提取挥发油6小时，收集挥发油和水提液备用。取处方量黄芪、葛根、威灵仙、白芍粉碎成粗粉(过10目筛)，与提油后的药渣合并，加5倍生药量的水煎煮提取2次，每次2小时，水煎液与提油后的药液合并，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，放置至室温后，加95％乙醇使含醇量达60％，冷藏静置24小时，倾出上清液，沉淀离心滤过，合并上清液与滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(50℃)。将挥发油、约10％量的浓缩药液及1.5％药液量的吐温-80先搅拌制成乳剂，再与其余浓缩药液混合，加水至1000毫升，灌装，每瓶l0ml，灭菌，即得。