提高生育力的组合物 本发明涉及提高动物，尤其是雌性动物，通常是人生育力的活性物质和组合物。
DP-IV抑制剂
二肽基肽酶IV(DP-IV，也称为二肽基氨基肽酶IV，DPP-IV，DAP-IV，EC3.4.14.5)是一种丝氨酸肽酶，它裂解肽和蛋白质的氨基末端二肽。它识别其中N-末端序列是X-Pro或X-Ala的底物。DP-IV抑制剂被认为是用于治疗炎性疾病和AIDS的治疗剂。已知的DP-IV抑制剂通常都是底物的类似物。DP-IV抑制剂的实例公开于DD 296075 A5(Neubert等人，1991年11月)、WO 91/16339(Bachovchin等人，1991年10月)、WO 93/08259(Bachovchin等人，1993年4月)、WO 95/15309(Jenkins等人，1995年6月)、WO 98/19998(Villhauer，1998年5月)、WO 99/46272(Scharpe等人，1999年9月)和WO 99/61431(Demuth等人，1999年12月)。WO 99/67278和WO 99/67279(均为Demuth等人，1999年12月)中还记载了某些这类抑制剂的前药。
下表列出了常见类型的DP-IV抑制剂化合物和其具体实例，它们在本发明的应用中是优选的；表中还给出了公开较宽范围的此类化合物的专利文献号并画出了化合物实例的结构。应该强调的是，所引用的DD和WO说明书中公开的所有DP-IV抑制剂均可用于本发明，参考文献是指这些先有说明书中关于通式和相关的更具体的结构式以及单个化合物的全部信息。例如，按照所示文献的教导，下表中所示地吡咯烷和噻唑烷环可被许多不同环大小的其它杂环替换和/或所示氨基-酰基部分可被多种其它的结构部分替换，从而得到可用于本发明的其它DP-IV抑制剂。
多囊性卵巢综合症
多囊性卵巢综合症(PCOS，Stein-Leventhal综合症)是一种以卵巢被膜增厚和多滤泡性囊肿形成为特征的病症。它导致不育症和闭经。循环激素水平失调：黄体生成素(LH)和类固醇的水平升高，而卵泡刺激素(FSH)水平下降。虽然认为这是下丘脑中促性腺激素释放激素(GnRH)异常分泌的结果，但PCOS的生理缺陷仍然是值得考虑的原因。采用控制LH和FSH水平的治疗方案可成功助孕，但这类方案较为复杂和昂贵。我们现在发现DP-IV抑制剂在PCOS的治疗中表现出实用性。
第一方面，本发明是一种治疗不育症的药物组合物，该组合物的特征在于含有DP-IV抑制剂。第二方面，本发明是一种DP-IV抑制剂的新用途，即在治疗不育症，尤其是在由于PCOS所致的妇女不育症中的用途。第三方面，本发明是一种改进的协助PCOS患者怀孕的方案，其中给所述患者施用含DP-IV抑制剂的组合物。
与目前有关GnRH激动剂以及FSH和LH的治疗方案相比，以这种方式使用DP-IV抑制剂具有许多优点。LH和FSH是从天然资源(一般是经绝后妇女的尿)分离的或者用重组细胞培养制备的大分子肽。人们注意到，从尿中分离需承担疾病传播的风险，同时还存在抗原性蛋白污染物。重组激素不易传播人类病原体，但仍有可能被抗原性蛋白污染，并且比尿蛋白更昂贵。此外，重组肽通常不是完全“人化”的糖基化类型，这可能导致抗原性并使效力降低。GnRH激动剂一般为十肽，它需多步合成。相反，DP-IV抑制剂是很容易采用标准合成方法获得的小分子。它们是非抗原性的，易于纯化并且便宜。
DP-IV抑制剂的另一个优点是，在许多情况下，口服给药后仍具有生物活性。这与GnRH激动剂、FSH和LH不同，后三者都必须通过注射给药。因此，使用DP-IV抑制剂是侵入性较小的方案，患者不太会紧张。
本发明的药物组合物对于妇女不育症的治疗特别有效。所述不育症优选与多囊性卵巢综合症有关。该组合物的特征在于它包含DP-IV抑制剂。该组合物也可包括，例如本领域通常已知的可药用赋形剂，如稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、分散剂和稳定剂等。
在本发明的上下文中，如果一种化合物在1μM浓度下抑制DP-IV的作用，则被认为是该酶的抑制剂。这类化合物优选在低于100nM浓度下抑制DP-IV的作用，同时在低于1μM浓度下不抑制其它酶。下表列出了常见类型的DP-IV抑制剂化合物和其具体实例，它们在本发明的应用中是优选的；表中还给出了公开较宽范围的此类化合物的专利文献号并画出了化合物实例的结构。应该强调的是，在所引用的DD和WO说明书中公开的所有DP-IV抑制剂均可用于本发明，参考文献是指这些先有说明书中关于通式和相关的更具体的结构式以及单个化合物的全部信息。例如，按照所示文献的教导，下表中所示的吡咯烷和噻唑烷环可被许多不同环大小的其它杂环替换和/或所示氨基-酰基部分可被多种其它的结构部分替换，从而得到可用于本发明的其它DP-IV抑制剂。
在本发明的一个优选方案中，DP-IV抑制剂是氨基-酰基吡咯烷腈。特别优选的是WO 95/15309和WO 98/19998中公开的那些氨基-酰基吡咯烷腈。
本发明的组合物可配制成通过任何已知的途径给药于人类患者的形式：包括口服给药、经粘膜给药(如颊、舌下、鼻内、阴道和直肠给药)、透皮给药或者注射(包括静脉内、肌肉内和皮下注射)。优选的给药途径是口服给药。在口服给药的情况下，组合物适于配制成片剂或胶囊。
本发明提供了已知是DP-IV抑制剂的化合物的一种新用途，该用途是作为治疗不育症，尤其是由于多囊性卵巢综合症导致的妇女不育症的治疗剂。
本发明包括一种改进的治疗不育症，尤其是由于PCOS导致的妇女不育症的方法，其中给所述患者施用含有治疗有效量的DP-IV抑制剂的药物组合物。该治疗包括单独使用所述组合物或者将该组合物与如前所述的其它治疗剂联合使用。给药可以是单剂量给药，或者以一定的时间间隔，如2-6小时分次给药。治疗过程可持续一天或者数天或数周，直至达到适宜的临床终点。适宜终点的实例包括妊娠(在未助孕情况下)和成功捕获未受精的成熟卵子或成功植入胚胎(在助孕情况下)。具体的给药方案和治疗时间应由主管医师决定。
实施例
实施例1.抑制剂的制备
DP-IV抑制剂可按照文献描述的方法制备。氨基-酰基吡咯烷腈类的合成记载于WO 95/15309和WO 98/19998中。下列方法是这些方法的说明。
实施例1A-合成(2S)-N-异亮氨酰吡咯烷-2-甲腈
(a)叔丁氧羰基-异亮氨酰脯氨酰胺
向搅拌下的脯氨酰胺盐酸盐(225mg，1.50mmol)在无水二氯甲烷(15ml)中的悬浮液中加入二异丙基乙基胺，得到透明的碱性(pH9)溶液。一次性地加入N-(叔丁氧羰基-异亮氨酰氧基)琥珀酰亚胺(328mg，1.0mmol)，并在氮气氛下、在室温下将该混合物搅拌16小时。真空蒸发溶剂并将残余物分配到乙酸乙酯和0.3N硫酸氢钾溶液中。有机层用饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并真空浓缩。残余物经硅胶短柱滤过，用己烷/乙酸乙酯(10∶90)，然后是乙酸乙酯洗脱纯化。将含产物的洗脱液浓缩，得到无色泡沫玻璃体状的标题化合物：301mg(92％)。 1H NMR(CDCl3)：δ6.90(1H，br.s)；5.51(1H，br.s)；5.18(1H，d，J＝9.6Hz)；4.62 (1H，dd，J＝2.6 & 7.0Hz)；4.29(1H，dd，J＝8.4 & 9.2Hz)；3.79-3.58(2H，m)；2.36(1H， m)；2.09-1.57(5H，m)；1.43(9H，s)；1.17(1H，m)；0.95(3H，d，J＝6.6Hz)；0.90(3H，t， J＝7.3Hz)ppm.
(b)(2S)-N-(叔丁氧羰基-异亮氨酰)吡咯烷-2-甲腈
在氮气氛下，向搅拌下的步骤(a)的酰胺(203mg，0.62mmol)在无水吡啶(10ml)中的溶液中加入咪唑(84mg，1.24mmol)。使该混合物冷却到-35℃，然后滴加三氯氧化磷(0.25ml，2.48mmol)。将该混合物搅拌1小时，期间使温度升高到-20℃，然后真空蒸发溶剂。残余物经硅胶色谱纯化，得到无色油状的标题化合物；产率：180mg(94％)。1H NMR(CDCl3)：δ5.14(1H，d，J＝9.2Hz)；4.80(1H，dd，J＝2.6 & 7.1Hz)；4.22(1H，dd，J＝7.9 & 9.1Hz)；3.81(1H，m)；3.71(1H，m)；2.30-2.12(4H，m)；1.75(1H，m)；1.60(1H，m)；1.42(9H，s)；1.19(1H，m)；0.97(3H，d，J＝6.9Hz)；0.91(3H，t，J＝7.3Hz)ppm.13C NMR(CDCl3)：δ171.7；155.6；118.0；79.6；56.0；46.5；46.0；37.8；29.6；28.1；25.0；24.2；15.2；10.9ppm.
(c)(2S)-N-(异亮氨酰)-吡咯烷-2-甲腈三氟乙酸盐
将步骤(b)的腈溶于三氟乙酸并将该溶液在室温搅拌1小时。真空蒸发溶剂，残余物溶于水。将该溶液冻干，得到蓬松白色固体的标题化合物；产率：60mg。
FAB质谱：计算值：m/e 209.3；实测值：210.2(M+H)+1H NMR(D2O)：δ4.3(1H，m)；3.64(1H，d，J＝5.6Hz)；3.16(2H，m)；1.86-1.48(5H，m)；0.98(1H，m)；0.68(1H，m)；0.51(3H，d，J＝6.9Hz)；0.38(3H，t，J＝7.3Hz)ppm.13C NMR(D2O)：δ169.7；119.7；57.3；48.6；48.1；36.9；30.2；25.8；24.5；15.4；11.5ppm.
实施例1B-合成(2S)-N-((2’S)-2’-氨基-3’，3’-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-甲腈
按照实施例1A的方法，用相应的叔丁基甘氨酸衍生物代替异亮氨酸衍生物制备。1H NMR(CD3OD)：δ4.86-4.81(1H，m)；4.04(1H，s)；3.77-3.71(2H，m)；3.34(2H，s)；2.34-2.08(4H，m)；1.14(9H，s)ppm.13C NMR(CD3OD)：δ167.40，117.99，58.78，46.53，34.21，29.54，25.22，25.03ppm.
实施例2.人不育症的动物模型
Zucker Diabetic Fatty(ZDF)大鼠被认为是用于证明治疗剂对人类生育，尤其是因PCOS引起的不育症具有潜在功效的适宜模型。这些动物的激素水平随着它们变得肥胖而发生变化，这与人类的疾病相似，人类肥胖被认为与PCOS有关。
动物
将肥胖Zucker Diabetic Fatty大鼠以及可生育的瘦型的雄性和雌性大鼠分别装入笼中并喂以Purina 5008(6.5％脂肪)。在6.5周龄时，将肥胖大鼠随机分为3组：
1.对照组-肥胖ZDF大鼠(n＝8)，用载体治疗。
2.每日一次的治疗组-肥胖ZDF大鼠(n＝8)，每日一次经口给予实施例1B的化合物(10mg/kg/天)。
3.每日两次的治疗组-肥胖ZDF大鼠(n＝8)，每日两次经口给予实施例1B的化合物(10mg/kg/天)。
方法
在研究结束时，收集瘦型大鼠和肥胖大鼠的血液和脑垂体。通过放射免疫分析测定脑垂体LH和血浆睾酮浓度。通过观察阴道涂片估测动情周期。
2.1-脑垂体LH
肥胖大鼠的脑垂体比瘦型大鼠含有更多的LH(肥胖大鼠和瘦型大鼠分别为8.1±0.6μg/脑垂体和6.3±0.6μg/脑垂体；p＜0.05)。用实施例1B的化合物治疗的肥胖大鼠，其脑垂体LH含量恢复到瘦型大鼠的正常水平(对照大鼠和治疗的肥胖大鼠分别为8.1±0.6μg/脑垂体和5.2±0.4μg/脑垂体；p＜0.05)。
2.2-血浆睾酮
肥胖雄性大鼠的血浆睾酮水平低于瘦型雄性大鼠(肥胖大鼠和瘦型大鼠分别为1145±328ng/mL和2410±239ng/mL；p＜0.05)。用实施例1B的化合物治疗的肥胖大鼠，其血浆睾酮水平恢复到瘦型大鼠的正常水平(瘦型大鼠和治疗的肥胖大鼠分别为2410±239ng/mL和2392±759ng/mL，NS)。
2.3-周期
与瘦型大鼠相比，肥胖雌性大鼠具有异常的动情周期。用实施例1B的化合物进行治疗，使肥胖雌性大鼠的动情周期恢复了正常。
获得的结果表明DP-IV抑制剂可用于治疗雄性和雌性动物的不育症，尤其患PCOS者的不育症。
实施例3.药物制剂
3A-50mg片剂
如下制备含有相当于50mg实施例1A的化合物作为活性成分的片剂： 实施例1A的化合物 (三氟乙酸盐形式) 154.5g 玉米淀粉 53.5g 羟丙基纤维素 13.5g 羧甲基纤维素钙 11.0g 硬脂酸镁 2.0g 乳糖 165.5g 总计 400.0g
将原料混合后压片，得到2000片20mg的片剂，每片含相当于50mg游离碱形式的实施例1A化合物。
3B-100mg阴道栓剂
如下制备含有相当于100mg实施例1A的化合物作为活性成分的适于阴道给药的栓剂： 实施例1A的化合物 (三氟乙酸盐形式) 154.5g 玉米淀粉 210.0g 胶体二氧化硅 2.5g 聚维酮30 49.0g 硬脂酸镁 23.0g 己二酸 57.0g 碳酸氢钠 43.0g 月桂基硫酸钠 5.0g 乳糖 456.0g 总计 1000.0g
将原料混合后压成1000枚1g的胶囊，每枚含有相当于100mg游离碱形式的实施例1A化合物。
前面的实施例用于说明本文公开的发明，而不旨在限制。本领域专业技术人员认为是等同变化的这类扩大均包括在本发明的范围中，权利要求进一步限定了该范围。
对于特定目的的本发明组合物和方法，可使用一种或多种DP-IV抑制剂作为仅有的活性成分。