支链聚乙二醇-干扰素及其制法和用途 【发明领域】
本发明涉及用支链聚乙二醇(简称：支链PEG)对干扰素进行化学修饰的支链PEG-干扰素复合物，及其制法。
背景技术
各种天然和重组蛋白质具有治疗作用，一旦将他们纯化、分离并制备成药物，就可以将它们经非肠道途径进行给药，而用于不同的医疗适应症。然而，非肠道途径给药的蛋白质具有免疫原性，且血浆半衰期较短，因此，难以使药用蛋白质在患者体内达到有治疗作用的血药浓度。
通过将蛋白质与高分子聚合物结合成复合物，可以有效的克服这些难题。现已公认，聚乙二醇是对人体安全的高分子聚合物。Davis等在美国专利4,179,337中公开了将聚乙二醇(PEG)与蛋白质诸如酶和胰岛素结合以获得具有生理活性的复合物的技术方案。Veronese等(《实用生物化学和生物技术》(Applied Biochemand Biotech)11：141-152，1985)公开了用氯甲酸苯酯使聚乙二醇活化以修饰核糖核酸酶和超氧化物歧化酶的技术方案。Katre等在美国专利4,766,106和4,917,888中还公开了通过聚合物结合重组蛋白质使蛋白质增溶的技术方案。同样，可以将PEG和其他聚合物与重组蛋白质结合以便降低免疫原性并延长半衰期，(参见：Nitecki等，美国专利4,902,502，；Enzon，国际专利申请PCT/US 990/02133；Nishimur等，欧洲专利申请154,316和Tomasi，国际专利申请PCT/US85/02572)。众所周知，α干扰素可有效的治疗急性和慢性乙型肝炎，卡波西肉瘤，黑色素瘤等疾病，提高α干扰素的血浆半衰期可以提高对这些疾病的治疗作用。
以往公开的PEG-干扰素复合物存在几个问题，其一是PEG的结合使干扰素的生物活性降低，在使用中必须提高干扰素的剂量。另外，在形成PEG-干扰素时所用的某些连接键可能在体内水解断裂，使PEG-干扰素失去了由结合PEG带来的优点，据文献报道，目前PEG修饰的干扰素在小鼠体内的清除半衰期为2-3小时。
【发明内容】
支链PEG-干扰素是以共价键方式与支链PEG分子连接的干扰素分子。集成干扰素是通过测定天然干扰素分子的共有序列而确定的重组干扰素分子，又称复合干扰素(consensus IFN或IFN-con)。集成干扰素的突变体包括：第6位氨基酸突变为谷氨酸；第11为氨基酸突变为天冬氨酸；第162位氨基酸突变为丝氨酸；第165位氨基酸突变为丝氨酸以及上述4个突变位点地组合突变情况。
支链PEG是带有两条聚乙二醇长链结构的分子，由于聚合物是以带有链长分布的混合物的形式制备的，因此，通常不能得到有精确和单一分子量的聚合物，对其分子量的描述一般是指其平均分子量。这种聚合物的制备方法在本研究领域内是众所周知的。
本发明的技术方案如下：
一种支链聚乙二醇-干扰素，它是分子量为10000-40000的支链聚乙二醇修饰的干扰素，具有如下结构式：
式中，mPEG为聚乙二醇链，interferon为干扰素。
上述的支链聚乙二醇-干扰素中，干扰素可以是集成干扰素、干扰素α1b或干扰素α2b。
上述的支链聚乙二醇-干扰素的制法由下列步骤组成：
步骤1.将干扰素以5mM pH3.0～5.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为1～10mg/ml的溶液，
步骤2.按干扰素：PEG为1∶0.5～10的物质的量之比加入mPEG2-NHS，以氢氧化钠调节pH到7.0～9.0，在0～25℃条件下反应0.5～4小时，mPEG2-NHS有如下结构：
步骤3.加入1M甘氨酸终止反应，
步骤4.待3～5分钟后，加入10倍体积50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液。将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52)，以5倍体积pH＝4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，支链PEG-干扰素和未结合支链PEG的干扰素分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，用波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素的洗脱液，
步骤5.以Sephacryl S-200分子排阻色谱对PEG-干扰素进一步纯化，洗脱液为pH＝7.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)，用波长280nm紫外光吸收检测，收集含支链PEG-干扰素的洗脱液。
本发明的支链聚乙二醇-干扰素抗病毒活性高，在体内保留的时间长，可以应用于制备抗病毒的药物。
由于反应混合物中不同的产物具有不同的分子量及等电点，这些产物可用传统的分离方法如色谱法进行分离。尽管干扰素有多个自由氨基，可以通过控制试剂浓度和反应条件得到单支链PEG化的干扰素产物。
当将单一干扰素分子与单一支链PEG结合时，所得的复合物可以是位点异构物的混合物。“位点异构物的混合物”是指可以在干扰素分子的不同氨基酸位点连接的各种支链PEG-干扰素的混合物。例如：在本发明的一个实施方案中，支链PEG-干扰素混合物至少含有一种在干扰素分子的组氨酸残基上连接有支链PEG的支链PEG-干扰素复合物，同时含有支链PEG被连接在干扰素分子的另一个位点(如：赖氨酸残基)的支链PEG-干扰素复合物。
本发明的支链聚乙二醇-干扰素抗病毒活性高，血浆半衰期长，作为抗病毒药物效果更好，本发明的制备方法简单，由于支链聚乙二醇空间位阻大，容易控制生成单支链聚乙二醇-干扰素的产物。
【附图说明】
图1为实施例4的SDS-PAGE电泳检测的图谱，其中A条带：支链PEG(MW：40000)；B条带：支链PEG(40000)-IFNα2b混合物；C条带：支链PEG(10000)-IFNcon；D条带：支链PEG20000-IFNα1b；E条带：支链PEG(40000)-IFNα2b；F条带：IFNα2b；G条带：标准分子量蛋白。
图2为修饰后干扰素药代动力学研究(125I标记法)的步骤示意图。
【具体实施方式】
实施例1.支链PEG-集成干扰素的制备
将集成干扰素以5mM pH3.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为1mg/ml的溶液10ml。按干扰素：PEG为1∶0.5的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝10000，美国Shearwater公司提供，下同)，以氢氧化钠溶液调节pH到7.0，在0℃条件下反应4小时，加入1M甘氨酸0.5ml终止反应。3～5分钟后，加入10倍体积50mMpH＝4.5的醋酸钠缓冲液。将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，支链PEG-集成干扰素和未结合支链PEG的干扰素分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含支链PEG-集成干扰素的洗脱液。以SDS-PAGE检测。以Sephacryl S-200分子排阻色谱对支链PEG-集成干扰素进一步纯化，以pH7.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，用波长280nm紫外光吸收检测，收集含支链PEG-集成干扰素的洗脱液，以SDS-PAGE检测(见图1)。以波长280nm紫外光吸收法测定蛋白质含量，产物支链PEG-IFNcon为0.17mg。
实施例2.支链PEG-干扰素α1b的制备
将干扰素α1b以5mM pH4.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为5mg/ml的溶液10ml。按干扰素∶PEG为1∶5的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝20000)，以氢氧化钠溶液调节pH到8.0，在10℃条件下反应2小时，加入1M甘氨酸0.5ml终止反应。3～5分钟后，加入10倍体积50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液。将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，支链PEG-干扰素α1b和未结合PEG的干扰素α1b分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含支链PEG-干扰素α1b的洗脱液，以Sephacryl S-200分子排阻色谱对PEG-集成干扰素进一步纯化，以pH7.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含支链PEG-干扰素α1b的洗脱液，以SDS-PAGE检测(见图1)。以280nm紫外光吸收法测定蛋白质含量，产物支链PEG-IFNα1b为0.44mg。
实施例3.支链PEG-干扰素α2b
将干扰素α2b以5mM pH5.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为10mg/ml的溶液10ml。按干扰素∶PEG为1∶10的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝40000)，以氢氧化钠溶液调节pH到9.0，在25℃条件下反应0.5小时，加入1M甘氨酸0.5ml终止反应。3～5分钟后，加入10倍体积50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液。将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，支链PEG-干扰素α2b和未结合PEG的干扰素α2b分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素α2b的洗脱液，得支链PEG-干扰素α2b混合物，以SDS-PAGE电泳检测(见图1)。以Sephacryl S-200分子排阻色谱对支链PEG-干扰素α2b混合物进一步纯化，以pH7.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含支链PEG-干扰素α2b的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测(见图1)。以280nm紫外光吸收法测定蛋白质含量，产物支链PEG-IFNα2b为1.03mg。
实施例4.SDS-PAGE电泳法对产物的检测
将各洗脱峰适当浓缩，采用SDS-PAGE电泳检测，分离胶8％，浓缩胶5％。电泳完毕后，将胶体浸入固定液中(30％的乙醇、5％的乙酸)室温振摇浸泡4分钟；取出胶体，浸入染色剂中室温振摇浸泡40分钟(染色剂：0.05％考马斯亮蓝G-250、0.2M碘、30％乙醇、5％乙酸)；再将胶体转移入脱色剂(1％戊二醛、30％乙醇、5％乙酸)中室温振摇浸泡至标本条带清晰即可(见图1)。
实施例5：修饰后各组分的抗病毒活性测定
用Wish细胞(人羊膜传代细胞)-VSV病毒(滤泡性口腔炎病毒)系统测定各种干扰素的抗病毒活性。采用CPE(细胞致病效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每ml干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。以国际单位(IU)表示，并用国家IFNα标准品进行校正。结果见表1。
表1.干扰素及PEG干扰素复合物的抗病毒活性
样品 抗病毒活性(IU/mg)
IFNα2b 4.6×108
支链PEG-IFNα2b混合物 4.7×107
支链PEG-IFNα2b 3.6×107
IFNα1b 3.2×108
支链PEG-IFNα1b 2.9×107
IFNcon 1.8×109
支链PEG-IFNcon 1.3×108
实施例6修饰后干扰素药代动力学研究(125I标记法)
修饰后干扰素药代动力学研究(125I标记法)的步骤见图2，其结果见表2。
表2.125I-IFN和125I-PEG-IFN给小鼠静脉注射后的药动参数
样品 半衰期(hr)
IFNα2b 0.8～1.5
支链PEG-IFNα2b 6.4～8.2
IFNα1b 0.7～1.2
支链PEG-IFNα1b 8.6～11.9
IFNcon 0.5～1.9
支链PEG-IFNcon 10.8～38.6