一种注射用生脉冻干粉针剂极其制备方法 【技术领域】
本发明属中药制药技术领域，涉及一种治疗心血管疾病的药物制剂及其制备方法，具体地说是一种注射用生脉冻干粉针剂及其制备方法。
背景技术
生脉注射液来源于《内外伤辩惑论》，生脉散是由人参、麦冬、五味子三味中药组成的古方，具有益气、养阴、敛汗、复脉之功效，常用于出汗过多且临床辩证为气阴两虚的患者。现代药理证明其具有降低血小板聚集、增强心肌收缩力、提高心肌缺氧耐受力、扩张冠状动脉、抗心律失常以及抗病毒、抗炎和免疫调节等作用，临床广泛用于心肌梗死、心源性休克、冠心病、心肌炎等疾病的治疗。广州中医药大学王宗伟等进行了大鼠灌服生脉胶囊长毒实验，结论是“生脉胶囊各剂量长期给予大鼠没有产生明显毒性反应”。
源于生脉散的制剂包括注射剂、冲剂、袋泡剂、口服液、胶囊剂等，其制备工艺概括起来有两种：1.三味药共煎；2.三味药分别提取后混合。
中国发明专利CN1059820C在制备生脉散时采用群药共煎的方法，依据合煎液产生的有效成分5-HMF的量，优选麦冬与五味子的配伍比例及制备过程的煎煮时间和煎煮次数，结论是“……在前二次煎煮时提取完全。煎煮次数增加，5-HMF还有下降的趋势”，研究该专利提供的实验数据发现实验结果与结论相反，类似矛盾现象在中国发明专利CN1068777C中也存在，至少要考虑实验的可信度问题。
目前已有的生脉散注射剂——生脉注射液虽然在临床上对心血管系统疾病有良好的疗效，但是生产工艺采用三味药分别提取后混合，红参采用乙醇回流法提取，五味子采用水蒸气蒸馏后，再以水醇法对药渣进一步提取，麦冬采用水醇法提取，不仅工艺较为繁琐，而且违背了中药复方的原旨。另外，由于水剂剂型的限制而稳定性不佳，不利于保存，给临床用药安全性和有效性造成一定影响。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种稳定性好、质量高、疗效显著的注射用生脉冻干粉针制剂及其制备方法，应用该方法制得的生脉冻干粉针制剂对大鼠急性心肌缺血的保护作用优于现有的生脉注射剂。
本发明的一种注射用生脉冻干粉针剂是通过以下技术方案实现的：
人参1份 麦冬2-3份 五味子1-2份地重量份组方，
a.将五味子用8-10倍量60-80％乙醇回流提取2-3次，每次60-120min，回收乙醇至无醇味，浸膏在搅拌下加入乙醇，使含醇量达60-80％，充分搅拌后静置，滤过，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，得提取液A。
b.将用乙醇提取后的五味子药渣与上述配比的人参和麦冬加10-12倍量水合煎1-2次，每次60-120min。合并水提取液浓缩后，加入乙醇使含醇量达60-80％，进行两次醇沉，滤过，回收乙醇后用10-15倍量去离子水溶解，用大孔吸附树脂处理，先以去离子水洗至无糖，再以40～80％乙醇洗至无皂甙止，回收醇洗脱液，浓缩得提取液B。
c.将上述人参、麦冬、五味子水提醇沉后的沉淀加10-12倍量蒸馏水溶解，滤过；50～70℃真空干燥，得水提多糖粗品。将多糖粗品加100-200倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤(截留分子量6000～100000)，浓缩得提取液C。
d.将0.2％的吐温80溶解于适量的注射用水中，加入提取液A、B和C，搅匀、冷藏、滤过，调PH6.5-7，滤液加适量活性炭煮沸15min，稍冷，过滤至澄明，得溶液，灭菌后分装，冷冻干燥，压盖即得。
本发明的一种注射用生脉冻干粉针制剂及其制备方法的优选技术方案是：
人参1份 麦冬3份 五味子1.5份的重量配比方，
a.将五味子用8-10倍量65～75％乙醇回流提取2次，每次60-90min，回收乙醇至无醇味，浸膏在搅拌下加入乙醇，使含醇量达70-80％，充分搅拌后静置，滤过，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，得提取液A。
b.将用乙醇提取后的五味子药渣与上述配比的人参和麦冬加10～12倍量水合煎2次，第一次90min，第二次60min。合并水提取液浓缩后，加入乙醇使含醇量达70-80％，进行两次醇沉，滤过，回收乙醇后用10倍量去离子水溶解，大孔吸附树脂柱处理，先以去离子水洗至无糖，再以60～70％乙醇洗至无皂甙止，回收醇洗脱液，浓缩得提取液B。
c.将人参、麦冬、五味子水提醇沉后的沉淀加15倍量蒸馏水溶解，滤过；50～60℃真空干燥，得水提多糖粗品。将多糖粗品加200倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤(截留分子量6000～100000)，浓缩得提取液C。
d.将0.2％的吐温80溶解于适量的注射用水中，加入提取液A、B和C，搅匀、冷藏、滤过，调PH6.5-7，滤液加0.05％活性炭煮沸15min，稍冷，过滤至澄明，得溶液，补充注射用水至规定量，灭菌后分装，冷冻干燥，压盖即得。
本发明的一种注射用生脉冻干粉针制剂疏松多孔、复溶性好，含水量低，符合国家标准，临床上适用于心血管疾病的治疗。
其生产过程无菌操作，低温干燥，活性成分不被破坏，真空或惰性气体填充，不易发生氧化，贮存时间长，稳定性得以提高，从而延长了该药的有效期，便于贮存、运输和销售，也便于保证产品质量。
实验一：HPLC测定生脉冻干粉针剂中五味子甲乙素的含量
1仪器与试药日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪；日本岛津SPD-6A紫外检测器；五味子甲素、乙素对照品，中国生物制品检定所；生脉冻干粉针制剂，广东天之骄药物开发有限公司实验室提供。甲醇为色谱纯，Fisher公司；其余均为分析纯，水为超纯水。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：BeckmanC18反相色谱柱(4.6×25cm，5μm)；流动相：甲醇-水(85∶15)，流速：1.0ml/min，检测波长254nm；柱温：室温；五味子甲素对照品保留时间为10.00min；五味子乙素对照品保留时间为15.00min，定量方法：外标法。
2.2含量测定方法
2.2.1对照品溶液制备 精密称取五味子甲素、乙素对照品，分别加甲醇各配成150μg/ml的溶液。
2.2.2供试品溶液制备 取生脉冻干粉适量，精密称定，以乙醇溶解，使每1ml溶液相当于生药五味子0.15g，超声30min，过滤，定容至2ml。
2.2.3标准曲线的制作
精密吸取五味子甲、乙素对照品溶液1.0、2.5、5.0、10、15μl，分别进样，测定峰面积，得回归方程：五味子甲素：y＝1.7841×104C+1784，r＝0.9993；五味子乙素：y＝1.7695×104C-642，r＝0.9995，即五味子甲、乙素浓度在0.15～2.25μg/μl范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.2.4精密度试验 精密吸取供试品10μl，连续进样3次，五味子甲、乙素的RSD分别为2.2％、2.4％。
2.2.5回收率实验 于已测定五味子甲素、乙素含量的生脉冻干粉中精密称入一定量的五味子甲素、乙素对照品，按相同的方法处理并测定，五味子甲素、乙素的平均回收率分别为100.2％和100.6％，RSD分别为1.3％和1.7％。
2.3样品测定 吸取供试品10μl，进样，根据标准曲线计算含量，结果见表1。
表1样品中五味子甲、乙素含量的测定结果
测定批数
样品
1 2 3 4 5 X
五味子甲素
83 85 88 83 86 85
(mg·g-1)
五味子乙素
79 78 81 79 80 79.4
(mg·g-1)
实验二：硫酸-苯酚法测定生脉冻干粉针剂中多糖的含量
1仪器与试药日本岛津UV-265型紫外可见分光光度计；标准糖：D-葡萄糖，上海生物化学试剂公司；硫酸-苯酚试剂：溶解80g苯酚于20g水(双蒸水)中，置冰箱避光贮存。临用时，先配制成5％苯酚，再以1∶5分别加入5％苯酚和浓硫酸于样品中。
2方法与结果
2.1标准曲线的制作精密称取D-葡萄糖(105℃干燥至恒重)80mg，置100ml容量瓶中，加蒸馏水使溶解并稀释至刻度，摆匀。精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分别置于50ml容量瓶中，加水至刻度摇匀。精密吸取上述各种浓度溶液2ml，另精密吸取蒸馏水2ml作空白对照，置具塞试管中，分别加入5％苯酚溶液1.0ml摇匀，迅速加入浓硫酸5.0ml摇匀后放置5min，置沸水中加热15min，再置冷水中冷却30min，在波长490nm处测定吸光度，得回归方程A＝0.1642C-2.582×10-3(μg/ml)，r＝0.9993
2.2精密度试验精密吸取标准品溶液1ml，按以上硫酸-苯酚法操作，重复5次，RSD为3.1％。
2.3回收率实验 称取50mgD-葡萄糖，加水溶解后，移入100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密吸取该溶液2ml，按以上硫酸-苯酚法操作，依线性关系计算葡萄糖的回收率为98.4％。
2.4样品测定 取生脉冻干粉适量，精密称定，以双蒸水溶解，使每1ml溶液折合成生药含人参0.1g，麦冬0.3g，五味子0.15g。吸取供试品2ml，缓缓加入95％乙醇6ml，搅拌，离心，倾出上清液，取沉淀以5倍量蒸馏水溶解，按以上硫酸-苯酚法操作，
表2样品中多糖含量的测定结果
样品 1 2 3 4 5 X
多糖
362 343 351 328 355 348
(mg·g-1)
本发明的一种注射用生脉冻干粉针剂制备工艺，较为全面地考虑到所用药材有效成分的提取。五味子中主要活性成分为五味子素，该成分水溶性差，采用水提工艺得到五味子素的量极少，故本发明中采用醇提工艺，使生脉冻干粉针剂中五味子甲、乙素含量均在70mg·g-1以上；人参皂甙、麦冬皂甙有较好的水溶性，采用水提工艺是适宜的；人参、麦冬、五味子多糖是主要的活性成分之一，本发明中采用五味子醇提药渣与人参、麦冬一起水提，能较好地使多糖溶出，使有效成分得率提高。中国专利CN1059820C已经证明，三药合煎能产生新物质5-羟甲基-2-糠醛。因此本发明的制备工艺不仅优于传统方法的水提醇沉工艺，后者使有效成分多糖绝大部分丢失；也优于三种药材分别单提。人参、麦冬、五味子的多糖具有较好的免疫作用，传统中药注射剂，基本不含有多糖成分，而本发明的制剂中最大程度地提取了多糖成分，使生脉冻干粉针剂中多糖含量在300mg·g-1以上，从而更好地提高制剂的药用效果，并且达到了中药复方配伍的意义，更符合了生脉的立方宗旨。
下面通过本发明的一种注射用生脉冻干粉针剂和生脉注射剂对大鼠急性心肌缺血保护作用的比较实验，对本发明作进一步说明。
一、实验材料和方法
1实验材料
1.1动物：Wistar大鼠30只，由第一军医大学实验动物中心提供，体重200±20g，雄性。
1.2试剂：垂体后叶素(Pit)，上海生物化学制药厂，批号010301；生脉注射液，四川雅安三九药业有限公司生产，批号021207；生脉冻干粉针制剂，广东天之骄药物开发有限公司实验室提供。
2实验方法
经心电筛选合格的大鼠30只饲养5d以上，依次描记正常心电图(标准II导心电图)，将动物随机分为3组：对照组(生理盐水组)，生脉注射液组，生脉冻干粉针剂组。乌拉坦麻醉后，记录心电图。三组大鼠分别腹腔注射生理盐水5ml/kg，生脉注射液7ml/kg，生脉冻干粉针剂用注射用水溶解，稀释至每毫升折合生药人参0.1g，麦冬0.3g，五味子0.15g；注射剂量为7mg/kg。腹腔注射受试药物后30min，舌下静脉注射Pit 0.5u/只，连续记录给Pit前后5min内的心电图，出现下列指征之一者即为阳性心肌缺血：T波升高1.5mv以上；T波低平(降低原T波高度50％以上)；T波双向倒置；ST水平下移0.5mv；心律不齐。
二、实验结果
表2 注射用生脉冻干粉针剂对垂体后叶素引起大鼠急性心肌缺血的
拮抗作用
剂量 心肌缺血阳性率
组 别 动物数(只)
(ml/kg) (％)
对照组 5 10 80
生脉注射液 7 10 40*
注射用生脉冻干粉
7 10 30**
针剂
与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01
实施例一：规格100瓶，
a.按配比称取原料：人参100g，麦冬250g，五味子200g。
b.将五味子用10倍量的65％乙醇回流提取2次，每次60min，回收乙醇至无醇味，搅拌下加入乙醇，使含醇量达70％，充分搅拌后静置，滤过，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，得提取液A。
c.将用乙醇提取后的五味子药渣与上述配比的人参和麦冬加10倍量水合煎2次，每次90min。合并水提取液浓缩后，加入乙醇使含醇量达70％，进行两次醇沉，滤过，合并滤液，回收乙醇至无醇味后，静置、滤过，滤液用10倍量去离子水溶解后，用大孔吸附树脂处理，先以去离子水洗至无糖，再以70％乙醇洗至无皂甙止，回收醇洗脱液，浓缩得提取液B。
d.将上述人参、麦冬、五味子水提醇沉后的沉淀加10倍量蒸馏水溶解，滤过；60℃真空干燥，得水提多糖粗品。将多糖粗品加200倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤(截留分子量6000～50000)，浓缩得提取液C。
e.将0.2％的吐温80溶解于注射用水300ml中，加入提取液A、B和C，搅匀、冷藏、滤过，调PH6.5-7，滤液加0.05％活性炭煮沸15min，稍冷，过滤至澄明，得溶液，补充注射用水至500ml，灭菌后分装，冷冻干燥，压盖即得。
实施例二：规格1000瓶，
a.按配比称取原料：人参1000g，麦冬3000g，五味子1500g。
b.将五味子用8倍量的80％乙醇回流提取2次，每次120min，回收乙醇至无醇味，搅拌下加入乙醇，使含醇量达80％，充分搅拌后静置，滤过，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，得提取液A。
c.将用乙醇提取后的五味子药渣与上述配比的人参和麦冬加12倍量水合煎2次，每次90min。合并水提取液浓缩后，加入乙醇使含醇量达60％，醇沉，滤过，滤液，再加入乙醇，使含醇量达到80％，静置醇沉后，过滤得滤液，回收乙醇至无醇味后，静置、滤过，滤液用加入15倍量去离子水溶解，用大孔吸附树脂处理，先以去离子水洗至无糖，再以60％乙醇洗至无皂甙止，回收醇洗脱液，浓缩得提取液B。
d.将上述人参、麦冬水提醇沉后的沉淀加15倍量蒸馏水溶解，滤过；50℃真空干燥，得水提多糖粗品。将多糖粗品加100倍蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤(截留分子量6000～100000)，浓缩得提取液C。
e.将0.2％的吐温80溶解于注射用水3000ml中，加入提取液A、B和C，搅匀、冷藏、滤过，调PH6.5-7，滤液加0.05％活性炭煮沸15min，稍冷，过滤至澄明，得溶液，补充注射用水至5000ml，灭菌后分装于西林瓶中，冷冻干燥，压盖即得。