一种预防流感病毒DNA疫苗 技术领域：
本发明属于一种生物制品，具体涉及一种预防流感病毒疫苗。
背景技术：
现有流感生物预防制品及制备方法有如下种类：(一)、流感病毒灭活疫苗。全病毒灭活疫苗是在完整病毒的基础上，将致病毒粒应用物理或化学的方法使之完全灭活(失去感染性)而制成的病毒疫苗。流感灭活疫苗相较其他疫苗有生产方法比较简单，生产过程容易控制等优势，但也有其明显的缺点。由于制备疫苗用的流感病毒需在鸡胚的尿囊腔中培养生长，制备周期长，免疫原性会被降低或改变。流感的灭活疫苗不具长效性。由它诱导的免疫应答甚至对同源病毒株的效果也很短暂，因此需要每年一次或一年两次接种。(二)、流感亚单位疫苗。流感亚单位疫苗是指由野生流感病毒株经培养、裂解、纯化后得到的有效的病毒表面抗原成分，主要是HA和NA疫苗。但亚单位疫苗的传统制备方法生产工艺相对繁琐，难以大量获取抗原，因此导致亚单位疫苗价格昂贵，难于推广应用。(三)、流感减毒活疫苗。在小鼠中已经证明，流感减毒活疫苗有更为广谱的免疫应答。作为一个有效的疫苗，基因重配的冷适应株必须拥有来源于野生株的编码HA和NA的2个RNA节段，而另外6个片断则必须来源于冷适应供体株。从获得野生病毒株的克隆到制备出减毒活疫苗株大约需要5周时间。在接种人群之前，还必须将疫苗株在特殊的无菌鸡蛋尿囊腔中培养，进一步检测其毒性。对流感减毒活疫苗的减毒处理只是经验性的，且其毒力依然存在回复突变的可能性。尤其对于冷适应疫苗株来说，由于需要多次传代，时间很长，当病毒流行时，将流行毒株进行冷适应性传代并不现实。(四)、流感合成肽疫苗。人工合成的与流感病毒保护性抗原(HA、NA等)决定簇的氨基酸序列相同的肽段，经制备成免疫原后对动物或人体进行接种，可以促使机体产生保护性抗体，这种多肽就是流感地合成肽疫苗。合成肽疫苗存在着一些理论和实际上的困难：一是如何找到及构建最佳抗原决定簇的多肽；二是合成肽的免疫原性较弱，使用时必须配用佐剂。由于弗氏佐剂不能在人体使用，故合成肽的临床评价急需研制一种有效、可在人体使用的佐剂。(五)、流感基因工程亚单位疫苗。将编码诱导保护性免疫应答的流感抗原决定簇(HA、NA等)基因插入到表达载体DNA中，然后将载体导入酵母、昆虫或哺乳动物细胞，使之表达病毒抗原蛋白，产物纯化后即得流感的基因工程亚单位疫苗。基因工程亚单位疫苗的不足之处在于阳性表达克隆筛选的工作量大。表达的蛋白有时不能正确折叠或修饰，从而影响免疫原性。重组蛋白分离纯化的工艺有时相对复杂。(六)、流感病毒DNA疫苗。DNA疫苗(DNA Vaccine)是将编码某种抗原蛋白的外源基因直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。DNA疫苗由病原体(包括病毒和细菌等)的保护性抗原基因和载体质粒两部分组成。质粒DNA必须具备以下条件：①带有细菌复制子(Ori)，保证质粒能在大肠杆菌中复制；②带有用于筛选的抗性基因，筛选基因可以选用卡那霉素，氨苄青霉素或新霉素等抗性基因；③真核生物的启动子(有的含有增强子)，如CMV、SV40启动子；④带有PolyA序列，能保证mRNA在体内的稳定性，这种稳定性因PolyA来源不同而异。目前认为较好的PolyA是来自牛生长激素基因(BGH)。DNA疫苗的导入方式多样，有肌肉注射、皮内注射、鼻内滴注或鼻腔喷雾、脂质体法以及新发展起来的基因枪免疫和活体电击免疫等。流感病毒至今仍是引起人类死亡的主要病因之一，因为流感病毒易突变，所以人类至今仍无法征服流感。疫苗接种是预防流感的一种有效方法，DNA疫苗(DNA vaccine)为我国提供了一种新的选择。1993年，UlmerJB等将编码流感病毒A/PR/8/34的NP基因的质粒注入BALB/c小鼠的股四头肌内，产生了强烈而特异的CTL应答，能够提供交叉保护作用，开创了核酸疫苗用于预防流感病毒的研究[Ulmer JB et al Science.1993 Mar 19；259(5102)：1745-9.]；陈则等将HA编码基因克隆入小鸡的β肌动蛋白表达载体中，以3周间隔接种2次，采用基因枪或者活体电击免疫接种的方式，接种剂量为基因枪每只小鼠1μgDNA，活体电击免疫方法每只小鼠30μgDNA。加强免疫后的第七天，用同源病毒株攻击。结果显示，接种HA DNA疫苗的小鼠能有效抵抗病毒感染[Chen Z et al Vaccine.1998Oct；16(16)：1544-9；Chen Z et al Vaccine.1999 Feb 26；17(7-8)：653-9.]，因此HA基因应该作为流感DNA疫苗的重要组成部分。DNA疫苗在免疫应答中能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，DNA疫苗应用于小鼠、绵羊、鸡、猫、牛、猪、马、猴和黑猩猩等动物身上均获得成功，但它在诱导免疫应答中的效率相对较低，影响了它的实际应用，因此寻找其它DNA分子以提高核酸疫苗的免疫效率则是需要解决的问题。
发明内容：
本发明旨在研制一种预防流感病毒用高效DNA疫苗，以提高DNA疫苗的免疫效率。
上述发明目的是通过以下技术方案实现的。本发明疫苗是用CD40L作佐剂的预防流感病毒的DNA疫苗，HA DNA疫苗与CD40L以1∶1的质量比共同免疫。
下面进一步详述本发明。
附图说明：
图1为病毒攻击小鼠体重丢失(g)和感染后恢复结果图。
图2为病毒特异性的血清IgG滴定结果图。
图3为共同免疫HA和CD40L(加强免疫后)后小鼠中IgG抗体亚型的水平结果图。
CD40L是肿瘤坏死因子超家庭的成员之一，含有261个氨基酸，为II型跨膜糖蛋白，定位于Xq24上，其相对分子量(Mr)为39000。[Eur J Immunol.1992Dec；22(12)：3191-4]
本发明的预防流感用高效DNA疫苗是通过如下步骤制备的：流感病毒抗原HA和CD40L基因的获得，HA和CD40L DNA疫苗的构建，HA和CD40L DNA疫苗的鉴定。
流感病毒抗原HA和CD40L基因的获得
病毒RNA是从在10日龄鸡胚中增殖得到的病毒中提取。RNA经逆转录反应得到单链cDNA。以cDNA为模板，对HA基因进行PCR扩增。正向引物为5’AAC CTC GAGAAT GAA GGC AAA CCT ACT GGT CC-3’，反向引物为5’AAC CCC GGG TCT CAG ATG CATATT CTG CAC TGC A-3’。正向引物含有XhoI酶切位点，反向引物含有SmaI酶切位点。
以小鼠脾脏细胞的cDNA文库(Clontech公司)为模板，用PCR方法克隆出CD40L基因，正向引物为5’TTC CTC GAG CAT GAT AGA AAC ATA CAG-3’，反向引物为5’TGA CCC GGG GTA TAG GGA AGA CTG CCA-3’。正向引物含有Xho I酶切位点，反向引物含有Sma I酶切位点。
HA和CD40L DNA疫苗的构建
低熔点琼脂糖凝胶回收PCR产物，连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌，通过质粒提取和酶切鉴定来确定HA、CD40L基因是否已经连入T载体。然后大量扩增鉴定的重组子，纯化回收。带有HA、CD40L基因的T载体用Xho I-Sma I消化，低熔点回收从T载体上切下来的HA、CD40L片段，克隆入经同样酶切处理的表达载体pCAGGSP7中，获得重组质粒pCAGGSP7/HA、pCAGGSP7/CD40L。HA、CD40L基因核苷酸序列经377DNA测序仪(Applied Biosystem.U.S.A.)测序证实。
真核表达载体pCAGGSP7来源于由Niwa et al构建的pCAGGSP7[Niwa H et al.Gene 1991，108：103-200.]，是将多克隆位点Kpn1，Xho1，Cla1，EcoRV，Sma1，Not1和Sac1插入pCAGGS的EcoR1位点得到pCAGGSP7。质粒pCAGGS含鸡的β-肌动蛋白启动子成分，SV40的复制起始部位(Ori)，氨苄青霉素抗性基因，CMV瞬时增强子，牛生长激素基因(BGH)多聚A。
HA和CD40L DNA疫苗的鉴定
编码HA和CD40L的质粒分别在Escherichia coli XL1-blue中扩增，用QIAGEN纯化试剂盒(QIAGEN，Tip500)纯化。用紫外分光光度法测定质粒的浓度和纯度，DNA的浓度和纯度通过OD260、OD280确定，选取OD260/OD280比值在1.8～2.0的质粒DNA去免疫小鼠。
HA与CD40L质粒分别于-20℃低温冻存，免疫小鼠前解冻并根据用量将HA与CD40L质粒混合。
免疫实验步骤及实验结果
免疫实验使用的HA是来自于H1N1亚型的流感病毒株(A/PR/8/34)，其全称是hemagglutinin。
A/PR/8/34 HA(hemagglutinin)的生理化学特性：
该病毒株的主要表面糖蛋白是血凝素(HA)。它具有凝集多种动物红细胞的性质。
HA由流感病毒RNA片段4编码，是典型的I型糖蛋白，它含有4个结构域：信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。HA大约由562-566个氨基酸组成，在HA的氨基端有一由16个疏水氨基酸组成的信号肽。紧接信号肽的是由328个氨基酸残基组成的HA1部分，羧基端由221个氨基酸残基构成HA2。在HA1和HA2之间有一精氨酸残基。HA2羧基端(185-211氨基酸区域)主要由疏水氨基酸残基组成。最末端的10个氨基酸残基大多是亲水性的。
HA的三维结构：流感病毒的HA蛋白以三聚体(trimer)的形式存在于双层类脂膜上，即HA纤突由三个HA单体分子组成，单体全长13.4nm。它可分为两部分，一部分是呈球状的头部，由HA1组成，含有受体结合位点和抗原决定族；另一部分为柄，由HA2和部分HA1组成，与囊膜相连，长约7.6nm。HA2氨基末端与HA1羧基末端相距2.1nm。HA2氨基末端位于分子的三聚体交界面，与病毒膜相距3nm，它富含有甘氨酸残基，形成一个不同寻常的螺旋结构延伸出三聚体的交界面。
实验动物选取8周龄BALB/c雌性小鼠。
腹腔注射麻醉药(盐酸氯胺酮、盐酸洛贝林混合物)使小鼠全身麻醉，用酒精擦拭小鼠右后腿股四头肌，然后用一次性注射器吸取溶于TE(1M Tris，0.5M EDTA)的DNA溶液，将针垂直插入股四头肌，慢慢注入DNA。一组BALB/c小鼠混合免疫30μgHA(1μg/μl)和30μg CD40L(1μg/μl)，总体积30μl；一组BALB/c小鼠免疫30μgHA(1μg/μl)，总体积30μl；用未插入外源基因的空载体免疫小鼠作为阴性对照。在肌肉注射针孔的两侧插入电击仪的两根电极，相距0.5cm，然后电击(电压100v，电击时间50ms，电击正负各三次，间隔1s)，完成一次免疫。免疫后第3周用相同剂量和成分的DNA加强免疫。
用氯仿麻醉小鼠，从心脏采血。使小鼠背卧于实验桌面，在剑状软骨下方微偏左处以15～20度角插入注射器针头，缓慢的抽取心血直至血流停止。收集的血液置于室温1小时左右。凝固后析出血清。4000转/分离心10分钟。在无菌条件下吸出血清，-20度冰箱保存。
用酶联免疫吸附实验(ELISA)测HA特异性IgG抗体。用10μg/mL的灭活疫苗包被96孔酶标板，37℃2小时；PBS-T(1升溶液中含有NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO4 0.2g，Tween-20 0.454ml)洗三次后加入封闭液(1升溶液中含有NaCl8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.15g，KH2PO4 0.2g，10g牛血清白蛋白)，4℃过夜。用封闭液以2的倍数稀释抗血清后，加入酶标板，37℃温育1小时。PBS-T洗三次后，加入用生物素(Biotin)标记的山羊抗鼠IgG二抗，用于抗体分型的是山羊抗鼠IgG1、IgG2a二抗(γ-chain specific，Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)，37℃温育1小时。PBS-T洗三次后，加入碱性磷酸酶标记的链菌蛋白(SouthernBiotechnology Associates，Inc.USA)，37℃温育1小时。最后，PBS-T洗三次后，加入10mg/ml PNPP(Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)显色。在30分钟内，用酶标仪(Labsystems Multiskan Ascent芬兰产)利用双波长(414nm-405nm)测出OD值，最终确定抗体IgG的最高稀释度，以此来确定抗体量的高低。
取出小鼠的气管和肺，PBS(含0.1％BSA)注洗三次。漂洗液离心去细胞碎片用于测病毒滴度。将肺洗液作10倍系列稀释，取每个稀释度0.1ml与吸附在6孔板上的MDCK细胞共培养1小时，让细胞和病毒充分吸附，用2ml琼脂粉培养基覆盖6个孔，在CO2培养箱中培养两天，噬斑形成，计算噬斑的数目，以每ml病毒液中噬斑形成单位表示病毒量的多少。每个实验组病毒滴度是用每个实验组所有小鼠每毫升病毒滴度的mean±SD来表示。
小鼠加强免疫后1周用致死量流感病毒(40LD50)通过滴鼻法(17μl病毒悬液)攻击小鼠。在三周内用小鼠的存活率来判定新型DNA疫苗的保护效果。
混合免疫HA和CD40L能保护小鼠抗致死量流感病毒攻击
小鼠用致死量流感病毒攻击，攻击后3周统计死亡小鼠和存活小鼠，以此确定小鼠的存活率。如表1所示，结果显示混合HA和CD40L免疫小鼠的存活率达到100％，只免疫HA DNA疫苗小鼠的存活率也能达到100％。
表1.致死量病毒攻击后小鼠的存活率
保护效果
免疫质粒
存活数/攻击总数
HA+CD40L 5/5*
HA 5/5*
空载体 0/5
*显著差异(P＜0.05)
CD40L能够提高小鼠抗致死量流感病毒的攻击
小鼠用致死量流感病毒攻击后，小鼠的保护率没有区别，然而小鼠攻击后体重变化有不同，如图1所示。供试小鼠共免疫两次，间隔三周。加强免疫后一周，用致死量流感病毒攻击。在0～14天监视小鼠的体重变化和死亡。图中体重丢失为小鼠的平均体重。其中对照组小鼠在第7天全部死亡，免疫HA组和HA+CD40L组小鼠全部存活。结果表明与单独免疫HA相比，共同免疫HA和CD40L组小鼠体重丢失明显减少且体重恢复加速。虽然在我们以前的实验中已得到证明，30μgHA已经能够完全提供保护，但是病毒攻击后，小鼠的体重下降较多，而共同免疫HA和CD40L后，小鼠的体重减轻很少，且体重恢复很快，而体重丢失是A型流感病毒感染小鼠后一个非常明显的临床症状。这说明共同免疫HA和CD40L DNA疫苗组小鼠体内的病毒量要低于只免疫了HA DNA疫苗的实验小鼠。
共同免疫HA和CD40L DNA疫苗提高了IgG抗体的滴度
用ELISA法测血清中的IgG抗体。我们发现与单独免疫HA相比，无论是初免还是加强免疫后，共同免疫HA和CD40L明显的提高了抗HA的IgG抗体产生(图2)，且加强免疫后的抗体水平高于初免后的抗体水平。
(图2A)小鼠初免后三周通过断尾法从尾部取血，测血清中的抗HA的IgG抗体，血清以1∶200稀释；
(图2B)加强免疫后通过心脏取血，测血清中的抗HA的IgG抗体，血清以1∶4096稀释。共同免疫HA和CD40L后增强了小鼠抗HA的特异性抗体。竖条和竖线分表代表同型抗原光吸收值的平均值和SD。
*显著差异p＜0.05，使用Student t test。
CD40L与HA共同免疫后IgG抗体亚型的变化
为了检测CD40L质粒是否影响IgG抗体亚型的变化，加强免疫后我们检测了抗HA的特异性血清IgG中IgG1和IgG2a的相对数量，如图3所示，每组小鼠10只，免疫两次，间隔三周，每组剂量为30μg HA，30μg HA+30μg CD40L。加强免疫后一周用致死量流感病毒攻击，三天后，每组小鼠取五只从心脏取血。以1∶2048倍稀释时测光吸收值。竖条和竖线分表代表同型抗原光吸收值的平均值和SD。
*显著差异p＜0.05，使用Student t test。
结果表明共同免疫HA和CD40L后，稍微提高了抗HA特异性的IgG1抗体，但IgG2a抗体显著提高，表明CD40L偏向于Th1型免疫应答，Th1型免疫应答在抗病毒作用中扮演非常重要的角色。
本发明所采用流感病毒DNA疫苗佐剂与传统用于传染病预防的疫苗及其佐剂相比，有以下特点：
(1)、本发明使用免疫佐剂可减少核酸疫苗的使用量，减少核酸疫苗的安全性隐患。
(2)、本发明不仅增强了免疫动物的肌体体液应答反应，同时增强了细胞介导的免疫反应，而后者是提高DNA疫苗效率的重要前提条件。
(3)、本发明的DNA疫苗容易生产，稳定性强，较安全。干燥的DNA小粒在室温下相对稳定，不需要冷藏设备，因此对边远地区的使用也较为方便。DNA疫苗在接种前即刻加水就能简单地恢复原状，这在经济上和公共卫生方面都是有利的。
(4)本发明的制备方法简便，价格低廉。DNA疫苗仅需在细菌中生产，构建高效表达质粒，与普通疫苗相比，DNA疫苗的制作省去了抗原提取和纯化等繁琐耗时的过程，使得制备周期大大缩短。
(5)本发明免疫应答持久，由于外源基因可以在体内存在较长时间，并不断表达外源蛋白，它可以持续地给免疫系统提供刺激，因此，很微量的抗原即可刺激机体产生强而持久的免疫应答。
总的来说，CD40L与HA共同免疫能够增强流感病毒表面抗原HA基因的免疫应答，能够更有效的保护动物抗致死量流感病毒的攻击，是一种有广阔应用前景的流感病毒DNA疫苗。