一种降解纤维素的产电菌及其在燃料电池中的应用.pdf

本发明公开了一种降解纤维素的产电菌及其在燃料电池中的应用，其菌株保藏名称是弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1，保藏单位CGMCC，保藏号是CGMCC No.10335，保藏日期2015年1月9日；其菌株的16S rDNA基因序列为SEQ ID NO:1。本发明提供的产电菌易于培养，不仅能够以多种有机物为底物，更主要的是能够以资源丰富的纤维素为底物进行发电，将其应用于微生物燃料电池中，其适应性强、产电电压大，具有较高经济价值和广阔的使用前景。

权利要求书1.  一种降解纤维素的产电菌，其特征在于，所述菌株保藏名称是弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1，保藏单位CGMCC，保藏号是CGMCC No.10335，保藏日期2015年1月9日。 2.  根据权利要求1所述的降解纤维素的产电菌，其特征在于，所述菌株的16S rDNA的核苷酸序列为SEQ ID NO : 1。 3.  一种如权利要求1所述降解纤维素的产电菌在微生物燃料电池中的应用。 4.  根据权利要求3所述降解纤维素的产电菌在微生物燃料电池中的应用，其特征在于，包括以下步骤： A、在无菌条件下，将弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1接种于纤维素液体培养基中，30℃培养6-8 h，培养至对数生长期，得接种菌，保存备用；所述纤维素培养基的组成为：纤维素20份、Na2HPO4 1.5份、蛋白胨2.5份、酵母膏0.5份以及蒸馏水1000份，所述纤维素培养基的pH值为7.0-7.2； B、构建微生物燃料电池系统，该系统包括阴极室、阳极室、质子交换膜以及外电路电阻；在所述阳极室装有阳极液、阴极室装有阴极液，所述阳极液组成为：纤维素276mg/L、NaHCO3 3.13g/L、NH4Cl 0.31g/L、Na2HPO4 2.75g/L、（NH4）2SO4 0.56g/L、MgSO4 0.2g/L、KCl 0.13g/L 、CaCl2 15mg/L、MnSO4 20mg/L、FeCl3 1mg/L；所述阴极液组成为：25mmol/L的K3[Fe(CN)6]，体积比为1:1的NaH2PO4和Na2HPO4各50 mmol/L； C、取所述接种菌5mL，无菌条件下离心收集，接种于阳极室，进行产电。

说明书一种降解纤维素的产电菌及其在燃料电池中的应用
技术领域
本发明涉及微生物燃料电池技术领域，具体地说是一种降解纤维素的产电菌及其在燃料电池中的应用。
背景技术
微生物燃料电池（MFC）是以微生物作为反应主体，利用酶或者微生物作为阳极催化剂，通过其代谢作用将有机物氧化转化为电能的装置。它属于生物质能利用技术中的生物化学转化技术，其不仅无污染、效率高、反应条件温和，而且燃料来源广泛。因此，微生物燃料电池已成为了世界各国争相研究的课题。
我国是农业大国，生物质资源十分丰富，各种农作物每年产生秸秆6亿多吨，其中可以作为能源使用的约4亿吨，若能够以此作为微生物发电的底物原料，则我国微生物发电具有十分广阔的发展空间。
目前，已分离的产电微生物多数为细菌，兼性厌氧。从厌氧呼吸的最终电子受体的类型分析，他们属于不同的功能菌，例如：以Fe(Ⅲ)或Mn（Ⅳ）为呼吸链最终电子受体的金属还原菌Shewanella、Geobacter及Geopsychrobacter等菌属；以硫酸盐为电子受体的硫酸盐还原菌desulfoblbus、desulfovibrio 及desulfuromon等菌属；以硝酸盐为电子受体的硝酸盐还原菌pseudomonsa、ochrobactrum及comamonas等菌属；另外，厌氧发酵的大肠杆菌，进行光合作用的rhodopseudomona、绿藻chlamydomonas以及真核的酵母菌均表现出产电特性。但是，现有菌种中能够以纤维素为底物的产电菌报道极少。如CN101728544A公开了一种弗氏柠檬酸杆菌在微生物发电中的应用及发电方法，提供了一种弗氏柠檬酸杆菌LY-3，保藏编号为CGMCC No.3246，该菌株可以作为微生物燃料电池的阳极催化剂应用于微生物发电，但是该技术的新菌株所利用的燃料为葡萄糖和乙酸钠，其所需原料成本较高。又如CN100588019C公开了微生物燃料电池及利用秸秆发电的方法，是以纤维素降解混合菌群对秸秆进行处理发电的，该技术无污染、成本低，缓解了能源危机，使农村秸秆得到了有效的利用，但是，其工艺步骤繁琐，混合培养液并不能够完全满足混合菌群中所有菌种的最佳培养需求，其对秸秆的降解能力有限，其电转化率相对较低。可见，能够开发一种以纤维素为降解底物的高效产电菌，并将其应用于微生物燃料电池，是当前行业内研究的热门课题之一。
发明内容
本发明的目的就是提供一种降解纤维素的产电菌及其在燃料电池中的应用，以期为产业界利用纤维素产电提供一种新的菌株选择，也为产业界利用纤维素产电提供一种新的应用方法，同时也解决现有微生物电池所采用的菌株无法利用纤维素产电或者其产电性能较差的问题。
本发明的目的是这样实现的：
本发明提供了一种降解纤维素的产电菌，所述菌株保藏名称是弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1，保藏单位CGMCC，保藏号是CGMCC No.10335，保藏日期2015年1月9日；保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的降解纤维素的弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1，其生物学特征如下：为革兰氏阴性杆菌，菌落表明粘滑，隆起，半透明，直径3 mm左右，边缘不整齐。
本发明所述弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1的16S rDNA序列如SEQ ID NO : 1所示。
本发明同时提供了弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1在燃料电池中的应用。
更具体地说，本发明所述弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1在燃料电池中的应用方法包括以下步骤：
A、在无菌条件下，将弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1接种于纤维素液体培养基中，30℃培养6-8 h，培养至对数生长期，得接种菌，保存备用；所述纤维素培养基的组成为：纤维素20份、Na2HPO4 1.5份、蛋白胨2.5份、酵母膏0.5份以及蒸馏水1000份，所述纤维素培养基的pH值为7.0-7.2；
B、构建微生物燃料电池系统，该系统包括阴极室、阳极室、质子交换膜、外电路电阻箱以及数据采集器；在所述阳极室装有阳极液，阴极室装有阴极液，所述阳极液组成为：纤维素276mg/L、NaHCO3 3.13g/L、NH4Cl 0.31g/L、Na2HPO4 2.75g/L、（NH4）2SO4 0.56g/L、MgSO4 0.2g/L、KCl 0.13g/L 、CaCl2 15mg/L、MnSO4 20mg/L、FeCl3 1mg/L；所述阴极液组成为：25mmol/L的K3[Fe(CN)6]，体积比为1:1的NaH2PO4和Na2HPO4各50 mmol/L；
C、取所述接种菌5mL，无菌条件下离心收集，接种于阳极室，进行产电。
本发明提供了一株产电新菌株—弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1，该菌株易于培养，不仅能够以多种有机物为燃料，更主要的是能够以资源丰富的纤维素为燃料进行发电，将其应用于微生物燃料电池中，其适应性性强、产电电压大，具有较高的使用价值。
本发明提供的产电新菌株在微生物燃料电池中应用，其工艺步骤简单，易操作，只需添加单一菌种就能以纤维素为底物进行发电，其产电电压大、电转化率高、实用性强，具有较高的经济价值和广阔的发展前景。
本发明公开的弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1的建议保藏方法：冷冻干燥保藏法。
附图说明
图1为葡萄糖标准曲线图。
图2为弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1刚果红实验观察图。
图3为弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1培养至对数期的电镜图。
图4为弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1与相关种系统发育树。
图5为弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1的循环伏安曲线。
图6为弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1利用纤维素产生电压随时间的变化曲线图。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 菌株的获得
（1）菌株的分离和纯化：源来自稳定运行6个月的以羧甲基纤维素为燃料的双极室循环MFC的阳极，剪下少量碳布，放到加有玻璃珠的质量百分比浓度为1%的NaCl溶液中，摇晃均匀后梯度稀释涂布到以羧甲基纤维素为唯一碳源的平板上，置于厌氧箱（YQX-Ⅱ，上海新苗医疗器械制造有限公司）中在30℃下培养3天；继续划线分离，保存；
（2）菌株的筛选：将步骤（1）保存的供试菌株接种到产酶培养基37℃震荡培养48h，取发酵液10 mL，4000 r/min下离心10 min，上清液作为粗酶液；移取含有CMC-Na的醋酸缓冲液(0.05 mol/L，pH 4.4)1.5 mL于试管中，加入酶液0.5 mL，于50℃保温30 min后，按DNS法测糖。在碱性条件下，DNS溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系。在540 nm波长下测定棕红色物质的吸光度值，通过标准曲线，计算样品中还原糖的含量。定义每分钟催化纤维素水解生成1g葡萄糖的酶量为一个酶活力单位U。根据国际酶活定义，1g固体酶（或1mL液体酶），在（50±1）℃，在特定pH条件下，1h水解底物产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为一个活力单位，以μ/g（或μ/mL）表示。参照国标，本研究定义每分钟每1mL粗酶产生的1μg葡萄糖量为一个相对酶活力单位，记为μ/mL或U。
葡萄糖标准曲线如图1所示，y=0.91x-0.025，R2=0.997，酶活力计算公式为：
酶活力（U）=（OD+b）/a×1000×2/30
其中：b：曲线纵截距，0.025；a：曲线斜率：0.91；1000：mg换算成μg
根据测定结果，OD值为0.115，通过标准曲线和酶活公式计算得到本发明公开的菌株的酶活最高为10.32 U。
可见，经DNS法测定供试菌株羧甲基纤维素酶(CMCase)活力，酶活最高为10.32 U的菌株即为本发明提供的弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1，并于2015年1月9日保藏于CGMCC，保藏号是CGMCC No.10335。
实施例2 菌株的鉴定
对所得弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1分别进行形态鉴定、生理生化鉴定和分子鉴定，其实验过程及结果如下。
（1）菌株形态鉴定
参照《一般细菌常用的鉴定方法》进行菌株鉴定，采用革兰氏染色法显微镜下观察了菌体形态。结果显示，经过培养，得到能在羧甲基纤维素为唯一碳源的平板上产生透明圈的单菌落若干，其刚果红实验结果见图2。通过培养后的菌株形态鉴定得知：本发明所提供的降解纤维素的弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1为革兰氏阴性杆菌，菌落表明粘滑，隆起，半透明，直径3 mm左右，边缘不整齐；将分离菌株在液体培养基（羧甲基纤维素20 g，Na2HPO4 1.5 g，蛋白胨 2.5 g，酵母膏 0.5g，蒸馏水1000ml，pH值为7.0-7.2）中培养12 h至指数生长期，用透射电镜观测和拍摄，见图3。
（2）生理生化鉴定
对弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）HBUZL-1进行了糖发酵试验、甲基红试验、乙酰甲基甲酸试验(V.P.试验)、吲哚试验、硝酸盐还原试验、明胶水解试验、H2O2酶测定试验等生理生化鉴定。其鉴定结果见表1。
表1 菌株生理生化实验结果

注:“+ ”实验结果阳性，“- ”实验结果阴性。
（3）分子鉴定
采用通用27F/ 1492R引物（上游引物：5′-AGAGTTTGATCMTGGCT2CAG-3′；下游引物：5′-GGYTACCTTGT2TACGACTT-3′）进行16SrDNA的PCR扩增。PCR反应体系：模板DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶0.6μL，Mg2+(1.3 mmol/ L) 3.2 μL，dNTP 4μL，Buffer 3.2μL，上下游引物各4 μL，19 μL水。PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，29个循环；72℃终止延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶带；按照PCR产物纯化试剂盒的操作步骤进行纯化后，送北京三博远志生物工程有限公司测序，测得该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO : 1所示；将获得的序列提交NCBI（www.ncbi.nlm.gov）进行Blast比对，调取同源性较高的相关序列，用clustalX软件进行比对，采用Mega软件进行系统发育分析，采用邻接法构建系统进化树，见图4。从图4中可以看出，对该菌株16SrDNA基因进行PCR 扩增并进行测序，其序列与Gen-bank中已知基因序列进行比较，结果表明该菌株16SrRNA基因与弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freuudii）16SrDNA基因同源性大于99%，GenBank接收号为KM272633。根据菌株的形态结构、生理生化特征及菌株16S rDNA 序列分析结果，确定该菌株属于柠檬酸菌属。
实施例3 产电菌在生物燃料电池中的应用
按现有方法构建微生物燃料电池（MFC）系统，该系统包括阴极室、阳极室、电阻箱以及质子交换膜，其电极材料均为碳纤维毡；两极间由铜导线与一高精度电阻箱相连（ZX21，0-100000Ω），两室之间通过短侧管连接一片质子交换膜（Ultrex CMI7000，MI Mem. Int. Inc.）。
（1）弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1的电活性检测
将MFC反应器和阳极液经121℃灭菌20min后，在阳极室接种弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1，开始运行并采用数据采集系统（DAM-3058R电压采集模块，北京阿尔泰科技有限公司），1min记录一次电压，当输出电压降低到0.3V以下时，更换阳极燃料，温度为室温（约25℃）。稳定运行后考察其产电特性，最大功率通过极化曲线获得，当电压输出稳定时，通过改变外电路的电阻（0-90000Ω），并且记录在不同外电阻时的稳定电压。
阳极液：葡萄糖（2g/L）、NaHCO3(3.13g/L)、NH4Cl（0.31g/L）、Na2HPO4(2.75g/L)、（NH4）2SO4(0.56g/L) 、MgSO4(0.2g/L)、KCl（0.13g/L）、CaCl2（15mg/L）、MnSO4(20mg/L)、FeCl3（1mg/L）；阳极液也可以为：乙酸钠（3g/L）、NaHCO3(3.13g/L)、NH4Cl（0.31g/L）、Na2HPO4(2.75g/L)、（NH4）2SO4(0.56g/L) 、MgSO4(0.2g/L)、KCl（0.13g/L）、CaCl2（15mg/L）、MnSO4(20mg/L)、FeCl3（1mg/L）。
阴极液：25mmol/L的K3[Fe(CN)6]，体积比为1:1的NaH2PO4和Na2HPO4各50mmol/L。
电池运行至电压平稳阶段，以阳极碳毡电极为对电极，阴极电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，调整扫描范围，扫描速率等，用电化学工作站（上海辰华，CHI660C）测定电极的循环伏安曲线（CV）。调节初始电位E0（V）：0.5，顶点电位E1（V）：0.5，顶点电位E2（V）：-0.7，采样间隔（V）：0.001，扫描速率(V/s)0.002。
实验结果见图5，图5是以葡萄糖为底物所测定的循环伏安曲线，其以乙酸钠为底物所得结果与之类似，从图中可见循环伏安曲线显示有明显的氧化还原峰。
（2）以弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1为产电菌、羧甲纤维素为底物产电性能测定
实验步骤为：
A、在无菌条件下，将弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1接种于纤维素液体培养基（羧甲基纤维素20 g，Na2HPO4 1.5 g，蛋白胨 2.5 g，酵母膏 0.5g，蒸馏水1000ml，pH值为7.0-7.2）中，30℃培养6-8 h，使细胞处于对数生长期，得接种菌，保存备用；
B、在阳极室装入阳极液，阴极室装入阴极液，阳极液组成为：羧甲基纤维素276 mg/L、NaHCO3 3.13g/L、NH4Cl 0.31g/L、Na2HPO4 2.75g/L、（NH4）2SO4 0.56g/L、MgSO4 0.2g/L、KCl 0.13g/L、CaCl2 15mg/L 、MnSO4 20mg/L、FeCl3 1mg/L；阴极液与本实例的步骤（1）中的阴极液相同；
C、取接种菌5mL，无菌下离心收集，加入接种到微生物燃料电池的阳极室中产电；
D、将电阻箱连接外电路，采用所述数据采集系统进行数据采集。
所得的实验结果见图6，图6表明，以羧甲基纤维素为底物，弗氏柠檬酸杆菌HBUZL-1具有良好的产电性能，经过一段时间的驯化，最高电压可达600mV。