与IL10相关的哺乳动物细胞因子 本发明领域
本发明涉及与蛋白相关的组合物，该组合物能起着控制哺乳动物细胞生物学和生理学的作用，所述细胞如哺乳动物免疫系统细胞。具体地讲，本发明提供了可用于调节包括造血细胞在内的各种类型细胞的活化、发育、分化和功能的纯化基因、蛋白、抗体、及相关试剂。
本发明背景
重组DNA技术一般是指将源于供体的遗传信息整合到载体中以便作进一步处理的技术，如通过介导进入宿主，从而在新的环境中复制和/或表达所转移的遗传信息。通常，所述遗传信息以源于信使RNA(mRNA)的互补DNA(cDNA)的形式存在，该信使RNA编码一种希望的蛋白产物。所述载体通常是一种质粒，它具有将cDNA整合到宿主中以便随后进行复制的能力，在某些场合下，它实际上控制着cDNA的表达，因此它在宿主中指导其所编码产物的合成。
众所周知，有时候哺乳动物免疫反应是基于一系列复杂的细胞相互作用，这种作用被称作“免疫网络”。最近的研究为该网络的内部机制提供了新的观点。尽管依然认为所述反应的大部分事实上是围绕着淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞及其它细胞的网络样相互作用，但免疫学家现在普遍所持地观点是，已知为淋巴因子、细胞因子或单核因子的可溶性蛋白在控制所述细胞相互作用方面起着关键作用。因此，人们对于细胞调节因子的提取、鉴定和作用机制怀有浓厚的兴趣，对其作用机制的了解将会导致在诊断和治疗免疫系统疾病的多种医学异常方面取得明显的进步。
显然，淋巴因子以多种方式介导细胞的活性。业已证实其能够支持多潜能造血干细胞增殖、生长、和分化成大量的祖细胞，包括组成复杂的免疫系统的多种细胞谱系。细胞组份之间的合适而且平衡的相互作用是健康的免疫反应所必须的。当结合其它试剂服用淋巴因子时，不同的细胞谱系通常以不同的方式作出反应。
对免疫反应特别重要的细胞谱系包括两种类型的淋巴细胞：B-细胞，它能产生和分泌免疫球蛋白(具有识别并结合外源物质以便将其清除的能力的蛋白)，以及各种亚型的T-细胞，该细胞能分泌淋巴因子，并诱导或抑制组成免疫网络的B-细胞和各种其它细胞(包括其它T-细胞)。所述淋巴细胞能与许多其它类型的细胞相互作用。
另一种重要的细胞谱系是肥大细胞(这种细胞在所有哺乳动物物种中均未得到正面鉴定)，这是一种含有颗粒的结缔组织细胞，位于身体中接近毛细血管的部位。这种细胞以特别高的浓度出现在肺、皮肤和胃肠道及生殖泌尿道中。在变异性相关疾病，特别是以下的过敏反应中起着重要作用：当特定的抗原与一种类型的免疫球蛋白交联结合于肥大细胞表面的受体上时，该肥大细胞脱颗粒并释放介质，例如组胺、血清紧张素、肝素和前列腺素，这会导致变态反应，例如过敏。
为了更好地理解和治疗各种免疫疾病所做的研究，已经受到了普遍不能在体外维持免疫系统细胞所妨碍。免疫学家已经发现，通过使用T-细胞和其它细胞上清液可以实现培养上述细胞，所述上清液中含有各种生长因子，包括很多淋巴因子。
已在80年代提取了编码IL-10的基因，IL-10最初被称为细胞因子合成抑制因子(CSIF)。例如，参见Mosann等，US5,231,012。从那时起，业已对由该细胞因子引起的生物学和生理学有了很多了解。例如，参见de Vries和de Waal Malefyt(1995)白介素-10 Landes公司，Austin，TX。
通过以上说明可以了解，发现并开发新的淋巴因子，例如与IL-10相关的淋巴因子，可以对各种退化或异常症状的新疗法作出贡献，所述症状直接或间接涉及免疫系统和/或造血细胞。具体地讲，发现并开发能促进或加强已知淋巴因子的有益活性的淋巴因子将是十分有用的。本发明提供了新的白介素组合物及相关化合物，及其使用方法。
本发明概述
本发明涉及诸如啮齿类、犬类、猫类、灵长类的哺乳动物，白介素-BKW(IL-BKW)及其生物学活性。它包括编码多肽的核酸本身及其生产和使用方法。本发明核酸的特征部分在于其与本发明所包括的克隆互补DNA(cDNA)的同源性，和/或作用于所述多肽的IL-10-样活性功能测定，所述多肽通常是由该核酸编码的。提供了调节或介入控制所述免疫反应的方法。
本发明部分基于一种新的细胞因子序列的发现，该序列具有和细胞IL-10相比很高的序列和结构相似性。具体地讲，它提供了一种编码一种蛋白的基因，该蛋白的成熟大小大约为158个氨基酸。具有明显系列同源性的功能等同物可获自其它哺乳动物，例如小鼠和大鼠以及非哺乳动物物种。
在一种实施方案中，本发明提供了一种基本上纯的或重组可溶性IL-BKW，包括可溶性IL-BKW的抗原性蛋白或肽片段。优选地所述IL-BKW是源于包括灵长类在内的动物全长天然可溶性蛋白，或者也可以包含于一种无菌组合物中。通常，可溶性IL-BKW缺乏序列2的以下序列：MNFQQRLQSL WTLARPFCPP LLATASQMQM VVLPCLGFTLLLWSQVSG；它是序列6的成熟多肽；或是由序列5的核酸编码。另外，可溶性IL-BKW是一种全长分泌性蛋白，其翻译后修饰形式有别于天然可溶性IL-BKW。
从功能上讲，可溶性IL-BKW通常具有的免疫学活性在功能上与IL-10拮抗。
本发明还提供了一种融合蛋白，该蛋白包括可溶性IL-BKW的序列，但缺乏序列2的序列MNFQQRLQSL WTLARPFCPP LLATASQMQMVVLPCLGFTL LLWSQVSG；它是一种如序列6所示的成熟多肽；或是由序列5编码。
本发明还提供了一种从混合物中的其它材料中纯化可溶性IL-BKW蛋白或肽的方法，该方法包括让所述混合物接触所述蛋白的抗体，并从其它材料上分离结合的IL-BKW。
在其它实施方案中，本发明还提供了一种编码可溶性IL-BKW的分离的或重组的表达载体。优选地，所述载体编码序列2或6所示的分泌序列，并可以包括序列1或5所示的序列。
本发明还提供了一种用于检测的试剂盒，包括一个基本上为纯的IL-BKW或片段的阳性对照。该试剂盒还提供了一种用于检测样品中可溶性IL-BKW蛋白或抗体存在的方法，该方法包括用所述试剂盒检测所述样品。
本发明还提供了一种调节细胞的生理学的方法，包括让所述细胞与一种大体上纯的可溶性IL-BKW接触。在某些实施方案中，所述细胞是T-细胞，而生理学的调节是使该T-细胞失活；或所述细胞存在于组织中。
本发明还提供了一种制备可溶性IL-BKW的方法，该方法包括表达一种载体。所述载体可存在于细胞、组织、或器官中。
最后，本发明还提供了一种通过给动物服用一种有效剂量的大体上纯的可溶性IL-BKW来治疗具有异常免疫反应的动物的方法。
附图的简要说明
图1表示IL-10和相关细胞因子的对仗。
本发明详细说明
本文所引用的所有参考文献均以相同的程度收作本发明的参考文献，就如同每一件出版物或专利中请被特别地和单独地指定为收作参考文献一样。I.概论
本发明提供了编码各种哺乳动物的蛋白的氨基酸序列和DNA序列，所述蛋白是细胞因子，例如，它可以是分泌性分子，该分子能在免疫或其它细胞之间调节信号。例如，参见Paul(1994)基础免疫学，Raven出版社，N.Y.。所述全长细胞因子、和片段或拮抗剂可用于表达一种受体的细胞的生理学调节。最初的资料表明，该细胞因子起着与IL-10相反的作用。IL-BKW很可能对T-细胞、B-细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、树突状细胞、造血祖细胞等具有激发或抑制作用。所述蛋白还可被用作抗原，例如免疫原，用于产生针对该蛋白上的各种表位，包括线形和构像表位的抗体。
从人黑素瘤细胞系中提取到一种编码IL-BKW的cDNA，该分子被命名为mda7，并被确定为一种新型黑素瘤分化相关基因。序列1和2。参见Jiang等(1995)癌基因11：2477-86；基因库储藏编号U16261。该论文还报道了mda7与人IL-10的一些小的同源性，但其相关性尚不清楚。申请人为所述序列进行了分析，并相信其编码区认定有误，一个事实是与小鼠基因吻合。
由Jiang等所提出的CDS从大约275..895开始延伸至编码：MNFQQRLQSL WTLARPFCPP LLATASQMQM VVLPCLGFTL LLWSQVSGAQ GQEFHFGPCQVKGVVPQKLW EAFWAVKDTM QAQDNITSAR LLQQEVLQNV SDAESCYLVH TLLEFYLKTVFKNYHNRTVE VRTLKSFSTL ANNFVLIVSQ LQPSQENEMF SIRDSAHRRF LLFRRAFKQLDVEAALTKAL GEVDILLTWM QKFYKL (SEQ ID NO：2)；不过，申请人提出了一种成熟形式的IL-BKW，它始于大约第49位残基，或：AQGQEFHFGP CQVKGVVPQK LWEAFWAVKD TMQAQDNITS ARLLQQEVLQ NVSDAESCYLVHTLLEFYLK TVFKNYHNRT VEVRTLKSFS TLANNFVLIV SQLQPSQENE MFSIRDSAHRRFLLFRRAFK QLDVEAALTK ALGEVDILLT WMQKFYKL.
在表1中，对各种人IL-10实施方案和人IL-BKW进行了比较。
表 1 IL-BKW .MQMVVLPCL GFTLLLWSQV SGAQGQEFHF GPCQVK.GVV PQKL...WEA IL-10 MHSSALLCCL ..VLLTGVRA SPGQGTQSEN SCTHFP.GNL PNMLRDLRDA IL-XX MLVNFILRCG ..LLLVTLSL AIAKHKQSSF TKSCYPRGTL SQAVDALYIK IL-BKW FWAVKDTMQA QDNITSAR.L LQQEVLQNVS DAESCYLVHT LLEFYLKTVF IL-10 FSRVKTFFQM KDQLDNL..L LKESLLEDFK GYLGCQALSE MIQFYLEEVM IL-XX AAWLKATIP. EDRIKNIR.L LKKKTKKQFM K..NCQFQEQ LLSFFNEDVF IL-BKW KNYHNRTVEV RTLKSFSTLA NNFVLIVSQL QPSQENEMFS IRDSAHRRFL IL-10 PQAENQDPDI ..KAHVNSLG ENLKTLRLRL RRCHR...FL PCENKSKAVE IL-XX GQLQLQG... ...CKKIRFV EDFHTLRQKL SHCIS...CA SSAREMKSIT IL-BKW LFRRAFKQLD VEAALTKALG EVDILLTWMQ KFYKL.... IL-10 QVKNAFNKLQ .EKGIYKAMS EFDIFINYIE AYMTMKIRN IL-XX RMKRIFYRIG .NKGIYKAIS ELDILLSWIK KLLESSQ..hIL-BKW(SEQ ID 序列 2)hIL-10(SEQ ID 序列 3)hIL-XX(SEQ ID 序列 4)参见Knappe等USSN08/718，753。
还从活化的小鼠胸腺细胞cDNA文库中分离到一种编码IL-BKW(mIL-BKW)的鼠克隆(A.Zlotnik，DNAX研究所，Palo Alto，CA)。序列5和6。其信号序列大致从Metl延伸至G1y23。其成熟多肽始于Leu24左右。和受体结合有关的保守D-螺旋，大致从G1u158延伸至Leu181。在其前导序列上游，与人不同，没有相应的ATG，这可能意味着该分子是膜结合的。
mIL-BKW与人的对应物相比具有高度的氨基酸序列同源性。hIL-10、mIL-10、hIL-BKW和mIL-BKW所作的比较表明，D-螺旋是高度保守的。参见表2和序列2、3、6和7。
表2中比较了人和小鼠的IL-10以及人和小鼠的IL-BKW。在IL-10中，该螺旋似乎对于受体结合特别重要。因此，IL-BKW和IL-10可能拥有相同的受体亚基。
表2
用mIL-BKW作为探针进行的染色体作图表明，该细胞因子位于小鼠染色体1的中央部位，位于人染色体2q和1q的同源片段之间。有趣的是，mIL-BKW直接位于接近编码mIL-10的基因。已证实出现在这一特定基因座上的缺陷与免疫疾病相关，例如，显性半肢畸变。例如，参见Carter(1954)小鼠新闻通讯11：16；Higgins等(1992)遗传学研究60：53-60和Machado等(1976)美国病理学杂志85：515-518。
所述蛋白已被鉴定为具有预测疏水片段的抗原，该片段包括该蛋白的残基25-45。但是，实验未能证实一种膜型的存在。申请人认为，所述预测的疏水片段实际上是一个信号序列，该序列被从成熟蛋白上切除，该片段可能始于残基47(Ser)或49(Ala)，正如在原始出版物中所认定的。
申请人认为，该基因编码一种具有大约158个氨基酸的小的可溶性细胞因子样蛋白。其前序列可能始于第28或30位的M，因此一种大约17-21个氨基酸的N-末端信号序列。参见表1和序列1和2。IL-BKW具有一些短链细胞因子特有的结构基序。例如，比较源于小鼠和人的IL-BKW细胞IL-10s，EBV病毒IL-10，和马疱疹病毒IL-10，所有序列均获自基因库(GenBank)。参见表1。
IL-BKW与相关IL-10蛋白的结构同源性，表明该分子具有相关的功能。IL-BKW是一种小的链状细胞因子。早期的实验表明，这种新的细胞因子可能通过一种细胞因子受体类型的受体介导免疫功能，尽管它似乎不具备功能性IL-10受体复合体的所有部分。
IL-BKW激动剂或拮抗剂也可以起着功能或受体拮抗剂的作用，例如，它能阻止IL-10与其受体结合，或介导相反的作用。因此，IL-BKW或其拮抗剂可用于治疗异常免疫疾病。例如，T-细胞免疫缺陷症、慢性炎证或组织排斥。
天然抗原能够介导各种生化反应，这些反应可导致靶细胞中的生物学或生理学应答。本文所特定的实施方案源于人和小鼠，不过，预计在其它灵长类或其它物种中也存在天然的对应物。还可获得存在于诸如灵长类、犬类、猫类和啮齿类的其它哺乳动物物种中的其它蛋白序列。参见下文。以下的说明以举例形式涉及人IL-BKW，但同样可以适用于其它物种的相关实施例。
人和小鼠IL-BKW蛋白具有短链细胞因子特有的结构特征。II.纯化的IL-BKW
人IL-BKW氨基酸序列作为一种实施方案示于序列2中，该序列缺少N-末端序列，例如，MNFQQRLQSL WTLARPFCPP LLATASQMQMVVLPCLGFTL LLWSQVSG。在序列6中示出了相应的mIL-BKW氨基酸序列。这些氨基酸序列向羧基提供氨基，它在提供细胞因子的序列信息方面十分重要，这些信息可用于区分蛋白抗原与其它蛋白，并解释多种变体。而且，所述肽序列可用于制备能产生识别所述片段的抗体的肽，而核酸序列可用于制备寡核苷酸探针，以上两种制备物均为用于检测或提取基因的策略，例如，克隆编码所述序列的基因。在上述人的序列上的潜在糖基化位点为asn31-thr39和asn51-ser53；而在小鼠上的潜在糖基化位点为asn51-ser53。
在本文中，“人可溶性IL-BKW”一词在用于表示蛋白时，应当包括具有相当于序列2所示可溶性多肽的氨基酸序列的蛋白，例如，缺乏所述的膜有关的氨基末端部分的蛋白(MNFQQRLQSL WTLARTFCPPLLATASQMQM VVLPCLGFTL LLWSQVSG)。上述蛋白将缺少由Jiang等所披露的作为N末端的头45个残基，或其大的片段。“小鼠IL-BKW”应当包括相当于序列6的氨基酸序列。诸如抗体的结合成分通常以高的亲和力与IL-BKW结合，例如，至少约为100nM，通常高于大约30nM，优选高于大约10nM，更优选高于大约3nM。同源蛋白还存在于除人以外的哺乳动物中，例如，其它灵长类或啮齿类。非哺乳类物种例如，鸟类或两栖动物，也应该具有结构上或功能上相关的基因或蛋白。
本文所用的“多肽”一词包括大的片段(fragment或segment)，并包括至少由8个氨基酸组成的氨基酸片段，通常，至少约为12个氨基酸，典型地至少约为16个氨基酸，优选地至少约为20个氨基酸，而在特别优选的实施方案中，至少约为30个氨基酸或更多个氨基酸，例如，35、40、45、50等。上述片段可具有末端，其末端实际上可始于和/或止于任何位置，例如，始于残基1、2、3等，并止于例如150、149、148等，并且以各种组合形式出现。特别有趣的肽具有相应于结构域边界的末端，例如，螺旋A、B、C和/或D，参见表1、表2和图1。注意，IL-BKW的序列在残基126-137范围内与细胞IL-10有特别的同源性，而其它部分在更大程度上表现为IL-BKW特有序列。
“结合组合物”是指与IL-BKW结合的特异性的分子，例如，以抗原-抗体相互作用形式结合。它还包括诸如蛋白的化合物，该化合物可特异结合IL-BKW，包括天然生理学上相关的蛋白-蛋白相互作用，这种作用或为共价的，或为非共价的。所述分子可以是聚合物或化学制剂。其功能性类似物可以是在结构上做过修饰的蛋白，如它可以是一种具有特殊分子形状的分子，这种形状使其能与合适的结合决定簇相互作用。所述化合物可用作受体结合相互作用的激动剂或拮抗剂，例如，参见Goodman等(著)(1990)，Goodman & Gilman’s：治疗的药理学基础(第八版)，Pergamon出版社。
“大体上纯的”通常是指不含原来供提取的生物的其它杂质蛋白、核酸或其它生物物质。纯度可以用标准方法测定，通常通过重量测定，而且一般其纯度至少约为40％，通常至少约为50％，常见至少约为60％，典型至少约为80％，优选至少约为90％，而在最优选的实施方案中至少约为95％。通常还加入载体和赋形剂。
多肽或片段的溶解度取决于环境及该多肽本身。很多参数影响多肽的溶解度，包括温度、电解质环境、多肽的大小和分子特征、以及溶剂的性质。通常，适用所述多肽的温度为大约4℃至大约65℃。一般使用时的温度高于大约18℃。为了进行诊断，该温度通常为室温或更高一些的温度，但低于在分析时成分的变性温度。在治疗时该温度一般为体温，对人和小鼠来说通常为大约37℃，不过，在某些场合下，该温度可在原位或在体外升高或降低。
所述多肽的大小和结构一般为大体上稳定的状态，而且通常不处于变性状态。该多肽可以四级结构的形式与其它多肽结合，例如，赋予其溶解度，或与脂，或与洗涤剂结合。
溶剂和电解质一般是一种生物学上可兼容的，用于保持生物学活性的缓冲液种类，并且通常接近于一种生理学上的水溶剂。通常溶剂具有中性的pH，典型的为大约5～10之间，优选的大约7.5。
这些洗涤剂通常为温和型非变性洗涤剂，例如CHS(胆甾醇半琥珀酸酯)或CHAPS(3-[3-胆酰胺丙基二甲氨)]-1-丙磺酸酯)，或具有足够低的浓度，以避免对所述蛋白的结构或生理学特性造成显著破坏。III.物理变体
本发明还涉及与IL-BKW抗原的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列的蛋白和肽。所述变体包括种的变体、多态变体或等位变体。
氨基酸序列同源性或序列相同性是通过优化残基配对确定的，如果必要，可根据需要引入缺口。另外参见Needleham等(1970)分子生物学杂志48：443-453；Sankoff等(1983)第一章，Time Warps，String著，和大分子：序列比较的理论和实践，Addison-Wesley，Reading，MA；和购自IntelliGenetics的软件包，Mountain View CA；以及Wisconsin遗传学计算机组，Madison，WI。在考虑到保守性置换时，序列相同性会发生改变。保守置换通常包括发生在下列组内的置换：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。这种保守性可应用于生物学特征，功能特征或结构特征。同源氨基酸序列通常包括在每一种相应蛋白序列中的天然多态性或等位和种间变异。典型的同源蛋白或肽与IL-BKW的氨基酸序列有25-100％的相同性(如果可以引入缺口的话)，至50-100％的相同性(如果包括保守置换的话)。相同性指标至少约为35％，一般至少约为40％，通常至少约为50％，典型的至少约为60％，常见的至少约为70％，优选至少约为80％，更优选至少约为90％。
可以通过核苷酸置换、核苷酸缺失、核苷酸插入和核苷酸片段的倒位对提取的IL-BKW DNA方便地进行修饰。这些修饰会产生新的DNA序列，这些DNA序列编码所述抗原、其衍生物、或具有类似生理学、免疫原性、抗原性或其它功能活性的蛋白。可将所述修饰序列用于产生突变型抗原或增强表达。增强的表达可能涉及基因扩增、增强的转录、增强的翻译、及其它机制。“突变型IL-BKW”包括落入上面所给出的序列相同性定义范围内的多肽，但其氨基酸序列有别于正常情况下天然存在的IL-BKW的序列，这种区别是通过缺失、置换、或插入产生的。这通常包括具有与序列2或6所示序列的蛋白有显著相同性的蛋白，并具有该序列所具有的各种生物学活性，例如，抗原性或免疫原性，而且在优选实施方案中，其含有所披露序列完整长度的大部分。尽管也可以使用其截短形式，但全长序列通常是优选的，类似地，存在于天然来源中的基因和蛋白通常是最理想的。类似地观念适用于不同IL-BKW蛋白，特别是存在于各种温血动物，例如哺乳动物和鸟类体内的蛋白。以上说明整体上是指包括所有IL-BKW蛋白，并非局限于这里所特别讨论的具体的小鼠实施方案。
IL-BKW诱变还可以通过实施氨基酸插入或缺失而完成。置换、缺失、插入或其任意组合形式均可用于产生最终的构建体。插入包括氨基-或羧基-末端的融合。可以对靶密码子进行随机诱变，而且可以筛选表达突变型的理想活性。在具有已知序列DNA中的预定位点进行置换突变的方法在本领域中是众所周知的，例如，通过M13引物诱变或聚合酶链式反应(PCR)技术。例如参见Sambrook等(1989)；Ausubel等(1987及增补)；和Kunkel等(1987)酶学方法154：367-382。
本发明还提供了重组蛋白，例如使用了源于这些蛋白的片段的异源融合蛋白。异源融合蛋白是这样的蛋白或片段的融合体：这些蛋白自然状态下通常不以相同的方式融合。类似的理论适用于异源核酸序列。
另外，可以通过结合来自其它蛋白的类似功能结构域产生新的构建体。例如，靶结合或其它片段可以在不同的新融合多肽或片段之间进行“交换”。例如，参见Cunningham等(1989)科学243：1330-1336；和O’Dowd等(1988)生物化学杂志263；15985-15992。
由Beaucage和Carruthers(1981)在Tetra.Letts.22：1859-1862中所披露的亚磷酰胺方法可以生产合适的合成DNA片段。双链片段通常可以通过合成互补的链，并让这些链在合适条件下一起退火而获得，或通过使用DNA聚合酶及适当的引物序列添加其互补链例如PCR技术而获得。
IX.功能变体
可以通过竞争抑制配体与其受体的结合而实现抑制IL-BKWs的生理学反应。初步的结果表明，IL-BKW不能与所述IL-10受体相同的亚基结合。预计，IL-BKW拮抗剂具有与IL-BKW相反的作用。
在本发明的体外实验中，通常要使用提取的蛋白，含有该蛋白的受体结合片段的可溶性片段，或与固相基质结合的片段。所述实验还可用于结合片段突变和修饰，或细胞因子突变和修饰，例如，IL-BKW类似物的效应的诊断测定。
本发明还涉及竞争性药物筛选实验的用途，例如，细胞因子或受体结合片段的中和抗体是否能竞争受试化合物。
IL-BKW抗原的“衍生物”包括天然存在形式的氨基酸序列突变型，糖基化变体，以及其它化学部分的共价或聚集聚合物。共价衍生物可以通过连接官能团和存在于IL-BKW氨基酸链上的基团或存在于N-或C-末端的基团而制备，例如用标准方法。例如，参见Lundblad和Noyes(1988)用于蛋白修饰的化学试剂，1-2卷，CRC出版社公司，Boca Raton，FL；Hugli(著)(1989)蛋白质化学技术，学术出版社，San Diego CA；和Wong(1991)蛋白质缀合和交联化学，CRC出版社，Boca Raton，FL。
具体地将，还包括糖基化变化，例如，通过在其合成和加工或在进一步的加工步骤中修饰其糖基化特征而进行改变。例如，参见Elbein(1987)生物化学年度综述56：497-534。还包括具有相同一级氨基酸序列的各种形式的肽，这些肽具有其它小的修饰，包括磷酸化氨基酸残基，例如，磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、或磷酸苏氨酸。
还提供了IL-BKWs和其它同源或异源蛋白的融合多肽。很多细胞因子受体或其它表面蛋白为多聚体，例如，同源双体，重复结构具有多种优点，包括降低受到蛋白裂解作用的倾向。典型的例子是诸如荧光素酶的报导多肽和一种蛋白的片段或功能域的融合体，所述片段如受体结合片段，因此，融合配体的存在和位置可以方便地确定。例如参见Dull等，US4,859,609。其它基因融合配偶体包括细菌β-半乳糖苷酶、trpE蛋白A、β-半乳糖酶、α-淀粉酶、乙醇脱氢酶、酵母α交配因子，以及诸如His6序列的FLAG序列的检测或纯化标记。例如，参见Godowski等(1988)科学241：812-816。
融合肽通常是通过重组核酸方法或通过合成多肽方法制备的。进行核酸操作和表达的技术一般披露于以下文献中，例如，参见Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册(第二版)，1-3卷，冷泉港实验室；和Ausubel等(著)(1993)当代分子生物学方法，Greenne和Wiley，NY。合成多肽的技术披露于以下文献中，例如，Merrifield(1963)美国化学家协会杂志85：2149-2156；Merrifield(1986)科学232：341-347；Atherton等(1989)固相肽合成：实验方法，IRL出版社，牛津；和Grant(1992)合成肽：使用者指南，W.H.Freeman，NY。折迭方法可用于合成蛋白。
本发明还涉及除氨基酸序列或糖基化变异以外的IL-BKW蛋白的衍生物的使用。所述衍生物可能涉及与化学成分或蛋白载体的共价或聚集结合。共价或聚集衍生物可以用作免疫源、用作免疫测定或纯化方法的试剂，所述纯化方法如用于结合配偶体的亲和纯化，所述配偶体如其它抗原。可以用本领域众所周知的方法通过与诸如溴化氰活化SETHAROSE的固相支持物共价结合的方式对IL-BKW进行固定，或将其吸附在聚烯烃表面上，有或没有戊二醛的交联，以便用于抗-IL-BKW抗体或其它结合组合物的测定或纯化。所述IL-BKW蛋白还可用一种检测基团标记，例如用于诊断测定中。IL-BKW的纯化可以通过固定化抗体或诸如一种受体的结合部分的互补结合配偶体实现。
本发明的可溶性IL-BKW或片段可以用作生产结合专一的抗血清或抗体的免疫源。纯化的抗原可用于筛选单克隆抗体或抗原结合片段，包括天然抗体的抗原结合片段，例如Fab、Fab′、(Fab)2等。还可将纯化的IL-BKW抗原用作一种试剂，用于检测由于较大量的细胞因子的存在而产生的抗体，这种现象可被诊断为异常或特殊生理学或疾病状态。本发明涉及针对由序列1或5所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列的抗体，或含有它的蛋白片段。具体地讲，本发明涉及对特殊功能域具有结合力或该功能域的抗体，例如螺旋A、B、C、D。
本发明涉及其它密切相关的种的变体的提取。Southern和Northern印迹分析将证实，在其它哺乳动物中存在类似的遗传实体。IL-BKWs很可能是广泛分布于种的变体中的，例如，啮齿类、兔类、食肉动物、偶蹄目、奇蹄目和，灵长类。
本发明还提供了分离一类相关抗原的方法，所述抗原在结构、表达和功能方面既具有特殊性，又具有相似性。其它独特种或多态型变体的分离和鉴定将会大大加快对所述分子的很多生理学作用的理解。具体地讲，本发明提供了用于鉴定不同物种中的其它同源遗传实体的探针。
所分离到的基因可用于转化缺乏IL-BKW表达的细胞，例如种型或缺乏相应蛋白并表现阴性的背景活性的细胞。这样，可以以与未转化的对照细胞比较的形式分析IL-BKW的功能。
只用现代分子生物学的标准技术，特别是通过比较相关种类的成员，得以解释理想由上述抗原介导的各种生理学功能的关键结构元件。例如，参见由Cunningham等(1989)在科学243：1339-1336中所披露的同系物扫描诱变技术；以及由O’Dowd等(1988)在生物化学杂志263：15985-15992中所披露的方法；以及Lechleiter等(1990)EMBO杂志9：4381-4390。
细胞内功能可能涉及受体的信号传导。不过，在某些情况下有可能发生蛋白内化，而且可能发生细胞内成分和细胞因子之间的相互作用。可以通过诱变或诸如交联或亲和方法的直接生化方法决定IL-BKW与相互作用成分的特定片段。还可以采用由晶体学或其它物理学方法进行结构分析。对信号传导的机制所作的进一步研究包括对结合成分的研究，所述成分可以通过亲和方法或通过诸如突变型的互补分析的遗传学方法进行分离。
还要对IL-BKW的表达和控制作进一步的研究。与所述抗原相关的控制元件可表现出分化方面的生理学、发育、组织特异性、或其它表达特征。诸如控制元件的上游或下游遗传片段是值得关注的。
对IL-BKW抗原所作的结构研究会导致设计出新的抗原，特别是对所述分子具有兴奋或拮抗特性的类似物。可将该方法与前文所述的筛选方法结合，以分离具有所期望的活性特征的抗原。V.抗体
可以制备针对IL-BKW蛋白的各种表位的抗体，包括种的变体、多态变体、或等位变体，及其片段，所述抗体包括其天然存在形式和重组形式。另外，可以制备活性形式或失活形式的针对IL-BKWs的抗体，包括其天然或变性形式。还涉及抗独特型抗体。
包括结合片段和单链形式的抗所述抗原的预定片段的抗体可以这样制备：从该片段和免疫源蛋白的缀合物接种动物。单克隆抗体是由能分泌所需要的抗体的细胞制备的。可以筛选所述抗体结合正常或缺陷型IL-BKWs的能力，或筛选其激动剂或拮抗剂活性，例如，通过一种受体介导的活性。受体可以是激动剂或拮抗剂，例如，通过从空间上抑制与受体的结合。单克隆抗体通常通过与至少1μM的Kd结合，更常见至少约300μM，典型为至少约100μM，更典型至少约30μM，优选至少约10μM，更优选至少约3μM或更佳。
本发明的抗体还可应用于诊断目的。作为捕捉或非中和抗体，将其用于筛选与抗原结合的能力，而又不会抑制与受体的结合。作为中和抗体，可将其用于竞争结合测定。还可将其用于检测或量化IL-BKW蛋白或其受体。例如参见Chan(著)(1987)免疫学：实践指南，学术出版社，Orlando，FLA，Price和Newman(著)(1991)免疫测定原理及实践，Stockton出版社，N.Y.；和Ngo(著)(1988)非同位素免疫测定，Plenum出版社，N.Y.交叉吸收或其它测试方法可以鉴定具有各种特异性特征的抗体，例如，特有的或共有种的特异性。
本发明的包括抗原结合片段在内的抗体可以是有效的拮抗剂，该拮抗剂能与抗原结合，并抑制其功能性结合，例如抑制与能引起生物学反应的受体结合。还可将其用作非中和抗体，并可以与毒素或放射性核素耦联，以便在该抗体与抗原结合时在表面表达它的细胞被杀死。另外，可以通过接头的方式直接或间接与药物或其它治疗剂缀合，并可以实施靶向给药。
抗原片段可以与其它材料特别是多肽结合，作为融合的或共价结合的多肽用作免疫源。抗原和其片段可以和诸如匙孔嘁血兰蛋白、牛血清白蛋白、破伤风类毒素等的各种免疫源融合或共价连接。参见微生物学，Hoeber医学部，Harper和Row，1969；Laandsteiner(1962)血清学反应特异性，Dover出版社，纽约；Williams等(1967)免疫学和免疫化学方法第一卷。学术出版社，纽约；和Harlow和Lape(1988)抗体：实验室手册，CSH出版社，N.Y.，这些文献中有关制备多克隆抗血清方法的说明。
在某些场合下，需要从诸如小鼠、啮齿类、灵长类、人类等的各种哺乳宿主中制备单克隆抗体。制备这种单克隆抗体的技术的说明可以从以下文献中找到，例如，Stites等(著)基础和临床免疫学(第4版)Lange医学出版社，Los Altos，CA，以及本文所引用的参考文献；Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册，CSH出版社，Goding(1986)单克隆抗体；原理和实践(第2版)，学术出版社，纽约；特别参见Kohler和Milstein(1975)在自然256：495-497中的著述，该文献披露了一种制备单克隆抗体的方法。
其它合适的技术包括在体外让淋巴细胞与所述抗原多肽接触，或者在噬菌体或类似载体中选择抗体的文库。参见Huse等(1989)“在Lambda噬菌体中产生免疫球蛋白所有组成成分的组合文库”，科学246：1275-1281和Ward等(1989)自然341：544-546。本发明的多肽和抗体可以包括修饰或未作修饰地加以使用，包括嵌合或人源化抗体。通常，所述多肽和抗体可以通过与一种物质共价或非共价结合进行标记，所述物质可以产生一种可检测信号。有多种标记和结合技术是众所周知的，而且这类技术大量披露于科技和专利文献中。合适的标记物包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、或抑制剂、荧光成分、化学发光成分、磁性粒子等。披露了所述标记物的用途的专利包括美国专利US3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。另外，可以生产重组免疫球蛋白，参见Cabilly的美国专利US4,816,567，Moore等，US4,642,334和Queen等(1989)美国国家科学院院报86：10029-10033。
本发明的抗体还可用于分离所述蛋白的亲和层析方法。可以制备让所述抗体和一种固体支持物结合的柱。例如，参见Wilchek等(1984)酶学方法104：3-55。
所制备的抗每一种IL-BKW的抗体还可用于制备抗独特型抗体。这些抗体可被用于检测或诊断与不同的抗原表达相关的各种免疫学症状。VI.核酸
所述肽序列和相关试剂可用于检测、分离、或鉴定编码IL-BKW的DNA克隆，例如源于天然来源的IL-BKW。通常，将其用于分离源于哺乳动物的基因，并可将类似方法用于分离源于其它物种的基因，例如，温血动物，如鸟类和哺乳动物。交叉杂交可用于从相同的来源中，例如多态变体或其它物种中分离IL-BKW。多种不同方法可用于成功地分离合适的核酸克隆。
纯化的蛋白或特定的肽可用于通过上述标准方法制备抗体。可将合成肽或纯化蛋白层递该免疫系统，以制备单克隆或多克隆抗体。例如参见Coligan(1991)现代免疫学方法Wiley/Greene；和Harlow和Lane(1989)抗体：实验室手册，冷泉港出版社。
例如，可将特异结合组合物用于筛选由能表达一种IL-BKW细胞系制备的表达文库。细胞内表达的筛选可以通过各种染色或免疫荧光方法进行。可将结合组合物用于亲和纯化或筛选能表达表面融合蛋白的细胞。
所述肽片段还可以用于预测适于筛选一种文库的寡核苷酸。其遗传密码可被用于筛选可用作筛选的探针的合适的寡核苷酸。例如参见序列1或5。通过与聚合酶链式反应(PCR)技术结合，可将合成寡核苷酸用于从文库中选择合适的克隆。还可将互补序列用作探针、引物、或反义链。各种片段都特别适用于诸如与锚锭载体结合或与poly-A互补PCR技术结合或与其它肽的互补DNA结合。
本发明涉及将分离的DNA或片段用于编码一种具有生物学活性的相应的IL-BKW多肽，特别是缺少编码所述序列的非翻译的5’部分的多肽。另外，本发明包括编码具有生物学活性的蛋白或多肽的分离的或重组DNA，该DNA能在适当条件下与本文所披露的DNA序列杂交。所述生物学活性蛋白或多肽可以是完整的抗原或片段，并具有披露于诸如序列2或6中的氨基酸序列，特别是序列6所示的成熟肽，或序列2所示的分泌性成熟多肽。另外本发明包括分离的或重组DNA或其片段的用途，所述DNA所编码的蛋白与分泌性IL-BKW具有高的相同性。分离的DNA可以具有对于5’和3’旁侧的不同的调节序列，例如，启动子，增强子，poly-A加尾信号及其它。
“分离的”的核酸是一种诸如RNA、DNA或混合聚合物的核酸，该核酸基本上与和天然序列天然相伴的其它成分分离，所述天然相伴成分如源于其起源物种的核糖体、聚合酶、和/或旁侧基因组序列。该术语包括已从其天然存在的环境中分离的核酸序列，并包括重组或克隆的DNA分离物，和化学合成类似物或通过异源系统生物合成的类似物。大体上纯的分子包括该分子的分离形式。一般，核酸为小于大约50Kb的载体或片段形式，通常小于大约30Kb，典型的小于大约10Kb，优选小于大约6Kb。
分离的核酸一般是分子的均质组合物，不过，在某些实施方案中，可含有微小的异质性。该异质性通常存在于对所希望的生物学功能或活性不重要的聚合物末端或部分。
“重组”核酸是通过其生产方法或其结构定义的。就其生产方法而言，例如，通过使用重组核酸技术的方法而制备的产物，例如，人通过选择或生产介入核苷酸序列。另外，它还可以是通过制备包括两种片段的融合体而制成的核酸，所述两个片段不是天然相互连接的，但其排除了天然产物，例如天然存在的突变体。因此，诸如由通过任何非天然存在载体转化细胞而制备的产物都包括在内，例如含有用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的核酸。该方法常被用于用编码相同或保守氨基酸的丰余密码子取代密码子，而通常引入或除去一个序列识别位点。
另外，还可以将具有所希望的功能的核酸片段连接在一起，以产生一种单一的遗传实体，该实体包括正常情况下不以天然形式存在的功能的组合。限制酶识别位点，通常是所述人工操作的靶位，不过还可以通过设计引入诸如启动子、DNA复制位点、调节序列、控制序列或其它有用特征的其它位点专一性靶位。类似的观念也可用于重组型，例如融合体、多肽。特别包括合成核酸，该核酸通过遗传密码丰余性编码类似于所述抗原的片段的多肽，以及源于各种不同物种或多态变体的序列的融合体。
核酸含义范围内的大的“片段”，是指至少具有大约17个核苷酸的连续片段，一般至少约有22个核苷酸，正常至少约有29个核苷酸，更常见至少约有35个核苷酸，典型至少约有41个核苷酸，通常至少约有47个核苷酸，优选至少约有55个核苷酸，而在特别优选的实施方案中，至少约有60或更多个核苷酸，例如67、73、81、89、95等。
编码一种IL-BKW蛋白的DNA特别适用于鉴定编码相关或类似蛋白的基因，mRNA和cDNA，以及编码源于不同物种的同源蛋白的DNAs。在包括灵长类、啮齿类、犬类、猫类和鸟类在内的其它物种中很可能存在同系物。各种IL-BKW蛋白应当是同源的，本发明包括这些蛋白。不过，在合适的条件下用所述序列可以方便 地分离甚至是与所述抗原具有更远源的进化关系的蛋白，如果该蛋白与其具有足够高的同源性的话。灵长类IL-BKW蛋白是特别有价值的。
源于基因组序列，例如含有内含子的重组克隆有用于转基因研究，例如，包括转基因细胞和生物，以及基因治疗。例如，参见Joodnow(1992)“转基因动物”，见Roitt(著)免疫学百科全书，学术出版社，San Diego pp.1502-1504；Trayis(1992)科学256：1392-1394；Kunuhn等(1991)科学254：707-710；Capecchi(1989)科学244：1288；Robertson(1987)(著)畸胎癌和胚干细胞：实践方法，IRL出版社，牛津；和Rosenberg(1992)临床肿瘤学杂志10：180-199。
在进行核酸序列比较时所说的基本上同源性，例如相同的，是指对所述片段或其互补链进行比较时是相同的，前提是进行合适的排列，并具有适当的核苷酸插入或缺失，插入或缺失至少大约50％的核苷酸，一般至少约58％，正常至少约65％，通常至少约71％，典型至少约77％，常见至少约85％，优选至少约95-98％或更高，在特别优选的实施方案中，可高达至少约99％或更多的核苷酸。另外，一般在将IL-BKW的序列，例如序列1或5所示序列用于杂交时，该片段能在选择性杂交条件下与一个链或其互补链杂交的话则存在基本的同源性。通常，如果在一段至少约有30个核苷酸的片段上存在至少约55％的相同性，则会发生选择性杂交，优选在一段大约25个核苷酸的片段上有至少约75％的相同性，最优选在一段大约20个核苷酸的片段上有至少约90％的相同性，参见Kanehisa(1984)核酸研究12：203-213。如上文所述，相同性比较的长度可以在较长的片段上进行，在某些实施方案中，可以在至少约有17个核苷酸的片段上进行，一般在至少约有28个核苷酸的片段上进行，典型在至少约有40个核苷酸的片段上进行，优选在至少约有75-100或更多的核苷酸的片段上进行。
就杂交同源性而言的严格条件，是指盐、温度、有机溶剂、及其它参数的严格的综合条件，通常是指在杂交反应中所控制的条件。严格的温度条件一般包括超过大约30℃的温度，一般为超过大约37℃，典型为超过大约55℃，优选超过大约 70℃。严格的盐的条件一般为低于大约1000mM，通常低于大约400mM，典型低于大约250mM，优选低于大约150mM，包括大约100、50、或者甚至是20mM。不过，参数的组合要远比任何一个参数的具体指标重要。例如，参见Wepmur和Davidson(1968)分子生物学杂志31：349-370。
可以通过亲源关系较近的物种间的交叉杂交克隆并分离源于其它哺乳动物物种的IL-BKW。远源物种间的同源性可能较低，因此亲源物种间的杂交是可取的。另外，制备具有较低的种的特异性的抗体制备物，可用于表达克隆方法。Vii.制备IL-BKW；模拟物
可以通过化学合成，筛选cDNA文库，或筛选各种细胞系或组织样品制备的基因组文库获得编码IL-BKW或其片段的DNA。例如，参见Okayama和Berg(1982)分子细胞生物学2：161-170；Gubler和Hoffman(1983)基因25：263-269和Glover(著)(1984)DNA克隆：实践方法，IRL出版社，牛津。另外，本发明所提供的序列提供了有用的PCR引物或可用于编码IL-BKW的合适基因的合成或其它制备；包括天然存在的实施方案。
该DNA可以在多种宿主细胞中表达，用于合成全长IL-BKW或片段，所合成的片段又可用于例如，制备多克隆或但克隆抗体；用于结合研究；用于修饰分子的构建和表达；并用于结构/功能研究。
本文所说的载体包括质粒、病毒、噬菌体、可整合的DNA片段、以及其它能将DNA片段整合到宿主基因组中的载体。例如参见Pouwels等(1985及增补)克隆载体：实验室手册，Elsevier，N.Y.；和Rodriguez等(1988)(著)载体：分子克隆载体及其使用概览，Buttersworth，Boston，MA。
对本发明而言，将在功能上相互关联的DNA序列可操作地连接在一起。例如，将编码前序列或分泌前导序列DNA可操作地与一个多肽连接，如果该DNA是作为一种前蛋白表达或参与引导所述多肽至细胞膜或参与所述多肽的分泌的话，将一个启动子可操作的与一个编码序列连接，如果该启动子控制所述多肽转录的话；将一个核糖体结合位点可操作地与一个编码序列连接，如果其位置容许翻译的话。通常，可操作地连接是指连续的，而且是符合读框的，不过，诸如抑制基因的某些遗传元件是不连续地连接的，不过，它仍然能结合于操纵子序列，这种结合反过来又可控制表达。例如参见Rodriguez等，第10章，pp.205-236；Balbas和Bolivar(1990)酶学方法185：14-37；和Ausubel，等(1993)现代分子生物学方法，Greene和Wiley，N.Y.。
合适的表达载体的典型例子包括pCDNA；pCD，参见Okayama等(1985)分子细胞生物学5：1136-1142；pMcneo Poly-A，参见Thomas等(1987)细胞51：503-512；和诸如pAC373或pAC510的杆病毒载体。例如参见Miller(1988)微生物学年度综述42：177-199。
通常需要在一种能提供特殊的或特定的糖基化特征的系统中表达IL-BKW多肽。例如，Luckow和Summers(1988)生物技术6：47-55；和Kaufman(1990)酶学方法185：487-511。
可以对IL-BKW或其片段进行工程操作，通过磷脂酰肌醇(PI)与细胞膜连接，但可以通过用诸如磷脂酰肌醇磷脂酶-C的磷脂酰肌醇裂解酶处理将其从膜上除去。由此可释放出生物学活性形式的抗原，并可以通过蛋白质化学的标准方法纯化。例如，参见Low(1989)Biochim.Biophys.Acta988：427-454；Tse等(1985)科学230：1003-1008；和Brunner等(1991)细胞生物学杂志114：1275-1283。
现在已鉴定了IL-BKW，其片段或衍生物可以通过合成肽的常规方法制备。这些方法包括诸如披露于以下文献中的方法：Stewart和Young(1984)固相肽合成，Pierce化学公司，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky(1984)肽合成实践，Springer-Verlag，纽约；Bodanszky(1984)肽合成原理，Springer-Verlag，纽约和Villafranca(著)(1991)蛋白质化学技术II，学术出版社，San Diego，CA。Viii.用途
本发明提供了可用于诊断目的的试剂，如在本文的其它部分所披露的试剂，例如，IL-BKW介导的条件下，按照诊断试剂盒的说明进行。
本发明还提供了具有显著的治疗效果的试剂。IL-BKW(天然存在的或重组的)、其片段、及其抗体以及被确定为具有IL-BKW的结合力的化合物可被用于治疗与异常生理学或发育相关的症状，包括炎性症状。具体地讲，通过用本发明所提供的组合物进行适当的治疗处理可以实现对淋巴细胞的生理学的调节。例如，与由IL-BKW引起的异常表达或异常信号传导相关的疾病或异常可以作为激动剂或拮抗剂的目标。这种新的细胞因子可在调节或产生诸如淋巴细胞的造血细胞方面起作用，它可以影响免疫反应，例如炎症和/或自身免疫疾病。
具体地讲，所述细胞因子可以各种形式介导细胞的细胞因子合成、增殖等。例如，在包括类风湿关节炎、系统红斑狼疮(SLE)、Hashimoto’s自身免疫甲状腺炎、以及诸如炎性肠道病的急性和慢性炎性反应在内的炎性或自身免疫反应情况下，IL-BKW的拮抗剂，如天然形式IL-BKW的突变蛋白变体或抑制抗体可以提供抑制免疫反应的选择性和有效的途径。同样参见Samtert等(著)免疫学疾病第1和2卷，Little，Brown&公司。例如，在移植排斥的情况下，可通过天然存在的分泌形式的IL-BKW或通过抑制抗体调节细胞因子释放，可以通过本发明所提供的试剂进行调节，所述天然存在的分泌形式的IL-BKW可以通过重组方法大量生产。
另外，某些组合物可用于与其它发炎调节剂组合。所述其它分子可以包括类固醇、其它形式的IL-10、包括细胞种的变体、或病毒IL-10s，例如，EBV或EHV，及其所有不同的拮抗剂。
通过Northern印迹分析证实，在每一种类型细胞中所发生的各种异常症状，会产生IL-BKW mRNA。参见Berkow(著)Merck诊断和治疗手册，Merck & 公司，Rahway，N.J.；Thorn等Harrison’s内科医学原理，McGraw-Hill，N.Y.；和Weatherall等(著)牛津医学教材，牛津大学出版社，牛津。很多其它医学症状和疾病涉及由巨噬细胞或单核细胞进行的激活，而且其中的很多会对由本发明所提供的激动剂或拮抗剂进行的处理作出反应。例如，参见Stites和Terr(著)(1991)基础和临床免疫学，Appleton和Lange，Norwalk，康列迪格和Samter等(著)免疫疾病Little，Brown和公司。上述疾病问题应当对用本发明所提供的组合物进行的预防或治疗敏感。
可以纯化IL-BKW、拮抗剂、抗体等，然后再给兽类或人类患者服用。为了治疗目的，可将上述试剂与其它活性或惰性成分混合，例如，混入常规的可以药用的载体或稀释剂中，例如免疫原佐剂，以及生理学上无害的稳定剂、赋形剂、或防腐剂。可以对所述组合物进行无菌过滤，并通过在计量安培瓶中冻干将其作成剂型，或储存于稳定化含水制剂中。本发明还涉及抗体或其结合片段的使用，包括其非补体结合形式。
可以用IL-BKW进行药物筛选，以鉴定对IL-BKW具有结合力或对IL-BKW的功能有其它相关生物学影响的化合物，包括分离相关的成分。随后可将生物学测定用于测定该化合物是否具有内在的促进活性，以及因而是一种抑制剂或拮抗剂，即它能抑制细胞因子的活性。类似地，具有内在刺激活性的化合物可以激活信号途径，因此，它是一种激动剂，即它能促进IL-BKW的活性。本发明还涉及将IL-BKW的抑制抗体用作拮抗剂和将促进抗体用作激动剂的治疗用途。该方法特别适用于与其它IL-BKW种的变体一起使用。
另外，IL-BKW可以在白血病生成或在由诸如HTLV和疱疹病毒引起的病毒感染中发生作用。这种作用是由saimiri疱疹病毒感染所引起的。疱疹病毒还编码细胞因子IL-17(CTLA-8)的同系物。因此，可将细胞因子或拮抗剂用于抗肿瘤治疗。所述病毒相关性可能表明，该细胞因子可能在病毒感染或增殖过程或肿瘤学过程中起着重要作用，例如，作为癌症或白血病的’癌变转化和增殖症状。例如，参见Thorn等Harrison’s内科医学原理，McGraw-Hill，N.Y.。
另外，所述细胞因子似乎是在肾细胞中表达，并且可能在该器官的功能中起着重要作用，例如离子交换或血压调节。该细胞因子还可以具有重要的水平衡功能。该细胞因子似乎在肾脏中具有一定程度的表达。
进行有效治疗所需要的试剂量取决于诸多不同因素，包括服用方法、靶位点、患者的生理学状态、以及其它服用的药物。因此，要对治疗剂量进行滴定，以便优化安全性和效力。通常用于体外治疗的剂量可以为用于原位服用这种试剂的量提供有用的指导。为治疗特定疾病所做的动物有效剂量实验可以为用于人的剂量提供进一步的预计性指导。在以下文献中披露了各种因素，例如，参见Gilman(著)(1990)Goodman和Gilman’s：治疗的药理学基础，第8版，Pergamon出版社；和Remington’s药物科学，第17版(1990)Mack出版公司，Easton，Penn。在本文的以下部分披露了服用方法，例如用于口服、静脉注射、腹膜内注射或肌内注射、透皮扩散、及其它方法。药理学上可以接受的载体可以包括水、生理盐水、缓冲液、以及披露于诸如Merck Index，Merck &公司，Rahway，新泽西中的其它化合物。通常，和一种合适的载体使用时剂量范围预计低于大约1mM的浓度，典型地低于大约10μM的浓度，一般低于大约100mM，优选低于大约10pM(皮摩尔)，最优选低于大约1fM(飞摩尔)。缓释制剂或缓释装置通常被用于连续或长期给药。例如，参见Langer(1990)科学249：1527-1533。
可以给接受治疗的宿主直接服用IL-BKW、其片段和它的抗体或其片段、拮抗剂和激动剂，或者根据该化合物的大小可能需要将其与诸如卵清蛋白或血清白蛋白的载体缀合，然后再服用。治疗制剂可以多种常见剂量制剂形式服用。尽管可以单独服用活性成分，不过优选以药物制剂的形式存在。制剂通常含有至少一种如上文所述的活性成分，同时含有一种或几种可以接受的它的载体。从与其它成分的相溶性方面讲，每一种载体都应当是药理学上和生理学上可以接受的，而且不会伤害患者。试剂包括适用于口服、直肠服用、鼻腔服用、表皮服用、或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉和经皮)服用。所述制剂通常可以单位剂量形式存在，并可以通过药学领域众所周知的任一种方法制备。例如，参见Gilman等(著)(1990)Goodman和Gilman’s：治疗的药理学基础，第8版，Pergamon出版社；和Remington’s药物科学，第17版(1990)Mack出版公司，Easton，Penn.；Avis等(著)(1993)药物剂型：肠胃外药疗法，Dekker，纽约；Lieberman等(著)(1990)药物剂型：片剂，Dekker，纽约；和Lieberman等(著)(1990)药物剂型：分散系统，Dekker，纽约。本发明的疗法可以与其它制剂结合或与所述其它制剂结合使用，例如其它类型的IL-10s，或其各种拮抗剂。
本发明的天然存在的或重组形式IL-BKWs都特别适用于试剂盒或测定方法中，所述试剂盒和测定方法能够筛选对所述蛋白具有结合活性的化合物。近几年已发展起来若干种自动测定方法，可以在短时间内对数以万计的化合物进行筛选。例如，参见Fodor等(1991)科学251：767-773，该文披露了通过合成于固相基质上的多种特定聚合物测定结合力的方法。合适测定方法的开发可大大促进由本发明所提供的大量纯化、可溶性IL-BKW的可获得性。
可将其它方法用于确定IL-BKW-IL-BKW受体相互作用中的关键残基。为了确定对相互作用和/或信号传导重要的特定残基，可以进行突变分析，例如参见Somoza等(1993)J.Exttl.Med.178：549-558。不过，存在于A和D螺旋中的残基可能对于受体相互作用最为重要。
例如，正常情况下一旦确定了抗原的结构，例如通过四级结构数据确定，就可以发现拮抗剂。由于使用纯化IL-BKW的高度自动化测定方法的发展有可能测试潜在的相互作用类似物。具体地讲，通过使用本文所披露的筛选技术，可以发现新的激动剂或拮抗剂。特别重要的化合物是对一类IL-BKW具有综合结合能力的化合物，例如，可用作IL-BKW的种的变体的拮抗剂的化合物。
药物筛选的一种方法使用表达IL-BKW的重组DNA分子稳定转化过的真核或原核宿主细胞。可以提取表达与其它分子分离的IL-BKW的细胞。这些细胞为活性或固定形式，可将其用于标准结合方式的结合测定。同样参见Parce等(1989)科学246：243-247；和Owicki等(1990)美国国家科学院院报87：4007-4011，该文献披露了检测细胞反应的灵敏方法。
用于药物筛选的另一种包括一种提供了进行高通量筛选的方法，用于筛选对IL-BKW具有适当结合力的化合物，该技术详细披露于Geysen的欧洲专利申请84/03564中，公开日为1984年9月13日。首先，将大量的不同的小的肽类测试化合物合成于诸如塑胶针的固体基质上或其它适当表面上，参见Fodor等(1991)。然后让所有的针与溶解的未纯化的或溶解的纯化的IL-BKW反应，并洗涤。下一步涉及检测结合的IL-BKW。
合理化药物设计还可以基于对IL-BKW及其它效应物或类似物的分子形状的结构研究进行。效应物还可以是在结合反应中介导其它功能的其它蛋白或正常情况下与IL-BKW相互作用的蛋白，例如一种受体。用于测定哪一个位点与特定的其它蛋白相互作用的一种方法是物理结构测定，例如X射线晶体学或二维核磁共振技术。这会提示人们哪一个氨基酸残基会形成分子接触区，并作为模型，例如抗细胞IL一10的接触区。有关蛋白结构测定的详细说明请参阅Blundell和Johnson的著述(1976，蛋白质晶体学，学术出版社)。
IX.试剂盒
本发明还涉及将IL-BKW蛋白、其片段、肽、及其融合产物用于检测另一种IL-BKW或结合配偶体存在的多种诊断试剂盒和方法中的用途。通常所述试剂盒具有一个腔室，该腔室装有一种特定的IL-BKW肽或基因片段或一种试剂，它能识别一种或另一种化合物，例如IL-BKW片段或抗体。
用于测定一种测试化合物对IL-BKW的结合力的试剂盒通常包括一种测试化合物；一种标记化合物，例如一种结合配偶体或具有已知的对IL-BKW的结合力的抗体。一种IL-BKW源(天然存在的或重组的)；以及一种把结合物和游离标记化合物分离开的方法，如用于固定所述分子作固相。一旦对化合物进行筛选，即可用本领域众所周知的合适的生物学测定方法，测定具有对所述抗原的合适结合力的化合物，以便测定其是起着IL-BKW信号传导途径的激动剂或是拮抗剂的作用。所得到的重组IL-BKW多肽还提供了用于校正所述测定的明确的标准品。
一种用于测定诸如IL-BKW在样品中的浓度的优选试剂盒通常包括一种标记化合物，例如一种结合配偶体或抗体，它具有已知的对所述抗原的结合力，一种细胞因子源(天然存在的或重组的)以及一种用于把结合物和游离标记化合物分开的方法，如用于固定所述IL-BKW作固相。通常要提供装有试剂的腔室和说明书。
对IL-BKW或其片段专一的抗体，包括抗原结合片段可被用于诊断目的，以便检测较高水平的IL-BKW和/或其片段的存在。所述诊断测定可以使用裂解物、活细胞、固定细胞、免疫荧光、细胞培养物、体液，而且还可能涉及检测与血清中的抗原相关的抗原，或其它物质。诊断测定可以是均相的(无分离游离试剂和抗原结合配偶体复合物的步骤)或异相的(有分离步骤)。存在着各种商用测定方法，如放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸收测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、酶-放大免疫测定技术(EMIT)、底物-标记荧光免疫测定(SLFIA)等。例如，参见Van Vunakis等(1980)酶学方法70：1-525；Harlow和Lane(1980)抗体：实验室手册，CSH出版社，NY；和Coligan等(著)(1993)现代酶学方法，Greene和Wiley，NY。
抗独特型抗体用于诊断抗IL-BKW抗体存在的相似用途，并可以诊断各种异常症状。例如IL-BKW的过量生产会导致各种免疫学反应的出现，这种反应可以诊断为异常生理学症状，特别是在诸如癌或异常活化或分化的增殖细胞状态下。
通常，用于诊断测定的试剂是以试剂盒的形式提供，以便优化该测定的灵敏度。对本发明而言，根据测定的性质、方法以及标记，提供了标记过的或未标记过的抗体或结合配偶体、或标记过的IL-BKW。所述材料通常是与其它添加剂，如缓冲液、稳定剂、产生信号所必需的材料结合的，如酶的底物等等。优选地，所述试剂盒还含有指导正确使用和在使用以后处理其内含物的说明书。通常，该试剂盒具有用于每一种试剂的腔室。优选地，所述试剂是以冻干粉末形式提供，而所述试剂可以重构于含水介质中，以形成适当浓度的试剂，用于实施所述测定。
上述药物筛选和诊断测定成分的很多种都可以不加修饰地使用，或以不同方式进行修饰。例如，可以通过共价或非共价结合一种成分的方式进行标记，该标记分子直接或间接提供一种可检测信号。在所述的任一种测定中，结合配偶体、测试化合物、IL-BKW或其抗体可以进行直接或间接标记。可以进行的直接标记包括下列一组：诸如碘I125放射性标记、酶(US专利号3,645,090)诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶，这些荧光标记物能监测荧光强度、波长位移或荧光极性方面的变化和荧光标记物(US专利号3,940,475)，进行间接标记的可行方案包括将一种成分生物素化，然后将其与和上述标记基团之一结合的抗生物素蛋白结合。
存在着多种把结合物和游离的IL-BKW分开的方法或把结合物与游离的测试化合物分开的方法。可将IL-BKW固定在各种基质上，然后洗涤。合适的基质包括诸如ELISA板、滤膜和凝珠的塑料制品。例如参见Coligan等(著)(1993)现代免疫学方法，第一卷，第二章。Greene和Wiley，NY。其它合适的分离技术包括但不限于披露于Rattle等(1984)临床化学30：1457-1461中的荧光素抗体磁化粒子方法，和披露于US专利号4,659,678中的双抗体磁性粒子分离方法。
用于将蛋白或其片段与各种标记物连接的方法在文献中有大量记载,因此在这里无须详细讨论。很多种技术包括使用活化羧基基团，通过使用碳二亚胺或活性酯以生成肽键，通过巯基基团与诸如氯乙酰活化卤反应生成硫醚，或诸如马来酰亚胺的活化烯烃，将其用于连接等等。还可将融合蛋白用于上述目的。
本发明的另一个诊断方面涉及源于IL-BKW序列的寡核苷酸或多核苷酸序列的使用。这些序列可被用于检测获自患者的样品中IL-BKW水平的探针，所述患者被怀疑患有异常症状，例如发炎或自身免疫病。由于细胞因子可能是一种用于活化的标记物或介质，可将其用于测定活化细胞数量，以确定诸如何时需要进行另外的治疗，例如在开始显现效果并逐渐变得显著之前以预防的方式进行治疗。RNA和DNA核苷酸序列的制备、序列的标记、以及该序列的优选大小在文献中有大量的说明和讨论。例如，参见Langer-Safer等(1982)美国国家科学院院报79：4381-4385；Caskey(1987)科学236：962-967和Wilchek等(1988)分析生物化学171：1-32。
还提供了用于检测其它分子的定性或定量表达的诊断试剂盒。诊断或预定可取决于用作标记的多种指标的组合。因此，试剂盒可以测试标记物的组合。例如，Viallet等(1989)生长因子研究进展1：89-97。还可将其它试剂盒用于评价其它细胞亚型。X.提取IL-BKW受体
由于提取到具有特定配体-受体相互作用的配体，因而存在用于提取所述受体的方法。参见Gearing等(1989)EMBO杂志8：3667-3676。例如，可以确定标记IL-BKW细胞因子的方法，该方法不会影响与它的抗体的结合。例如，可将一种亲和标记物与所述配体的氨基末端或羧基末端融合，不过就IL-10来说，与氨基末端融合更容易取得成功。所述标记物可以是FLAG表位标记，或诸如Ig或Fc结构域。可以筛选一种表达文库对所述细胞因子的特异结合性，例如，通过细胞分选或其它筛选测定能表达所述结合成分的亚群。例如，参见Ho等(1993)美国国家科学院院报90：11267-11271；和liu等(1994)免疫学杂志152：1821-29。另外，可以使用淘选方法，例如，参见Seed和Auffo(1987)美国国家科学院院报84：3365-3369。
使用标记物的蛋白交联技术可用于提取IL-BKW细胞因子结合配偶体。这种方法可以鉴定能与所述细胞因子有特异相互作用，例如，以配体-受体样方式相互作用的蛋白。
所进行的初步实验是为了确定已知IL-10R是否参与了对IL-BKW。很有可能的是，功能性IL-10受体复合体拥有IL-BKW受体复合体的很多或全部成分，或者是特异受体亚基或辅助受体亚基。
对本领域技术人员来说，显而易见的是可以在不超出本发明构思和范围的前提下对其进行改进和改变。本文所披露的具体实施方案仅仅是以举例的形式提出的，本发明仅由所述权利要求限定其范围，同时包括等同于所述权利要求的所有范围。
实施例一般方法
披露或参考某些标准方法，例如，Maniatis(1962)分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港出版社；Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册(第二版)第1-3卷，CSH出版社，NY；Ausubel等，生物学，Greene出版协会，Brooklyn NY或Ausubel等(1987及增补)现代分子生物学方法，Greene和Wiley，N.Y.；Innis等(著)(1990)PCR方法：方法和应用指南，学术出版社N.Y.。进行蛋白纯化的方法包括诸如硫酸铵沉淀、柱层析、电泳、离心、结晶等的方法。例如，Ausubel等(1987和定期增补)；Deutscher(1990)“蛋白纯化指南”，见酶学方法，第182卷，以及该系列的其它卷本；以及由生产商提供的说明如何使用蛋白纯化制品的资料，例如Pharmacia，Piscataway，N.j.，或Bio-Rad，Richmond，CA。与重组技术的结合可用于与适当的片段融合，例如与FLAG序列或等同序列融合，所述序列可以通过一个蛋白酶可去除的序列融合。例如参见Hochuli(1989)化学工业12：69-70；Hochuli(1990)“用金属螯合吸附纯化重组蛋白”见Setlow(著)遗传工程，原理和方法12：87-98，Plenum出版社，N.Y.；和Clowe等(1992)OIAexpreSS：高水平表达和蛋白纯化系统QUIAGEN公司，Chatsworth，CA。细胞培养技术披露于Doyle等(著)(1994)细胞和组织培养；实验室方法，John Wiley和Sons，NY中。
标准免疫技术披露于以下文献中，例如，参见Hertzenderg等(著1996)Weir’s实验免疫学手册，第1-4卷，Blackwhile Science；Coligan(1991)现代免疫学方法，Wiley/Greene，NY；以及酶学方法，第70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163卷。
FACS分析披露于以下文献中，参见Melamed等(1990)流式细胞术及分选Wiley-Liss公司，纽约，NY；Shapiro(1988)实用流式细胞术Liss，纽约，NY；和Robinson等(1993)流式细胞术方法手册，Wiley-Liss，纽约，NY。合适试剂的荧光标记可以用标准方法进行。实施例1：克隆人和小鼠IL-BKW
通过常规Ficoll梯度液，用健康人血供体制备PBMC，例如，应用披露于Coligan等现代免疫学方法，Greene/Wiley的方法，对源于所述制备物的细胞，优选为单核细胞进行刺激，例如用PHA。将源于所述活化单核细胞的RNA用于根据有关mda7的序列信息进行cDNA提取。
用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆PCR产物。在一台自动测序仪上(Applied Biosystems)从两末端对所得到的cDNA质粒进行测序。
从NK1.1+，CD4+活化小鼠胸腺细胞cDNA文库(A.Zlotnik，Dnax研究所，Kalo Alto，CA)中提取mIL-BKW的克隆。对该克隆进行的序列分析揭示了和hIL-BKW以及mIL-10和mIL-10相比的高度氨基酸序列相同性。具体地讲，高度地相同性存在于D-螺旋中的四种细胞因子之间，这意味着其参与受体结合。实施例2：哺乳动物IL-BKW的细胞表达
由于其序列和人IL-10的相似性，应当对细胞类型的分布进行研究。标记一种对编码灵长类IL-BKW的cDNA专一的探针，例如通过随机引物法进行标记。
IL-BKW/ak155在各种T-细胞组织和克隆中是高度转录的。
Southern分析：用合适的限制酶消化获自初始扩增的cDNA文库的DNA(5微克)，以释放出插入片段，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜(Schleicher和Schuell，Keene，NH)。
将多组织Northern印迹用于测定hIL-BKW mRNA的大小和组织分布。在所述大部分组织中检测到大小为1.0kb-4.4kb的多种mRNA转录物。根据所述印迹的杂交和洗涤条件的严格性，这些转录物最有可能代表的是另外的剪切mRNA’s，而不是不同族的成员。用癌细胞系(Clontech)进行的类似Northern印迹在结肠癌SW480中发现了有效杂交的2.2kbmRNA转录物，但该转录物不存在于任何其它的癌细胞系中。
通过CDNA文库Southern印迹杂交，分析了hIL-BKW在单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞、T、B、和NK细胞中的表达特征。用NotI和SalI消化5微克每一种cDNA文库，以便从pSpot载体上(Gibco-BRL)释放出cDNA插入片段，然后用hIL-BKW探针与之杂交。在T、B、和NK细胞中，hIL-BKW的表达被局限于活化Th0克隆(Mot72)和活化的Th1克隆(HY06)。hIL-BKW表达的最高水平出现于用LPS、IFN-γ和抗IL-10抗体活化的淘选单核细胞中。相反，当我们检测由用IL-10和不是抗IL-10处理的同一种单核细胞制备的文库时，发现了IL-BKW表达水平的急剧下降，这表明IL-BKW的表达是受IL-10的有效调节的。
提取供mIL-BKW分析用的mRNA的样品包括：静息小鼠成纤维L细胞系(c200)；Braf：ER(与雌激素受体融合的Braf)转染的细胞，对照(c201)；T细胞；TH1极化细胞(Mel14亮，源于脾的CD4+细胞，用IFN-γ和抗IL-4极化7天；T200)；T细胞；TH2极化(Mel14亮，源于脾的CD4+细胞，用IFN-γ和抗IL-4极化7天；T201)；T细胞，高度TH1极化细胞(参见Openshaw等)(1995实验医学杂志182：1357-1367；用抗CD3活化2、6、16小时，收集；T202)；T细胞，高度TH2极化细胞(参见Openshaw等)(1995实验医学杂志182：1357-1367；用抗CD3活化2、6、16小时，收集；T203)；CD44-CD25+前T细胞从胸腺中筛选的细胞(T204)；TH1 T细胞克隆1.L在用抗原做最后一次刺激之后静息3周(T205)；TH1 T细胞克隆1.1，10微克/m1 ConA刺激15小时(T206)；TH2 T细胞克隆CDC35，在用抗原做最后一次刺激之后静息3周(T207)；TH2 T细胞克隆CDC35，10微克/m1 ConA刺激15小时(T208)；Mel14+源于脾的天然T细胞静息(T209)；Mel14+T细胞用IFN-γ/IL-12/抗IL-4极化6、12、24小时成TH1，收集(T210)；Mel 14+T细胞用IL-4/抗-IFN-γ极化6、13、24小时成Th2，收集(T210)；未刺激过的B细胞白血病细胞系A20(B200)；未刺激过的B细胞系CH12(B201)；源于脾的未刺激过的大型B细胞(B202)；源于全脾LPS活化的B细胞(B203)；源于脾的三碘苯甲酰氨基葡萄糖树富集的树突状静息细胞，(D200)；源于骨髓的树突状静息细胞，(D201)；用LPS4h活化的单核细胞系LAW264.7(M200)；源于GM和M-CSF的骨髓巨噬细胞(M201)；巨噬细胞细胞系J774静息(M202)；在0.5、1、3、6、12小时时收集的巨噬细胞细胞系J774+LPS+抗-IL-10(M203)；在0.5、1、3、5、12小时时收集的巨噬细胞细胞系J774+LPS+抗-IL-10(M204)；气溶胶刺激的小鼠肺组织，Th2引导的，气溶胶OVA刺激期7、14、23小时收集的细胞(参见Garlisi等)(1995临床免疫学免疫病理学75：75-83；X206)；Nippostrongulus感染的肺组织(参见Coffman等)(1989科学245：308-310；X200)；全成体肺，正常(0200)；全肺，rag-1(参见Schwarz等)(1993免疫缺陷4：249-252；0205)；IL-10K.0.脾(参见Kuhn等)(1991细胞75：263-274；X201)全成体肺，正常(0201)；全脾，rag-1(0207)；IL-10K.O.淋巴集结(0202)；全淋巴集结，正常(0210)；IL-10K.O.隔膜淋巴节(X203)；全隔膜淋巴节，正常(0211)；IL-10K.O.结肠(X203)；全结肠，正常(0212)；NOD小鼠胰(参见Makino等(1980)Jikken Dodutsu29：1-13；X205；全胸腺，rag-1(0208)；全肾，rag-1(0209)；全心，rag-1(0202)；全脑，rag-1(0203)；全睾丸，rag-1(0204)；全肝，rag-1(0206)，大鼠正常关节组织(0300)，以及大鼠关节炎关节组织(X300)。
通过cDNASouthern分析揭示的表达是这样的：在T细胞，TH2极化(Mell4bright，源于脾的CD4+细胞、用IL-4和抗IFN-γ极化7天；T201)中非常高表达；在T细胞、高度TH2极化的(参见Openshaw等)(1995实验医学杂志182：1357-1367；用抗-CD3活化2、6、16小时，收集；T203)中高度表达；而在T细胞，TH1极化(Mel14亮，源于脾的CD4+细胞、用抗IFN-γ和IL-4极化7天；T200)；和Mel14+T细胞，用IL-4/抗IFN-γ极化6、13、24小时使其成Th2，收集(T211)中明显表达。实施例3：小鼠和人IL-BKW的染色体作图
用本领域众所周知的方法，把mIL-BKW基因作图在小鼠1号染色体上的位置。例如参见Copeland等(1993)科学262：57-66。mIL-10在1号染色体上位于接近mIL-BKW处。
为了对人的对应物进行作图，使用提取的编码IL-BKW的人IL-BKWcDNA。染色体作图是如上所述的标准技术，例如，参见BIOS实验室(New Haven，CT)和用小鼠体细胞杂交系列进行PCR的方法。所述人的基因被作图位于人1号染色体上，而且同样源于小鼠合成信息，位于lq32区。实施例4：纯化IL-BKW蛋白
对多个转染的细胞系进行筛选，以便寻找能比其它细胞更高水平表达细胞因子的细胞系。筛选了各种细胞系，并选择其在处理方面的有利特性。可以从天然来源中分离天然IL-BKW，或用一种合适的表达载体由转化的细胞表达。所表达蛋白的纯化是通过标准方法完成的，或者可以与工程方法相结合，以便以高效率地从细胞裂解液或上清液中有效的纯化。可将FLAG或His6片段用于所述纯化操作。另外，可将亲和层析用于特定抗体，参见下文。
蛋白是在大肠杆菌、昆虫细胞或哺乳动物表达系统中生产的。小鼠融合蛋白是以具有一个IGase裂解位点的IgG融合体形式在COP5细胞中生产的，这会产生分泌性产物，该产物的N-末端被抑制。微量测序分析表明，其实际N-末端是EF。用人是序列生产类似材料可得到一种N-末端AQG...。
在哺乳动物细胞中用标准构建体所产生的重组人IL-BKW的N末端似乎仅能以少量可溶形式存在于培养基中。有证据表明该蛋白与细胞表面蛋白聚糖紧密结合，而且难于溶解。用肝素处理可导致某些所述蛋白的释放。可将表面蛋白聚糖缺陷型细胞用于生产所述蛋白。实施例5：提取同源IL-BKW基因
可以用IL-BKW cDNA作为杂交探针筛选源于适当来源的文库，例如，灵长类细胞cDNA文库。可以用一种探针对多种不同的物种进行筛选，以筛选进行杂交所需的严格性，和存在。可以用适当的杂交条件选择具有对交叉杂交的专一性的克隆。
通过用基于所述肽序列的简并探针进行杂交筛选，还可以分离合适的克隆。另外，用合适的引物进行PCR筛选可以产生适当核酸克隆的富集。
可以用类似方法提取种的变体、多态变体、或等位变体。种的变体是用交叉-种杂交技术提取的，该技术基于从一个种中提取的全长提取物或片段作为探针。
另外，所制备的抗人IL-BKW的抗体可被用于筛选细胞，该细胞能由一种合适的诸如cDNA文库表达交叉反应蛋白。可以用上述标准方法使用纯化的蛋白或特定肽制备抗体。合成肽和纯化蛋白被呈递给免疫系统，以产生单克隆或多克隆抗体。例如参见Coligan(1991)现代免疫学方法Wiley/Greene；和Harlow和Lane(1989)抗体：实验室手册，冷泉港出版社。将所产生的抗体按所述方法用于筛选、纯化、或诊断。实施例6：制备对IL-BKW专一的抗体
将合成肽或纯化蛋白呈递给免疫系统以产生单克隆或多克隆抗体。例如参见Coligan(1991)现代免疫学方法Wiley/Greene；和Harlow和Lane(1989)抗体：实验室手册，冷泉港出版社。可以制备多克隆血清或杂交瘤。在适当条件下，可以按上述方法对所述结合试剂进行标记，例如用荧光标记，或者将其固定在一种用于淘选方法的基质上。
获得了多种单克隆抗体。对这些抗体进行了纯化；在这些纯化的抗体中有一半是IgG，而另一半是IgM。其中的大部分是良好的Western印迹试剂；其中的另外一些可以对表达于细胞表面上的重组hIL-BKW进行染色，而另一些适用于免疫组织化学。通过后一种方法在扁桃体切片中观察到的“阳性细胞”似乎呈巨噬细胞样。实施例7：IL-10调节的IL-BKW表达
为了直接通过Northern印迹分析研究IL-10的调节作用，由淘洗的IL-10、LPS和IFN-γ活化的单核细胞制备mRNA，用IL-10或抗-IL-10抗体处理。正如由cDNA文库的Southern印迹所证实的，在用抗-IL-10处理过的活化单核细胞中观察到了IL-BKW mRNA的有效诱导。而在相同条件下用IL-10处理这些细胞，几乎完全终止了IL-BKW信息的合成。实施例8：测定生物学功能的范围
根据IL-BKW和IL-10的序列和结构同源性，测定IL-BKW的生物学活性。首先，检查显示出IL-10的生物学活性的测定。其中包括对人外周血单核细胞、人单核细胞、和人T细胞克隆的测定。A.对人单核细胞细胞表面分子表达的影响。
通过负选择从正常健康供体的外周血单核细胞中纯化单核细胞。简单地讲，将3×108ficoll分层单核细胞放在冰上与单克隆抗体(Becton-Dickenson；Mountain View，CA)的混合物一起温育，所述单克隆抗体由200微升αCD2(Leu-5A)、200微升αCD3(Leu-4)、100微升αCD8(Leu-2a)、100微升αCD19(Leu-12)、100微升αCD20(Leu-16)、100微升αCD56(Leu-19)、100微升αCD67(10M67)(Immunotech，Westbrook，ME和抗血型糖蛋白抗体(10F7MN，ATCC，Rockville，MD)组成。洗涤抗体结合的细胞，所述细胞与耦联磁珠的单抗小鼠IgG温育，(Dynal，奥丝路，挪威)，磁珠与细胞的比例为20∶1。通过施加磁场将抗体结合的细胞同单核细胞分离。然后，在没有或有IL-BKW(1/100稀释的杆状病毒表达材料或1微克/毫升哺乳动物cop5表达材料)或IL-10(200U/ml)的条件下，在含有1％人AB血清的Yssel’s培养基(Gemini Bioproduvts Calabasas CA)中培养人单核细胞，培养是在聚丙烯96孔板(Costar)中进行40小时。另外，在有IFN-γ(100 U/ml)的条件下建立相同的培养物。
细胞表面分子表达的分析是通过直接免疫荧光进行的。简单地讲，在含有1％人血清的磷酸缓冲的盐溶液(PBS)中培养2×105纯化人单核细胞，在冰上温育20分钟。以200xg的速度使细胞沉淀。将细胞重新悬浮于20m1 PE或FITC标记的mAb中。在冰上再温育20分钟，然后在含有1％人血清的PBS中洗涤细胞，再单独用PBS洗涤两次。将细胞固定于含有1％受聚甲醛的PBS中，并在SACScan流式细胞仪(Becton Dickenson；Mountain View，CA)上分析，结果以平均荧光强度的形式表示在表3中。使用了以下mAbs：由Decton-Dickinson提供的CD11b(抗-mac1)，CD11c(agp150/95)，CD14(Leu-M3)，CD54(Leu-54)，CD80(抗-BB1/B7)，HLA-DR(L243)，和CD86(FUN1)(Pharmingen)，CD64(32.2)(Medarex)，CD40(mAb89)(Schering-Plough，法国)。
表3
IL-BKW对人单核细胞的细胞表面表型的作用
Exp1 CD11B CD14 CD54 CD80 CD86 HLA-DR CD40med- 261 976 159 16/33 395 1522 251IL-BKW 202 1850 195 39/69 217 495 249IFN- 307 365 262 93/87 277 3688 697IFN+IL-BKW 222 275 342 97/268 375 4157 1299
Exp2t＝0 668 1414 37 1 58 805 50med- 293 1455 239 41/32 202 3130 152IL-BKW 446 607 325 91/66 299 2190 123IFN- 513 557 605 96/88 227 5664 481IFN+IL-BKW 485 529 633 98/181 338 7318 702
IL-BKW可以增强CD54(ICAM-1)、CD80和CD86的表达，而它减弱HLA-DR的表达(参见表3)。IL-BKW可以通过IFN-γ进一步增强CD40、CD54、CD80和CD86的上调。在有IFN-γ的条件下，IL-BKW可以增强HLA-DR的表达。单独使用IL-BKW时，其对CD11b、CD11C、和CD14的表达的作用是可变的，而在和IFN-γ组合时，与单独使用IFN-γ相比它可以减弱细胞表面表达。由于IL-10在有或没有IFN-γ的条件下都能下调CD54、CD80、CD86和HLA-DR，这些结果表明，IL-20与IL-10相比具有不同的对在单核细胞上进行的细胞表面分子表达的作用。B.IL-BKW对人单核细胞产生细胞因子的影响。
按上述方法提取人单核细胞，并在没有或有IL-BKW(1/100稀释的杆状病毒表达材料)的条件下，在含有1％人AB血清的Yssel’s培养基(Gemini Bioproduvts Calabasas CA)中培养。另外，在没有或有IL-BKW的条件下用所标出量的LPS刺激单核细胞(大肠杆菌0127：B8Difco)24小时，并通过ELISA测定细胞培养上清液中的细胞因子(IL-1b，IL-6，TNF α，GM-CSF和IL-10)的浓度。为了对细胞因子进行细胞质内染色，在没有或有IL-BKW(1/100稀释的杆状病毒表达材料或1微克/毫升哺乳动物cop5表达材料)和/或5毫克/毫升LPS(大肠杆菌0127：B8Difco)和10毫克/毫升BrefeldinA(Epicentre technologies Madison WI)的条件下在Yssel’s培养基中培养单核细胞(1百万/毫升)12小时。在PBS中洗涤细胞，并在室温下在2％甲醛/PBS溶液中培养20分钟。随后洗涤细胞，重新悬浮于透化缓冲液(0.5％皂苷)(Sigma)，溶于PBS/BSA(0.5％/叠化物(1mM)中，并在室温下温育20分钟。对细胞(2×105进行离心，并重新悬浮于20毫升直接缀合的抗细胞因子mAbs中，以1∶10的比例稀释于透化缓冲液中，在室温下温育20分钟。使用了以下抗体：IL-1αPE(364-3B3-14)；：IL-6-PE(MQ-13A5)；TNFα-PE(MAb11)；GM-CSF-PE(BVD2-21C11)；和IL-12-PE(C11.5.14)(PharmingenSan Diego，C)。接着，在透化缓冲液中洗涤细胞二次，在PBS/BSA/叠管化物中洗涤一次，并在FACScan流式细胞仪(Becton Dickenson；Mountain View，CA)上进行分析。结果以阳性细胞百分比和阳性群落的平均荧光强度的形式表达于表4中。
表4
IL-BKW对人单核细胞产生细胞因子的影响
(百分比细胞内/染色/平均荧光强度) IL-1 IL-6 TNF
培养基 5 5 4 IL-BKW(1/100) 79/300 67/182 44/627 LPS(5μg/ml) 67/456 78/404 78/1524
LPS+IL-BKW 77/613 75/458 77/1573
IL-1 IL-6 TNF
培养基 9/58 39/65 7/159IL-BKW(1μg/ml) 57/93 93/575 70/547 LPS(5μg/ml) 77/174 94/716 79/498
LPS+IL-BKW 79/172 96/1106 81/725
IL-BKW可以诱导人单核细胞表达IL-6、IFN-α、IL-10、IL-1b和GM-CSF(表5)。LPS也能以依赖于剂量的形式诱导所述细胞因子的表达。与单独使用LPS或IL-BKW相比，和LPS结合添加IL-BKW增强IL-6、TNFα、IL-10、IL-1b和GM-CSF的产生。
表5
IL-BKW对人单核细胞产生细胞因子的影响
IL-1b IL-6 TNF IL-10 GM-CSF培养基 0 2.229 0 0.007 0LPS(ng/ml) 0.321 29 4.735 0.867 0.828
1000
100 0 36.78 4.683 1.417 0.371
10 0 37.06 2.156 1.216 0.080
1 0 36.22 0.806 0.918 0IL-BKW 1.460 27.9 1.808 0.391 0.673(1/100)
+LPS 4.637 93.02 12.09 2.332 2.048
1000
100 3.921 82.56 9.843 3.994 1.309
10 4.024 142.2 5.708 3.096 1.466
1 2.744 85.66 4.006 2.58 0.852(结果以ng/ml为单位表示)
当通过细胞质内染色测定细胞因子的表达时，获得了类似的结果。IL-BKW可诱导IL-1、IL-6和TNFα的表达，IL-BKW可以诱导人单核细胞表达IL-1、IL-6和TNFα，其表现为阳性细胞和荧光强度百分比的提高，这种提高反应了每个细胞所产生的细胞因子量。LPS可诱导IL-1、IL-6和TNFα的表达；而向所述培养物中添加IL-BKW还可以进一步提高其产量。在杆状病毒和哺乳动物表达材料中都观察到了这种提高的产量。参见表4。C.IL-BKW对人外周血单核细胞(PBMC)产生细胞因子的影响
用公开的方法(Boyum等)以通过ficoll-hypaque离心的方式从正常健康供体的血沉棕黄色素中分离全PBMC，并在没有或有IL-BKW(1/100稀释的杆状病毒表达材料)的条件下，在含有1％人AB血清的Yssel’s培养基(Gemini Bioproducts Calabasas CA)中培养。以2×106细胞/ml的浓度在培养基中培养细胞或用PHA(100ng/ml)或IL-2(100u/ml)(R&D系统)活化。例外，单独用IL-10(100U/ml)或IL-BKW(1/100稀释的杆状病毒表达材料)联合IL-10培养PBMC。通过细胞因子特异的ELISA，在72小时收获的上清液中测定细胞因子分泌。
IL-BKW可以诱导PBMC表达IL-6、TNFα、IL-10和IFN-γ(参见表6)。另外，IL-BKW可提高IL-6、TNFα、IL-10和IFN-γ的产量，如果PBMC是由PHA或IL-2活化的话。在用IL-BKW、PHA、IL-2或IL-BKW与PHA或IL-2的组合物活化以后，IL-10能抑制IL-6、TNFα和IFN-γ的产生。
表6
IL-BKW对PBMC产生细胞因子的影响PBMC IL-6 TNFα IL-10 IFN-γ培养基 0.243 0 0.007 0IL-10(100U/ml) 0.196 0 NT 0IL-BKW(1/100) 24.23 0.029 1.295 0.004IL-10+IL-BKW 0.339 0 NT 0PHA(100ng/ml) 5.491 0.652 0.637 1.05IL-10 0.279 0 NT 0.004IL-BKW 67.06 3.31 4.556 5.742IL-10+IL-BKW 1.129 0 NT 0.1IL-2(100U/ml) 41.4 0.216 3.224 0.895IL-10 0.89 0 NT 0.01IL-BKW 62.34 0.621 10.04 1.507IL-10+IL-BKW 3.456 0 NT 0.081结果以ng/ml为单位表示，NT：未测定D.IL-BKW对人外周血单核细胞(PBMC)的影响
用公开的方法(Boyum等)，通过ficoll-hypaque离心的方式，从正常健康供体的血沉棕黄色素中分离全PBMC。并在没有或有标明量的IL-BKW(哺乳动物cop5表达材料)的条件下，在200ml含有1％人AB血清的Yssel’s培养基(Gemini Bioproduts Calabasas CA)中培养PBMC，培养是在96孔板(Falcon，Bccton-Dickinson)中进行的。单用培养基培养细胞或与100U/ml IL-2(R&D系统)组合培养，培养进行120分钟。在培养阶段的最后6小时加入3H-胸苷(0.1mCi)，并通过液体闪烁计数测定3H-胸苷的掺入。结果以三次培养的平均cpm形式表示。
IL-BKW可以剂量依赖形式诱导PBMC的低水平增殖。参见表7。另外，IL-BKW还可以剂量依赖形式增强IL-2对PBMC的增殖响应。
表7
IL-BKW对PBMC增殖的影响IL-BKW平均值 S.D. +IL-2 平均值 S.D.(ng/ml) (100u/ml) 1000 5894 2655 43426 12858
333 6430 1877 48187 2470
111 3510 1384 36435 5058
37 1016 331 24859 6014
12 235 60 22738 3379
4 190 75 23323 4266
1.3 175 49 22528 2979
0 100 4 17961 3839结果以cpm+/-标准误形式表示
还要在、D细胞、NK、巨噬细胞、树突状细胞、造血祖细胞的很多其它生物学测定系统中测试天然、重组、和融合蛋白的激动剂或拮抗剂活性。由于IL-10的结构相关性，要对与IL-10活性相关的测定进行分析。
测定IL-BKW对能表达IL-10受体的转染细胞和对照的激动剂或拮抗剂活性。例如，参见Ho等(1993)美国国家科学院院报90，11267-11271；Ho等(1995)分子细胞生物学15：5043-5053；和Liu等(1994)免疫学杂志152：1821-1829。
部分基于和IL-10的结构同源性，在要测定IL-BKW在巨噬细胞/树突状细胞细胞活化和抗原呈递测定中的作用，在受到抗原或同种异型刺激时T细胞细胞因子产生和增殖方面的作用。例如，参见de WaalMalefyt等(1991)实验医学杂志174：1209-1220；de Waal Malefyt等(1991)实验医学杂志174：915-924；Fiorentino等(1991)免疫学杂志147：3815-3822；Fiorentino等(1991)免疫学杂志144：3444-3451；和Groux等(1996)实验医学杂志184：19-29。
还要测定IL-BKW对NK细胞刺激的影响。测定可以基于下述文献，例如，Hsu等(1992)国际免疫学4：563-569和Schwarz等(1994)免疫治疗杂志16：95-104。
对B细胞生长和分化的影响进行分析，例如，通过披露于以下文献中的方法进行分析，例如参见Defrance等(1992)实验医学杂志175：671-682；Rousset等(1992)美国国家科学院院报89：1890-1893；包括IgG2和IgA2开关因子测定。注意，与COS7上清液不同，NIH3 T3和COP上清液明显不会影响人B细胞测定。
本文所引用的所有参考文献均以相同的程度收作本发明的参考文献，就如同每一件出版物或专利申请被特别地和单独地以总体形式指定为收作参考文献一样。
对本领域技术人员来说，显而易见的是可以在不超出本发明构思和范围的前提下对其进行改进和改变。本文所披露的特定实施方案仅仅是以举例的形式提出的，本发明仅由所述权利要求限定其范围，同时包括等同于所述权利要求的所有范围。
序列表(1)一般资料： (i)申请人：Schering公司 (ii)发明名称：哺乳动物细胞因子；相关试剂 (iii)序列数：7 iv)相关地址：
(A)收件人：Schering-Plough公司
(B)街道：2000Galloping Hill路
(C)城市：肯尼沃斯
(D)州：新泽西
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(F)邮编：07033(v)计算机可读形式：
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(A)姓名：FOULKE，CYNTHIA L.
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Met Asn Phe Gln Gln Arg
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-40 -35 -30GCG ACA GCC TCT CAA ATG CAG ATG GTT GTG CTC CCT TGC CTG GGT TTT 388Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met Val Val Leu Pro Cys Leu Gly Phe
-25 -20 -15ACC CTG CTT CTC TGG AGC CAG GTA TCA GGG GCC CAG GGC CAA GAA TTC 436Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe-10 -5 1 5CAC TTT GGG CCC TGC CAA GTG AAG GGG GTT GTT CCC CAG AAA CTG TGG 484His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val Val Pro Gln Lys Leu Trp
10 15 20GAA GCC TTC TGG GCT GTG AAA GAC ACT ATG CAA GCT CAG GAT AAC ATC 532Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile
25 30 35ACG AGT GCC CGG CTG CTG CAG CAG GAG GTT CTG CAG AAC GTC TCG GAT 580Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val Leu Gln Asn Val Ser Asp
40 45 50GCT GAG AGC TGT TAC CTT GTC CAC ACC CTG CTG GAG TTC TAC TTG AAA 628Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys 55 60 65 70ACT GTT TTC AAA AAC TAC CAC AAT AGA ACA GTT GAA GTC AGG ACT CTG 676Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Ash Arg Thr Val Glu Val Arg Thr Leu
75 80 85AAG TCA TTC TCT ACT CTG GCC AAC AAC TTT GTT CTC ATC GTG TCA CAA 724Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile Val Ser Gln
90 95 100CTG CAA CCC AGT CAA GAA AAT GAG ATG TTT TCC ATC AGA GAC AGT GCA 772Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala
105 110 115CAC AGG CGG TTT CTG CTA TTC CGG AGA GCA TTC AAA CAG TTG GAC GTA 820His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val
120 125 130GAA GCA GCT CTG ACC AAA GCC CTT GGG GAA GTG GAC ATT CTT CTG ACC 868Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr135 140 145 150TGG ATG CAG AAA TTC TAC AAG CTC TGAATGTCTA GACCAGGACC TCCCTCCCCC 922Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu
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35 40 45Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu
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Met Ser Trp Gly Leu Gln Ile Leu Pro Cys Leu Ser
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115 120 125Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Ser
130 135 140Asp Phe Asn Lys Leu Gln Asp Gln Gly Val Tyr Lys Ala Met Asn Glu145 150 155 160Phe Asp Ile Phe Ile Asn Cys Ile Glu Ala Tyr Met Met Ile Lys Met
165 170 175Lys Ser