一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法.pdf

本发明公开了一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法，包括如下步骤：(1)在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节pH＝5.8-6.0，配置成液体培养基；(2)将液体培养基装入5L的鼓泡式生物反应器中灭菌；(3)将灭菌后的甘草不定根切成0.5～1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在23±2℃、通气量为0.4～0.6vvm及自然光照条件下培养至30-34天，向液体培养基中加入无菌的浓度为1mg/ml水杨酸乙醇溶液，使水杨酸在液体培养基中的终浓度为1～5mg/L，继续培养，共培养40天，收获。本发明的方法具有操作简单，能显著提高甘草不定根中黄酮化合物含量，生长周期短，生产成本低，便于甘草黄酮的工业化大规模生产。

权利要求书1.  一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法，其特征是包括如下步骤： (1)在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节 pH＝5.8-6.0，配置成液体培养基； (2)将液体培养基装入5L的鼓泡式生物反应器中灭菌； (3)将灭菌后的甘草不定根切成0.5～1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在23±2 ℃、通气量为0.4～0.6vvm及自然光照条件下培养至30-34天，向液体培养基中加入无 菌的浓度为1mg/ml水杨酸乙醇溶液，使水杨酸在液体培养基中的终浓度为1～5mg/L， 继续培养，共培养40天，收获。 2.  根据权利要求1所述的一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法，其特征是所述 步骤(2)为：将液体培养基装入5L的鼓泡式生物反应器中在121℃，0.1MP压力下灭菌 25分钟。

说明书一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法
技术领域
本发明涉及一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的方法，属于中药甘草组织培养领域。
背景技术
黄酮是药用植物甘草的主要药效成分，黄酮类成分具有多种生物活性，除消炎、抗菌、 抗诱变、保肝等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、防肿瘤等方面也有明显的作用。甘草黄酮 类物质能通过消除自由基或淬灭超氧自由基，终止自由基的连锁反应从而达到抗氧化的作用。 甘草黄酮能有效抑制黑色素生成过程中多种酶的活性，美白祛斑效果显著。同时具有防止皮 肤粗糙、抗炎和抗菌的效果，是目前疗效好，功能全面的美白剂。甘草黄酮在食品工业中是 理想的抗氧化剂和防腐剂，是化学防腐剂的优良替代品。
目前，诱导子在促进植物次生代谢产物方面有许多进展。近年来，由于甘草黄酮药理作 用被广泛重视，对甘草的需求量大增，甘草野生资源破坏严重。而甘草黄酮来源十分有限， 且在天然植物中含量低、生长周期长，同时农药喷施等原因导致原料药供应难以满足市场的 需求。因此提高甘草黄酮化合物含量，进行工业化大规模生产，需要在技术上进行创新。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的甘草不定根组培方法中黄酮化合物含量较低的不 足，提供一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法，包括如下步骤：
(1)在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节 pH＝5.8-6.0，配置成液体培养基；
(2)将液体培养基装入5L的鼓泡式生物反应器中灭菌；
(3)将灭菌后的甘草不定根切成0.5～1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在23±2 ℃、通气量为0.4～0.6vvm及自然光照条件下培养至30-34天，向液体培养基中加入经0.22 μm滤膜过滤的无菌的浓度为1mg/ml水杨酸乙醇溶液，使水杨酸在液体培养基中的终浓度为 1～5mg/L，继续培养，共培养40天，收获。
步骤(2)优选为：将液体培养基装入5L的鼓泡式生物反应器中在121℃，0.1MP压力 下灭菌25分钟。
本发明的优点：
本发明的方法具有操作简单，能显著提高甘草不定根中黄酮化合物含量，生长周期短， 生产成本低，便于甘草黄酮的工业化大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法，包括如下步骤：
(1)在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节 pH＝5.9，配置成液体培养基；
(2)将液体培养基装入5L的鼓泡式生物反应器中在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟；
(3)将灭菌后的甘草不定根切成0.5～1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在23±2 ℃、通气量为0.4～0.6vvm及自然光照条件下培养至32天，向液体培养基中加入经0.22μm 滤膜过滤的无菌的浓度为1mg/ml水杨酸乙醇溶液，使水杨酸在液体培养基中的终浓度为 2mg/L，继续培养，共培养40天，收获。
实施例2
一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法，包括如下步骤：
(1)在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节 pH＝5.8，配置成液体培养基；
(2)将液体培养基装入5L的鼓泡式生物反应器中在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟；
(3)将灭菌后的甘草不定根切成0.5～1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在23±2 ℃、通气量为0.4～0.6vvm及自然光照条件下培养至30天，向液体培养基中加入经0.22μm 滤膜过滤的无菌的浓度为1mg/ml水杨酸乙醇溶液，使水杨酸在液体培养基中的终浓度为 1mg/L，继续培养，共培养40天，收获。
实施例3
一种提高甘草不定根中黄酮化合物含量的组培方法，包括如下步骤：
(1)在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节 pH＝6.0，配置成液体培养基；
(2)将液体培养基装入5L的鼓泡式生物反应器中在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟；
(3)将灭菌后的甘草不定根切成0.5～1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在23±2 ℃、通气量为0.4～0.6vvm及自然光照条件下培养至34天，向液体培养基中加入经0.22μm 滤膜过滤的无菌的浓度为1mg/ml水杨酸乙醇溶液，使水杨酸在液体培养基中的终浓度为 5mg/L，继续培养，共培养40天，收获。
实施例4
甘草不定根的组培方法(对照组)，包括如下步骤：
(1)在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节 pH＝6.0，配置成液体培养基；
(2)将液体培养基装入5L的鼓泡式生物反应器中在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟；
(3)将灭菌后的甘草不定根切成0.5～1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在23±2 ℃、通气量为0.4～0.6vvm及自然光照条件下培养40天，收获。
表1 MS培养基配方表
化合物 终浓度(mg/L) 硝酸铵(NH4NO3) 1650 硝酸钾(KNO3) 1900 磷酸二氢钾(KH2PO4) 170 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 370 氯化钙(CaCl2·2H2O) 440 钼酸钠(NaMoO4·2H2O) 0.25 硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.025 氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.025 碘化钾(KI) 0.83 硫酸猛(MnSO4·4H2O) 22.3 硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 8.6 硼酸(H3BO3) 6.2 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 27.8 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 37.3 甘氨酸 2 盐酸硫胺素 0.4 盐酸吡哆素 0.5 烟酸 0.5 肌醇 100 蔗糖 20000-50000 琼脂 7000-10000 pH 5.8-6.0
实施例5
本发明获得的甘草不定根中黄酮化合物含量的测定：方法引用“尹双双.太子参、杠柳和 甘草不定根培养的研究.[硕士毕业论文]天津：天津大学，2013.第42页 实验表明，实施例1-4测定的甘草总黄酮含量依次为9.40mg/g、5.48mg/g、4.93mg/g、3.51 mg/g。